車前子對(duì)腹瀉大鼠炎性因子和結(jié)腸組織AQP8蛋白表達(dá)的影響

彪雅寧，張納博，張睦清，郭秋紅，王 月，韓 雪，張一昕*

1河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 河北省高校中藥組方制劑應(yīng)用技術(shù)研究中心，石家莊 050200；2河北省中醫(yī)院心內(nèi)科，石家莊 050011

腹瀉是臨床常見的由多種因素所導(dǎo)致的腸道水液代謝紊亂的一種疾病，其臨床表現(xiàn)多樣，以大便次數(shù)頻多、糞質(zhì)稀薄或呈水樣為主要特征，若病情急重或遷延不愈可導(dǎo)致脫水、電解質(zhì)紊亂、酸堿失衡、影響生長(zhǎng)發(fā)育，甚至危及患者生命[1,2]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，泄瀉的主要病因是濕，故通利小便，排泄水濕為常用治法。車前子(PlantagoasiaticaL.)為車前科植物車前PlantagoasiaticaL.或平車前PlantagodepressaWilld.的干燥成熟種子，具有利尿通淋，滲濕止瀉，明目，祛痰功效，其入小腸經(jīng)，善能通水道而分清濁，利小便以實(shí)大便，藥理研究也表明其具有止瀉之功，臨床單味或隨證配用治療腹瀉效果顯著[3,4]，但其止瀉的作用機(jī)制尚不明確。

結(jié)腸具有吸收水分、電解質(zhì)、濃縮食物殘?jiān)⑿纬杉S便等功能。研究發(fā)現(xiàn)，水通道蛋白(aquaporins，AQPs)廣泛分布在腸道上皮和內(nèi)皮組織細(xì)胞膜上，是負(fù)責(zé)跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的主要蛋白，炎癥反應(yīng)是腹瀉發(fā)生發(fā)展的病理生理基礎(chǔ)，若因炎癥反應(yīng)等因素導(dǎo)致腸道AQPs的表達(dá)異常，使腸道對(duì)水液的吸收減少，水分大量在腸道蓄積，便會(huì)導(dǎo)致腹瀉的發(fā)生[5,6]，因此AQPs的功能狀態(tài)與腹瀉的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸具有非常密切的關(guān)系[7-9]。本實(shí)驗(yàn)采用番瀉葉灌胃法復(fù)制腹瀉大鼠模型，通過觀察其對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠血清中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和 C反應(yīng)蛋白(CRP)含量和結(jié)腸組織中AQP8蛋白表達(dá)的影響，探討車前子止瀉的可能作用途徑和作用機(jī)理。

1 材料

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠60只，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量160～180 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(冀)2013-1-003。飼養(yǎng)于18～22 ℃明暗各12小時(shí)的實(shí)驗(yàn)室，自由進(jìn)食水。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，編號(hào)為：DWLL2018005。

1.2 藥物

車前子配方顆粒(批號(hào)：8122593，當(dāng)量比為15∶1)購于四川新綠色藥業(yè)有限公司，由生產(chǎn)廠家將車前子飲片按照成熟的工藝，采用水煎全成分提取、濃縮、干燥、干法制粒而成。實(shí)驗(yàn)時(shí)將其加入到100 ℃適量的蒸餾水中，加熱充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙?，配至所需濃度。氫氯噻嗪?山東仁和堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：180922)，實(shí)驗(yàn)時(shí)以0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液配成所需濃度的混懸液。番瀉葉購于石家莊同仁堂藥房，稱取200 g番瀉葉浸入1 000 mL 100 ℃純凈水中，充分?jǐn)嚢?，浸漬30 min后用四層紗布過濾，濾液蒸發(fā)濃縮至600 mL，制成番瀉葉藥液(含生藥0.3 g/mL)，置4 ℃冰箱中冷藏備用。

1.3 試劑

TNF-α、IL-6試劑盒(上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)分別為SXR032，SXR063)；CRP 試劑盒(北京普爾偉業(yè)科技有限公司，批號(hào)：20170926)；AQP8一抗(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，批號(hào)PA5-77713)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為K176716J、K182410E)，蘇木素-伊紅(HE)染色液(河北博海生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為20180526，20180618)，Trizol(美國(guó)Invitrogen生命技術(shù)有限公司，批號(hào)：139603)，TIANScript RT KIT、SuperReal PreMix Plus(中國(guó)北京天根生化科技有限公司批號(hào)分別為KR104-02、FP205)。

1.4 儀器

ELx800型酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-TEK公司)；1-15K型高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；HMIAS-2000型顯微圖像分析系統(tǒng)(武漢千屏影像技術(shù)有限公司)；15D(P)型電泳儀及28D型電泳槽(北京六一生物科技有限公司)；UVP 凝膠成像系統(tǒng)(中國(guó)Thermo公司)；AE-6687半干轉(zhuǎn)膜儀系統(tǒng)(日本ATTO公司)；RM2016型切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)。

2 方法

2.1 分組造模及給藥

將60只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、模型組、氫氯噻嗪組和車前子低、中、高劑量組，每組10只。除正常組外，其余各組均于上午9∶00灌胃番瀉葉藥液復(fù)制大鼠腹瀉模型，正常組灌胃等量蒸餾水；下午3∶00各治療組灌服相應(yīng)藥物，正常組和模型組灌服等量蒸餾水。參照文獻(xiàn)[10]確定番瀉葉給藥劑量為20 mL/kg，各組給藥劑量按照人與大鼠體表面積系數(shù)進(jìn)行換算，其中車前子低、中、高劑量組的大鼠用藥劑量分別為：0.95、1.9、3.8 g/kg，氫氯噻嗪組大鼠的用藥劑量為9 mg/kg，給藥體積均為10 mL/kg，連續(xù)用藥14天。每隔3天稱量1次體質(zhì)量，大鼠自由飲水進(jìn)食，給藥期間觀察大鼠糞便情況。

2.2 標(biāo)本采集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后以3.5%水合氯醛(10 mL/kg)采用腹腔注射方法將大鼠麻醉，腹主動(dòng)脈取血，置潔凈試管中，3 500 rpm，離心15 min，分離血清，檢測(cè)相關(guān)炎性因子含量。取血后迅即剖取固定位置的適宜長(zhǎng)短的結(jié)腸組織2份，剖開，生理鹽水洗凈，一份固定于4%多聚甲醛液，有待HE染色法觀察結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)及免疫組化法觀察AQP8蛋白表達(dá)；另1份置于凍存管中液氮保存，以備Western blot法觀察結(jié)腸組織AQP8蛋白的表達(dá)。

2.3 檢測(cè)(觀察)指標(biāo)

2.3.1 各組大鼠糞便變化及一般情況

實(shí)驗(yàn)開始后，每天觀察實(shí)驗(yàn)大鼠的進(jìn)食量、毛發(fā)色澤、活動(dòng)狀態(tài)，特別是糞便質(zhì)地等情況。

2.3.2 各組大鼠血清炎性因子含量變化

采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法檢測(cè)血清中TNF-α和IL-6的含量，放免法檢測(cè)CRP的含量，以上嚴(yán)格按試劑盒說明書要求操作。

2.3.3 HE染色法觀察結(jié)腸黏膜病理形態(tài)學(xué)變化

取4%多聚甲醛溶液固定的結(jié)腸組織，常規(guī)脫水、包埋、切片、HE 染色，顯微鏡下觀察。

2.3.4 免疫組化法檢測(cè)結(jié)腸組織中AQP8的蛋白表達(dá)情況

將4%多聚甲醛溶液固定的結(jié)腸組織，脫水、包埋、切片，滴加3%甲醇雙氧水，室溫處理20 min，自來水沖洗；切片高壓修復(fù)后放入PBS中，滴加一抗，4 ℃過夜，次日取出待切片恢復(fù)至室溫后，PBS清洗5 min×3；滴加二抗，37 ℃避光20 min后，PBS清洗5 min×3；滴加DAB顯色劑，顯色5 s后，水洗終止顯色；蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡觀察。根據(jù)陽性反映的圖像灰度選擇合適的灰度分割閾值并予以雙閾值分割，獲得標(biāo)本的半灰度目標(biāo)圖像，測(cè)定陽性免疫染色的強(qiáng)度和面積，每組選取6例，分別測(cè)5個(gè)視野，計(jì)算測(cè)得的陽性反應(yīng)相對(duì)含量的灰度值和面積，由平均吸光度值表示。

2.3.5 Western blot法檢測(cè)結(jié)腸組織中AQP8的蛋白表達(dá)

稱取約100 mg的結(jié)腸組織，液氮研磨，轉(zhuǎn)移到含有1 mmol/L PMSF的900 μL RIPA中性裂解液中，混勻，超聲裂解，配平后4 ℃，12000 rpm離心15 min，收集上清液，測(cè)定蛋白含量。蛋白煮沸變性以后，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉，一抗4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次，洗凈未結(jié)合的一抗。將洗滌后的一抗反應(yīng)膜放入二抗工作液中，室溫孵育1.5 h，PBST洗膜3次，洗去游離二抗。暗室曝光，X膠片上顯影，用Tanon Gis軟件掃描各條帶的吸光度值并分析結(jié)果。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠糞便變化情況

除正常組以外，其余大鼠灌飼番瀉葉藥液2天以后，排出夾雜黏液的水樣稀便，腹瀉發(fā)生率為100%，同時(shí)大鼠出現(xiàn)不同程度的食欲減少，精神差，活動(dòng)減少，毛發(fā)干枯失去光澤，肛周體毛被稀便沾染。給藥治療4天后，各用藥組大鼠糞便逐漸成形，含水量降低，但車前子各劑量組與正常組相比，大便仍偏于濕軟。

3.2 各組大鼠結(jié)腸黏膜病理形態(tài)學(xué)變化

正常組大鼠結(jié)腸黏膜上皮較完整，細(xì)胞排列規(guī)整，未見腸黏膜表皮細(xì)胞壞死脫落，固有層腺體亦無萎縮，黏膜下層未見明顯改變；模型組大鼠結(jié)腸黏膜表皮細(xì)胞出現(xiàn)凋亡壞死，固有層毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；氫氯噻嗪組大鼠結(jié)腸表皮細(xì)胞少量凋亡壞死，上皮細(xì)胞核大小排列及染色與正常組一致，固有層毛細(xì)血管擴(kuò)張輕微充血，少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；車前子低、中劑量組結(jié)腸黏膜表皮細(xì)胞少量凋亡壞死，上皮細(xì)胞增生活躍，核大，深染，排列密集，少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，低劑量組毛細(xì)血管充血現(xiàn)象明顯；車前子高劑量組大鼠結(jié)腸黏膜表皮細(xì)胞偶見凋亡與壞死，上皮細(xì)胞增生減輕，偶見核分裂，固有層充血以及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)均緩解(見圖1)。

圖1 車前子對(duì)各組大鼠結(jié)腸黏膜病理形態(tài)學(xué)的影響(HE，×200)

3.3 各組大鼠血清中炎性因子含量變化

模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6和CRP的含量與正常組比較均明顯增加(P<0.05或P<0.01)；車前子各劑量組血清中TNF-α和CRP的含量與模型組比較，均顯著減少(P<0.05或P<0.01)，中、高劑量組IL-6含量有下降趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

表1 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6和CRP 含量的比較

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，△P<0.05，△△P<0.01。

Note:Compared with control,*P<0.05，**P<0.01;compared with model,△P<0.05,△△P<0.01.

3.4 各組大鼠結(jié)腸組織中AQP8蛋白表達(dá)水平變化情況

Western blot法檢測(cè)結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠AQP8蛋白的表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；與模型組比，車前子各劑量組AQP8蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)(見表2，圖2)。

續(xù)表2(Continued Tab.2)

組別Group劑量Does(g/kg)平均吸光度AQP8蛋白AQP8protein氫氯噻嗪組Hydrochlorothiazide0.0090.068±0.037△0.71±0.06△低劑量組Lowdose0.950.059±0.029△0.64±0.09△中劑量組Middledose1.90.075±0.032△0.82±0.05△△高劑量組Highdose3.80.097±0.043△△0.97±0.08△△

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，△P<0.05，△△P<0.01。

Note:Compared with control,*P<0.05，**P<0.01;Compared with model,△P<0.05,△△P<0.01.

免疫組化結(jié)果顯示：AQP8免疫陽性表達(dá)產(chǎn)物為棕黃色顆粒，主要表達(dá)在結(jié)腸黏膜間質(zhì)中，少量表達(dá)在上皮細(xì)胞。與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中AQP8的陽性表達(dá)染色明顯變淺，各治療組大鼠結(jié)腸組織中AQP8的陽性表達(dá)較模型組明顯增多、染色加重。經(jīng)軟件分析，結(jié)果表明：模型組的平均吸光度值較正常組顯著降低(P<0.01)，各用藥組平均吸光度值較模型組明顯升高(P<0.05或P<0.01)(見表2、圖3)。

圖2 各組大鼠AQP8蛋白表達(dá)情況(Western blot法)

圖3 各組大鼠結(jié)腸組織AQP8表達(dá)(免疫組織化學(xué)法，×200)

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為腹瀉是由于飲食所傷、感受寒濕、情志失和等多種原因?qū)е缕⑦\(yùn)失常，濕困中焦，濕濁下注于腸所致，“濕邪”為病因的關(guān)鍵，《素問·六元正紀(jì)大論》曰：“濕勝則濡泄”，《醫(yī)宗必讀》更是明確提出“無濕不成瀉”的理論。故臨床治療以祛濕為第一要?jiǎng)?wù)，而小便為水濕排泄的主要出路，因而通利小便乃為重要治法。正如《景岳全書·泄瀉》所說：“凡泄瀉之病，多由水谷不分，故以利水為上策”。車前子功善滲濕利水，泌別清濁，堪稱止瀉的妙品，為古今醫(yī)家首選的利濕止瀉藥。

番瀉葉是腹瀉模型中常用的導(dǎo)瀉劑，番瀉葉可刺激腸道，損傷腸黏膜，活化巨噬細(xì)胞及T細(xì)胞，引起炎癥介質(zhì)TNF-α的合成和釋放[10-12]，TNF-α可促進(jìn)炎性因子(如IL-1、IL-6等)分泌，損傷腸黏膜，致其水腫、充血并加重炎性反應(yīng)[13]。IL-6還可促進(jìn)CRP釋放，CRP 是急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，為炎癥反應(yīng)評(píng)價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)，在診斷損傷、感染等非特異性炎癥反應(yīng)方面有極高的價(jià)值[14,15]。Wang[15]在雙歧桿菌三聯(lián)活菌散治療感染性腹瀉臨床觀察中發(fā)現(xiàn)患者治療后血清中TNF-α、CRP和IL-6的水平均下降；張林美發(fā)現(xiàn)急性、遷延慢性腹瀉患兒血清中IL-2、IL-6水平均升高[16]。由此可見，炎性因子促進(jìn)的腸道炎癥反應(yīng)與腹瀉的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系。

對(duì)于腹瀉的癥狀而言，結(jié)腸腸腔內(nèi)液體量增多、腸道蠕動(dòng)加快可導(dǎo)致該病的發(fā)生[17]。結(jié)腸是腸道吸收水分的重要場(chǎng)所，但結(jié)腸的上皮細(xì)胞排列緊密，對(duì)細(xì)胞旁路這個(gè)吸收的途徑有所限制。因此，跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)就成為其對(duì)水分吸收重要方式，在糞便的脫水成形中起到重要作用[18,19]。AQPs是負(fù)責(zé)跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的主要蛋白，對(duì)維持體內(nèi)水液代謝起著重要作用。原位分子雜交技術(shù)結(jié)果顯示AQP8在空腸、近端結(jié)腸、十二指腸均高表達(dá)，在胃和遠(yuǎn)端結(jié)腸微量表達(dá)[7]。杜麗東用當(dāng)歸治療血虛便秘型大鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)模型組中大鼠結(jié)腸AQP8基因和蛋白表達(dá)水平均高于正常組，表明AQP8的表達(dá)增多可促進(jìn)結(jié)腸對(duì)水分的吸收，導(dǎo)致便秘[20]；楊鏞證實(shí)腹瀉大鼠模型在治療后，結(jié)腸中AQP8mRNA和蛋白表達(dá)均有所升高[17]。AQPs的表達(dá)水平受炎性細(xì)胞因子和其他多種因素的調(diào)節(jié)，有研究證實(shí)腹瀉模型大鼠中炎性因子含量升高，而AQP8表達(dá)水平下降，腸道的炎癥反應(yīng)可進(jìn)一步加重腸黏膜損傷，腸黏膜表皮細(xì)胞的凋亡與壞死，使AQP8分布部位受損，則AQP8表達(dá)減少，認(rèn)為炎性因子與AQP8具有一定的相關(guān)性[21]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠灌胃番瀉葉后，排出水樣稀便，血清中TNF-α、IL-6、CRP含量均顯著升高，結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞部分凋亡壞死，固有層毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，Western blot法和免疫組化觀察結(jié)果表明結(jié)腸組織中AQP8蛋白表達(dá)水平明顯降低，表明番瀉葉可致結(jié)腸黏膜炎性損傷，AQP8蛋白表達(dá)水平下降，水分吸收減少而致腹瀉。車前子各劑量組給藥治療后，大鼠糞便基本成形，血清中TNF-α、IL-6和CRP含量均明顯下降，尤以中劑量組降低趨勢(shì)更為明顯，說明車前子的抗炎作用并非隨著用量增加而增強(qiáng)，中劑量乃較為適宜的濃度。結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡壞死、毛細(xì)血管充血及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象明顯減輕，結(jié)腸組織中AQP8蛋白表達(dá)水平升高，提示車前子具有較好的止瀉作用，其作用機(jī)制可能與改善結(jié)腸黏膜損傷、減輕炎癥反應(yīng)、上調(diào)AQP8蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)腸對(duì)水分的吸收，調(diào)節(jié)水液代謝有關(guān)。