葫蘆素B抑制STAT3/Bcl-2表達誘導(dǎo)非小細胞肺癌H1975細胞凋亡

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【摘要】 目的 探討葫蘆素B對非小細胞肺癌H1975細胞凋亡的影響及可能的機制。方法 應(yīng)用不同濃度葫蘆素B作用H1975細胞不同時間， 分別使用Annexin/7-AAD雙染法檢測細胞凋亡， Western blot法測定信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3（STAT3）、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）蛋白表達。結(jié)果 0 nM的葫蘆素B處理后24、48 h的細胞增殖抑制率分別為（2.86±0.11）、（3.21±1.26）%， 20 nM的分別為（3.10±0.29）、（4.09±0.65）%， 40 nM的分別為（4.09±0.12）、（7.59±0.74）%， 80 nM的分別為（4.61±0.14）、（32.63±0.67）%。0、20 nM葫蘆素B處理后24、48 h對H1975細胞增殖抑制率無明顯影響;40、80 nM葫蘆素B處理后24、48 h， 對H1975細胞增殖抑制率均高于0 nM與20 nM， 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。葫蘆素B處理后24 h的細胞增殖抑制率均低于處理后48 h， 呈時間-劑量依賴性增加， 80 nM葫蘆素B作用48 h對H1975細胞的細胞凋亡誘導(dǎo)作用最為明顯， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。40 nM以上濃度葫蘆素B作用H1975細胞48 h后p-STAT3、STAT3、Bcl-2明顯降低。結(jié)論 葫蘆素B通過抑制STAT3信號活化下調(diào)Bcl-2蛋白表達誘導(dǎo)H1975細胞凋亡的發(fā)生。

【關(guān)鍵詞】 非小細胞肺癌;葫蘆素B;信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3;B淋巴細胞瘤-2

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.13.086

Inhibition of STAT3 / Bcl-2 expression by cucurbitacin B on apoptosis of non-small cell lung cancer H1975 cells? ?HE Chen， WANG Ju-hui， QIU Shao-xiao， et al. Department of Respiratory Medicine， Baoan Peoples Hospital， Shenzhen 518101， China

【Abstract】 Objective? ?To discuss the effect of cucurbitacin B on the apoptosis of non-small cell lung cancer cell line h1975 and its possible mechanism. Methods? ?The H1975 cells were treated with different concentrations of cucurbitacin B at different times， the cell apoptosis were detected by Annexin / 7-AAD double staining， and the expression of signal transducer and activator of transcription 3 （STAT3） and B-cell lymphoma-2 （Bcl-2） protein expression were detected by Western blot method. and STAT3 / BCL2 expression were analyzed by the and respectively. Results? ?The cell proliferation inhibition rates of 0 nM cucurbitacin B at 24 and 48 h?were （2.86±0.11）， （3.21±1.26）%， respectively， 20 nM were （3.10±0.29） and （4.09±0.65）%， respectively， 40 nM were （4.09±0.12） and （7.59±0.74）%， respectively， and 80 nM were （4.61±0.14） and （32.63±0.67）%， respectively. After 0 and 20 nM cucurbitacin B treatment for 24 and 48 h， there was no significant effect on the proliferation inhibition rate of H1975 cells. After 40 and 80 nm cucurbitacin B treatment for 24 and 48 h， the proliferation inhibition rate of H1975 cells was higher than that of 0 nM and 20 nM， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The inhibition rate of cell proliferation at 24 h after treatment with cucurbitacin B was lower than that at 48 h after treatment， showing a time-concentration-dependent manner. The cell apoptosis of H1975 cells induced by 80 nM cucurbitacin B for 48 h was the most obvious， and the difference was statistically significant （32.63±0.67）%. H1975 cell was treated by Cucurbitacin B above 40 nM for 48 h， p-STAT3， STAT3 and Bcl-2 were significantly decreased. Conclusion? ?Cucurbitacin B can induce apoptosis of H1975 cells by inhibiting STAT3 signal activation and down regulating Bcl-2 protein expression.

【Key words】 Non-small cell lung cancer; Cucurbitacin B; Signal transducer and activator of transcription 3; B-cell lymphoma-2

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一， 2013年我國肺癌新發(fā)病例和死亡病例人數(shù)在所有腫瘤登記數(shù)據(jù)排序中均高居首位， 且其發(fā)病率和死亡率仍在逐年上升[1]。隨著對肺癌發(fā)病機制的研究深入， 新技術(shù)、藥物不斷研發(fā)和應(yīng)用， 新的治療方案也不斷提出、推廣， 肺癌的綜合診治水平較前有了明顯提高， 但總體生存獲益改善仍不理想， 5年相對存活率僅為23%[2]。因此， 探尋包含肺癌在內(nèi)的惡性腫瘤治療新藥物成為臨床面臨的巨大挑戰(zhàn)。我國中醫(yī)藥文化源遠流長， 以植物為主要來源的中草藥是傳統(tǒng)中醫(yī)藥的重要組成和瑰寶之一， 在長期的臨床抗腫瘤治療實踐中已取得一定的成就。借助于現(xiàn)代生物技術(shù)和新藥篩選技術(shù)， 從包含植物在內(nèi)的各種天然產(chǎn)物中通過活性追蹤分離， 篩選、尋找抑制惡性腫瘤的活性成分成為發(fā)掘新穎抗癌藥物的重要來源[3]。葫蘆素是從葫蘆科植物中分離得到的一組四環(huán)三萜類化合物， 具有抗腫瘤、護肝、抗炎、抗微生物等多種生物學(xué)特性[4]。葫蘆素B（cucurbitacin B）是其中療效最明確和應(yīng)用最廣泛的單體之一。越來越多的證據(jù)表明葫蘆素B能誘導(dǎo)大腸癌、肝癌、胃癌、卵巢癌等多種腫瘤細胞凋亡并抑制生長[5-9]。本文觀察了葫蘆素B對人肺癌H1975細胞的細胞凋亡誘導(dǎo)作用， 并通過葫蘆素B對細胞增殖和凋亡途徑相關(guān)蛋白STAT3和Bcl-2表達的影響， 探討了葫蘆素B非小細胞肺癌細胞凋亡的可能機制。

1 材料與方法

1. 1 材料 RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國Gibco公司）;葫蘆素B（美國Sigma公司）; Annexin V：?FITC 細胞凋亡檢測試劑盒（美國BDPharmingen公司）;BCA蛋白定量試劑盒（美國Pierce公司）;抗人磷酸化及總STAT3、Bcl-2抗體及化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（美國Cell Signaling公司）;垂直電泳儀（美國Biorad公司）;凝膠成像系統(tǒng)KODAK2000R（美國Kodak公司）。

1. 2 細胞培養(yǎng) 人肺癌細胞系H1975細胞在含有10%胎牛血清的RPMI-1640中在37℃和5%二氧化碳中培養(yǎng)， 每天更換培養(yǎng)基， 用0.25%胰蛋白酶分離細胞。

1. 2 方法

1. 2. 1 細胞凋亡的流式細胞術(shù)分析 采用Annexin/7-AAD雙染法分析檢測葫蘆素B對H1975細胞凋亡的影響。在六孔板中每孔接種1×106個細胞， 觀察細胞貼壁后加入不同濃度的葫蘆素B（終濃度分別為0、20、40、80 nM）。分別處理24 h和48 h。收獲細胞， 冷PBS重懸， 并根據(jù)說明書用Annexin V/7-AAD 凋亡檢測試劑盒染色， 用流式細胞儀分析細胞凋亡情況， 實驗至少進行3次重復(fù)。

1. 2. 2 Western blot分析 對數(shù)生長期H1975細胞， 胰蛋白酶消化、離心， 制成細胞懸液， 以5×105/ml的細胞濃度取接種10 ml細胞懸液至10 cm培養(yǎng)皿中， 待細胞貼壁后加入不同濃度（40、80nM）的葫蘆素B分別作用24 h和48 h， 提取總蛋白， 用BCA蛋白檢測試劑盒進行蛋白定量， -70℃冰箱凍存?zhèn)溆玫鞍踪|(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜， 含5%脫脂奶粉的TBST中室溫封閉60 min， 加入抗磷酸化和總STAT3、Bcl-2和β-肌動蛋白抗體（1∶1000）， 4℃孵育過夜， TBST充分漂洗后加入二抗（1∶1000）， 室溫作用1 h， TBsT充分漂洗后將膜置于5 ml 1×LumiGLO（0.25 ml 20×LumiGLO， 0.25 ml 20×過氧化氫， 9.0 ml水）輕搖孵育1 min;凝膠成像系統(tǒng)成像分析。

1. 3 觀察指標 觀察不同濃度（0、20、40、80 nM）葫蘆素B作用H1975細胞不同時間（24、48 h）后細胞增殖抑制率、葫蘆素B下調(diào)STAT3和Bcl-2蛋白表達。

1. 4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗;通過方差分析和NK（Student-Newnan-Keuls）檢驗檢驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計相關(guān)性， P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 不同濃度葫蘆素B作用H1975細胞不同時間后細胞增殖抑制率 0 nM的葫蘆素B處理后24、48 h的細胞增殖抑制率分別為（2.86±0.11）、（3.21±1.26）%， 20 nM的分別為（3.10±0.29）、（4.09±0.65）%， 40 nM的分別為（4.09±0.12）、（7.59±0.74）%， 80 nM的分別為（4.61±0.14）、（32.63±0.67）%。0、20 nM葫蘆素B處理后24、48 h對H1975細胞增殖抑制率無明顯影響;40、

80 nM葫蘆素B處理后24、48 h， 對H1975細胞增殖抑制率均高于0 nM與20 nM， 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。葫蘆素B處理后24 h的細胞增殖抑制率均低于處理后48 h， 呈時間-劑量依賴性增加， 80 nM葫蘆素B作用48 h對H1975細胞的細胞凋亡誘導(dǎo)作用最為明顯， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2. 2 葫蘆素B下調(diào)STAT3和Bcl-2蛋白表達 檢測葫蘆素B作用H1975細胞后STAT3及其下游與生長和凋亡密切相關(guān)的Bcl-2蛋白表達變化。結(jié)果顯示， 40 nM以上濃度葫蘆素B作用H1975細胞48 h后p-STAT3、STAT3、Bcl-2明顯降低。見圖1。

3 討論

葫蘆素B是從葫蘆科植物中分離得到的一種天然產(chǎn)物單體， 具有保肝的生物學(xué)特性， 以葫蘆素B為主要成分的藥品葫蘆素片亦在急慢性肝炎與肝硬化的臨床治療實踐中取得較好的療效。近年來， 隨著對葫蘆素B的研究不斷加強， 葫蘆素B的藥理學(xué)機制逐漸闡明， 葫蘆素B能夠誘導(dǎo)多種人腫瘤細胞的細胞凋亡和增殖抑制[5-10]， 展現(xiàn)出廣闊的抗腫瘤潛在應(yīng)用前景。本研究顯示葫蘆素B可呈劑量和時間依賴性誘導(dǎo)肺癌H1975細胞凋亡， 進一步的作用機制研究表明， 葫蘆素B通過抑制STAT3的活化， 降低Bcl-2的表達水平， 進而誘導(dǎo)H1975細胞的凋亡。

細胞凋亡誘導(dǎo)是從藥用植物中提取的抗癌藥物常見作用機制之一。本研究首先探討了葫蘆素B對H1975細胞凋亡的影響， 流式細胞術(shù)檢測表明， 中劑量以上葫蘆素B治療可誘導(dǎo)H1975細胞凋亡， 且呈時間-劑量依賴性增加， 與既往葫蘆素B可誘導(dǎo)肺癌A549細胞凋亡的研究結(jié)果一致[11， 12]。接下來通過觀察葫蘆素B對一組與細胞增殖和凋亡途徑相關(guān)蛋白表達的影響研究了葫蘆素B誘導(dǎo)細胞凋亡的潛在機制。既往研究表明葫蘆素B能夠抑制STAT3信號通路的激活， 調(diào)節(jié)STAT3下游基因表達， 從而抑制腫瘤的生長[10-13]。本研究中中劑量（40 nM）以上葫蘆素作用H1975細胞48 h后磷酸化及總STAT3表達水平明顯下降， 進一步提示葫蘆素B通過抑制STAT3信號活化誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡。線粒體功能障礙已被證明參與了細胞凋亡的誘導(dǎo)， 并被認為是凋亡途徑的中心環(huán)節(jié)。對線粒體功能的進一步分析顯示， 線粒體功能障礙主要表現(xiàn)在線粒體跨膜電位破壞和細胞色素c

釋放， 伴隨caspase-3和caspase-9活性水平升高和抗凋亡Bcl-2蛋白表達下調(diào)。Bcl-2蛋白位于線粒體外壁， 是STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游靶基因之一， 通過控制線粒體通透性和抑制細胞色素c的釋放調(diào)節(jié)細胞凋亡[14]。細胞色素c從線粒體釋放后與凋亡蛋白酶激活因子1結(jié)合后， 與caspase-9形成激活復(fù)合物[15]， 進而通過蛋白水解裂解激活Caspase-3促進凋亡的發(fā)生[16]。West blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)中劑量以上葫蘆素作用H1975細胞48 h后Bcl-2蛋白表達顯著下降?；谝陨辖Y(jié)果， 認為葫蘆素B可能通過抑制STAT3信號活化下調(diào)Bcl-2蛋白表達來激活細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述， 葫蘆素B具有抑制STAT3途徑下調(diào)Bcl-2蛋白誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡的作用， 可作為肺癌患者潛在有效的治療策略。

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[收稿日期：2020-01-07]