高效液相色譜法同時測定煙用甘草提取物中14種活性成分

王麗達(dá)，蔣成勇，楊振民，易小麗，蘆 楠，嚴(yán)莉紅

(上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心北京工作站，北京100121)

甘草提取物作為藥用型添加劑已被廣泛用于煙草、醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)，其活性成分主要有三萜皂苷類化合物(甘草酸、甘草次酸等)、甘草黃酮、甘草多糖等，具有補(bǔ)脾益氣、滋咳潤肺、清熱解毒、調(diào)和諸藥等功效[1-4]。煙草中的甘草提取物可有效降低卷煙煙氣中的自由基等有害化合物，顯著提高卷煙產(chǎn)品的安全性[5-6]，還可以起到增香、保潤的作用[7-8]。

目前，煙用甘草提取物的質(zhì)量監(jiān)控主要通過折光指數(shù)、相對密度、酸值等理化指標(biāo)及安全性這兩個環(huán)節(jié)來控制。常規(guī)的質(zhì)量判定不能準(zhǔn)確反映甘草提取物的內(nèi)在質(zhì)量及其波動，也不能從化學(xué)組成的角度對其中活性成分的差異做出定性、定量的解釋[9-11]。因此，監(jiān)測活性成分的含量變化，對于控制煙用甘草提取物進(jìn)貨質(zhì)量、保障卷煙產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定具有相當(dāng)重要的應(yīng)用意義。

甘草提取物中活性成分的測定方法主要有比色法[12]、薄層掃描法[13]、毛細(xì)管電泳法[14]和液相色譜法[15-17]等。但是，大多數(shù)文獻(xiàn)報道僅局限于測定甘草提取物中的一種或幾種成分[18-20]，無法滿足煙用甘草提取物中活性成分快速測定的要求。

本工作采用高效液相色譜法同時測定煙用甘草提取物中芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、新異甘草苷、甘草查爾酮B、甘草素、刺甘草查爾酮、異甘草素、甘草酸、甘草香豆素、甘草查爾酮A、光甘草定和甘草次酸等14種活性成分的含量，旨在為進(jìn)一步研究煙用甘草提取物質(zhì)量監(jiān)控、提升卷煙產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量提供技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Thermo Accela型高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器；HNY-100D 型恒溫振蕩器；D-78224型超聲波清洗儀；Milli-Q 型超純水儀。

14 種活性成分的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:含60.6 mg·L－1芹糖甘草苷、50.4 mg·L－1甘草苷、63.6 mg·L－1芹糖異甘草苷、47.0 mg·L－1異甘草苷、45.8 mg·L－1新異甘草苷、28.0 mg·L－1甘草查爾酮B、45.4 mg·L－1甘草素、36.8 mg·L－1刺甘草查爾酮、48.6 mg·L－1異甘草素、557.4 mg·L－1甘草酸、19.0 mg·L－1甘草香豆素、20.2 mg·L－1甘 草 查 爾 酮 A、47.0 mg·L－1光 甘 草 定 和34.0 mg·L－1甘草次酸，稱取適量的14 種活性成分的標(biāo)準(zhǔn)品，用80%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇溶液稀釋而成。

芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于96%，甘草苷、異甘草苷、甘草查爾酮B、甘草素、刺甘草查爾酮、異甘草素、甘草查爾酮A、光甘草定、甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于98%，甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品的純度大于93%，新異甘草苷、甘草香豆素標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于97%。

所用試劑均為色譜純，試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 色譜條件

Diamonsil Plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，柱溫30 ℃；流量1 m L·min－1；進(jìn)樣體積為10μL。流動相:A 為0.05%(體積分?jǐn)?shù))磷酸溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序:0～3.0 min 時，A 由80%降至73%，保持12.0 min；15.0～17.0 min時，A 由73%降至66%；17.0～22.0 min時，A 由66%降至65%；22.0～30.0 min時，A 由65%降至45%；30.0～48.0 min 時，A 由45%降至20%。檢測波長:276 nm(0～7.0 min)、360 nm(7.0～11.5 min)、276 nm(11.5～16.0 min)、360 nm(16.0 ～27.5 min)、248 nm(27.5～31.0 min)、360 nm(31.0～35.0 min)、276 nm(35.0～38.0 min)、248 nm(38.0～48.0 min)。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取0.100 0 g的取自某卷煙廠化材庫的甘草提取物樣品于25 m L 錐形瓶中，用移液器加入10 m L的80%甲醇溶液，超聲提取30 min 后靜置30 min，取上清液經(jīng)0.45μm 濾膜過濾后，按色譜條件進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按色譜條件對14種活性成分的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，其色譜圖見圖1。

圖1 14種活性成分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of 14 active constituents

按試驗(yàn)方法對煙用甘草提取物樣品和加標(biāo)后的煙用甘草提取物樣品進(jìn)行分析，煙用甘草提取物樣品加標(biāo)前后的色譜圖見圖2。

圖2 煙用甘草提取物樣品加標(biāo)前后的色譜圖Fig.2 Chromatograms of the sample of tobacco licorice extract before and after addition of mixed standard solution

2.2 提取方法的選擇

試驗(yàn)采用超聲(1，10，20，30，40，50 min)和振蕩(0.5，1，2，3，4，5 h)兩種提取方法分別對同一批次煙用甘草提取物樣品進(jìn)行分析，超聲提取時間對目標(biāo)物總量的影響見圖3。

圖3 超聲提取時間對目標(biāo)物總量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic extraction time on total amount of the target objects

由圖3可知:超聲提取30 min后，目標(biāo)物的提取基本可以完成。振蕩提取煙用甘草提取物樣品中的活性成分時，目標(biāo)物總量偏低，提取效率略低。超聲提取利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動、空化、擴(kuò)散、擊碎和攪拌作用等多級效應(yīng)，增加溶劑穿透力，加速溶質(zhì)的釋放、擴(kuò)散和溶解，可以提高提取效率，有效縮短提取時間。試驗(yàn)選用超聲提取。

2.3 超聲提取條件的選擇

2.3.1 提取溶劑

稱取0.100 0 g同一批次煙用甘草提取物樣品于25 m L錐形瓶中，分別加入10 m L 甲醇、乙醇、水、乙腈、異丙醇作為提取溶劑，超聲提取30 min。上述5種提取溶劑提取煙用甘草提取物時，目標(biāo)物的總量依次 為23.46，4.68，27.89，6.32，3.45 mg·g－1，提取溶劑的提取能力順序?yàn)?水＞甲醇＞乙腈＞乙醇＞異丙醇。其中甲醇對甘草素、異甘草素、甘草酸的提取效率最好，水對芹糖甘草苷、甘草苷的提取效率最好，不同成分在不同溶劑中的溶解度不一樣。試驗(yàn)選用甲醇和水的混合液作為提取溶劑。

試驗(yàn)考察了甲醇溶液的體積分?jǐn)?shù)依次為90%，80%，70%，50%，20%時對目標(biāo)物總量的影響。結(jié)果表明:分別以90%，80%，70%，50%，20%甲醇溶液為提取溶劑時，目標(biāo)物的總量依次為27.76，31.68，30.61，28.71，28.17 mg·g－1，80%的 甲 醇 溶液提取效果最好。試驗(yàn)選擇提取溶劑為80%甲醇溶液。

2.3.2 提取溶劑的用量

試驗(yàn)考察了80%甲醇溶液的用量依次為3，5，10，15，20，30，40 m L時對目標(biāo)物總量的影響，結(jié)果表明:80%甲醇溶液用量依次為3，5，10，15，20，30，40 m L 時，目標(biāo)物總量依次為30.62，30.65，31.68，31.74，31.82，31.83，31.85 mg·g－1。目標(biāo)物總量變化并不顯著，說明煙用甘草提取物的活性成分較易提取。由于甘草香豆素的含量較低，提取溶劑用量為15 m L時，所對應(yīng)的峰面積較小，誤差較大，同時提取溶劑為10，15 m L 時，提取效果相當(dāng)。試驗(yàn)選擇提取溶劑的用量為10 m L。

2.3.3 正交試驗(yàn)

為進(jìn)一步考察提取溶劑中甲醇與水的比例(A)、提取時間(B)、提取溶劑用量(C)等因素對超聲提取煙用甘草提取物活性成分總量的影響，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以總提取量為指標(biāo)，采用L9(33)正交法設(shè)計試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of orthogonal test

由表1可知:各因素對目標(biāo)物總量的影響順序?yàn)樘崛∪軇咎崛∪軇┯昧浚咎崛r間。因此，超聲提取的最佳方案為A2B2C3，提取溶劑為80%甲醇溶液。因?yàn)楦什菹愣顾卦?5 m L 提取溶劑中峰面積較小，誤差較大，同時10 m L 和15 m L 用量的提取效果相當(dāng)，試驗(yàn)選用10 m L 提取溶劑，在超聲條件下提取30 min。

正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果見表2，其中“??”表示提取溶劑中甲醇體積分?jǐn)?shù)的改變對活性成分提取總量顯著性相關(guān)。

表2 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Tab.2 Results of variance analysis of orthogonal test

根據(jù)正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果進(jìn)行F 檢驗(yàn)，結(jié)果表明:提取溶劑中甲醇體積分?jǐn)?shù)的改變對活性成分提取總量有顯著影響；另外兩種因素對提取總量無顯著影響。因此，不必再進(jìn)行各因素水平間的多重比較。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測定下限

按色譜條件對14種活性成分的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測定，以14種活性成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。14種活性成分的線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表3。

以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差和10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差分別作為方法檢出限(3s)和測定下限(10s)，結(jié)果見表3。

表3 線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和測定下限Tab.3 Linearity ranges，linear regression equations，correlation coefficients，detection limits and lower limits of determination

2.5 精密度和回收試驗(yàn)

按試驗(yàn)方法對煙用甘草提取物樣品進(jìn)行分析，同時進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表4。

表4 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝5)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

表4(續(xù))

由表4可知:回收率為91.7%～143%，RSD 為1.2%～6.0%。

2.6 方法的穩(wěn)定性

將煙用甘草提取物樣品密閉于2 m L棕色色譜小瓶中，于4 ℃冷藏保存，分別在第1，2，3，4，5 d按試驗(yàn)方法進(jìn)行分析。結(jié)果表明:第1，2，3，4，5 d的目標(biāo) 物 總 量 依 次 為31.68，31.65，31.87，31.83，31.69 mg·g－1。

隨著樣品放置時間的延長，目標(biāo)物總量并沒有發(fā)生明顯改變，說明提取后的樣品穩(wěn)定，本方法穩(wěn)定性較好。

2.7 樣品分析

按試驗(yàn)方法對10個連續(xù)進(jìn)貨批次的煙用甘草提取物樣品進(jìn)行分析，結(jié)果見表5。

表5(續(xù)) mg·g－1

由表5可知:不同煙用甘草提取物樣品的活性成分含量存在明顯差異。這是由于甘草提取物的質(zhì)量受原材料產(chǎn)地、土壤、種質(zhì)、炮制、保存、制劑過程等因素的影響，其活性成分含量會有很大差異，甘草提取物添加到卷煙產(chǎn)品后，會直接影響卷煙產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。

本工作建立了高效液相色譜法同時測定煙用甘草提取物中14種活性成分含量的方法。本方法操作簡便、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可適用于煙用甘草提取物中活性成分的快速測定，并且可為煙用甘草提取物的品質(zhì)監(jiān)控提供技術(shù)支持。