高效液相色譜法測定蔬菜中19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留量

氨基甲酸酯類農(nóng)藥是人類針對有機氯和有機磷農(nóng)藥的缺點而開發(fā)出的一種新型廣譜殺蟲、殺螨的除草劑，具有高效、低毒、選擇性高和持效期長等特點，主要用于糧食、蔬菜和水果等農(nóng)產(chǎn)品和中藥材栽培中，在我國使用越來越普遍[1-3]。然而，若不對氨基甲酸酯類農(nóng)藥的使用進行監(jiān)控，任其隨意使用，就會造成人、畜中毒事件，其殘留對人、畜和環(huán)境都會產(chǎn)生極大的危害[4]。因此，許多國家和地區(qū)對這種農(nóng)藥在食物中的殘留量都制定了嚴格的限量標準。歐盟規(guī)定蔬菜中克百威的最高殘留量為0.02 mg·kg－1，呋線威的最高殘留量為0.05 mg·kg－1；我國規(guī)定涕滅威(包括涕滅威、涕滅威亞砜和涕滅威砜)在大部分蔬菜中的殘留限量為0.03 mg·kg－1，滅多威在蔬菜中的殘留限量為0.2 mg·kg－1。這就使得氨基甲酸酯類農(nóng)藥的測定倍受關注[5]。

目前，氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的測定方法主要有液相色譜-質譜法[6-9]、使用柱后衍生-熒光檢測器的高效液相色譜法[10-11]、使用紫外檢測器的高效液相色譜法[12]和氣相色譜-質譜法[13]。

由于液相色譜-質譜法和氣相色譜-質譜法要用到價格高昂的測定設備，一般基層檢測機構難以滿足，而使用紫外檢測器的高效液相色譜法所能測定的氨基甲酸酯類農(nóng)藥的種類偏少。因此，使用柱后衍生-熒光檢測器的高效液相色譜法是基層檢測機構中較常用的測定氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的方法。文獻[4]采用超快速高效液相色譜法測定普通白菜中16種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量；文獻[14]建立了高效液相色譜法(柱后衍生)測定蔬菜、水果中的15種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的方法；文獻[15]建立了測定蔬菜和水果中常見的21種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的液相色譜法(使用柱后衍生-熒光檢測器)，而真正能實現(xiàn)分離的是18種氨基甲酸酯類農(nóng)藥。所報道的文獻中，要么對儀器設備要求較高，有些還是自制，要么所測定的氨基甲酸酯類農(nóng)藥的種類不夠多。

本工作采用高效液相色譜法測定蔬菜中涕滅威亞砜、涕滅威砜、殺線威、滅多威、3-羥基克百威、涕滅威、速滅威、殘殺威、克百威、甲萘威、滅殺威、乙硫苯威、硫雙威、抗蚜威、異丙威、仲丁威、甲硫威、猛殺威和呋線威等19 種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留量，所用到的儀器設備都是基層檢測機構所能普遍達到的，為基層檢測機構開展相關方面的研究提供參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 Infinity 型高效液相色譜儀，配G1310B型四元泵、G1329B 型自動進樣器、G1316A型柱溫箱、G1321B 型熒光檢測器和PICKERING型柱后衍生裝置；Milli-Q Intrgral型水純化系統(tǒng)；Auto EVA-60型全自動平行濃縮儀；B-400型均質器；T25 型 高 速 勻 漿 機；12 位 固 相 萃 取 裝 置；0.22μm 有機相針式濾膜過濾頭；SPE-NH2固相萃取小柱(500 mg/6 m L)；Qu ECh ERs凈化柱。

殺線威、滅殺威、乙硫苯威、猛殺威和呋線威標準儲備溶液:100 mg·L－1。

涕滅威亞砜、涕滅威砜、滅多威、3-羥基克百威、涕滅威、速滅威、殘殺威、克百威、甲萘威、硫雙威、抗蚜威、異丙威、仲丁威、甲硫威標準儲備溶液:1 000 mg·L－1。

19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的混合標準儲備溶液:10 mg·L－1，分別移取適量的上述19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的標準儲備溶液，用甲醇稀釋混合而成，冷凍避光保存。

鄰苯二甲醛(OPA)試劑:將100 mg OPA 和2 g巰基乙醇用適量水溶解后轉移至已去氧的OPA稀釋劑中，混合而成。

甲醇、二氯甲烷、乙腈均為色譜純；氯化鈉為分析純；試驗用水為超純水(電阻率為18.2 MΩ·cm)。

1.2 儀器工作條件

1)衍生條件 水解試劑流量0.3 m L·min－1，OPA 試劑流量0.3 m L·min－1；水解溫度100 ℃，衍生溫度為室溫。

2)色譜條件 PICKERING Carbamate Analysis-C8色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，柱溫42 ℃；流量0.8 m L·min－1；進樣量20μL。流動相:A 為甲醇，B為水。梯度洗脫程序:0～12.0 min時，B 由80%降 至60%；12.0～20.0 min 時，B 由60%降至50%；20.0～30.0 min時，B 由50%降至41%，保持5.0 min；35.0～40.0 min時，B由41%降至0，保持6.0 min；46.0～46.1 min時，B 由0升至80%，保持5.9 min。抗蚜威的激發(fā)波長(λex)為339 nm，發(fā)射波長(λem)為392 nm，其余18種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的λex為339 nm，λem為445 nm。

1.3 試驗方法

樣品經(jīng)均質機均質后，稱取約25 g均質后樣品于150 m L燒杯中，加入50 m L乙腈提取，高速勻漿機勻漿2 min，然后經(jīng)快速濾紙過濾到已有5 g氯化鈉的100 m L比色管中，收集濾液。過濾完后，濾液渦旋混勻1 min，靜置分層。取上清液10 m L 置于全自動平行濃縮儀中吹至近干。

用6 m L 的1%(體積分數(shù)，下同)甲醇-二氯甲烷混合液預淋洗SPE-NH2固相萃取小柱，用2 m L的1%甲醇-二氯甲烷混合液溶解殘渣，上樣，再用2 m L的1%甲醇-二氯甲烷混合液分2次溶解殘渣上樣，收集洗脫液，氮吹至近干。殘留物用60%(體積分數(shù)，下同)甲醇溶液定容至2.5 m L，過0.22μm有機濾膜后，按儀器工作條件進行測定。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的混合標準溶液的色譜圖見圖1。

圖1 19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的混合標準溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution of 19 carbamate pesticides

2.2 儀器工作條件的選擇

2.2.1 流動相

試驗采用PICKERING Carbamate Analysis-C8色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)進行分離，考察了乙腈-水體系和甲醇-水體系作為流動相時對19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥測定的影響。結果表明:乙腈-水體系作為流動相時，19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的熒光值比甲醇-水體系為流動相時19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的熒光值大很多，但是乙腈-水體系作為流動相時，通過不斷改變流動相比例，不能很好地分離殘殺威、克百威、甲萘威、滅殺威、乙硫苯威、硫雙威和抗蚜威。因此，試驗選用甲醇-水體系作為流動相，通過改變流動相比例，能夠在46 min內將19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥進行分離，梯度洗脫程序見1.2節(jié)。

2.2.2 流 量

試驗考察了流量依次為0.8，1.0 m L·min－1時對19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥測定的影響。試驗發(fā)現(xiàn):流量為1.0 m L·min－1時，硫雙威不能與抗蚜威分離開，仲丁威和甲硫威不能達到基線分離。試驗選擇流量為0.8 m L·min－1。

2.2.3 柱 溫

試驗考察了柱溫依次為35，42，46℃時對19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥測定的影響。試驗發(fā)現(xiàn):柱溫為46 ℃時，殘殺威與克百威、仲丁威與甲硫威不能基線分離，硫雙威與抗蚜威分得較開；柱溫為35℃時，殘殺威與克百威、仲丁威與甲硫威分得較開，而硫雙威與抗蚜威不能分離，變成了一個峰。試驗選擇柱溫為42 ℃。

2.2.4 測定波長

試驗考察了λex＝330 nm，λem＝465 nm 和λex＝339 nm，λem＝445 nm 時對19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥測定的影響。試驗發(fā)現(xiàn):在λex＝339 nm，λem＝445 nm 時，19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的熒光值比在λex＝330 nm，λem＝465 nm 時的19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的熒光值大。因此，試驗選擇測定波長為λex＝339 nm，λem＝445 nm。然而在試驗中也發(fā)現(xiàn)，抗蚜威在此測定波長下熒光值較低。文獻[16]中，抗蚜威的最佳測定波長為λex＝317 nm，λem＝392 nm，然而在λex＝317 nm，λem＝392 nm 下，其他氨基甲酸酯類農(nóng)藥的熒光值很低。為了確定最佳的測定波長，試驗采用多發(fā)射方案。試驗發(fā)現(xiàn):抗蚜威在λex＝339 nm，λem＝392 nm 下的熒光值比在λex＝339 nm，λem＝445 nm 下的熒光值大了3 倍左右。試驗中抗蚜威選擇λex＝339 nm，λem＝392 nm，其余18種氨基甲酸酯類農(nóng)藥選擇λex＝339 nm，λem＝445 nm。

2.3 樣品前處理方法

試驗考察了SPE-NH2固相萃取小柱凈化和Qu ECh ERs凈化對19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥測定的影響。SPE-NH2固相萃取小柱的凈化方法見1.3節(jié)。Qu ECh ERs 凈 化 方 法 按 以 下 來 操 作:將10 m L乙腈提取液倒入Qu ECh ERs凈化包中，渦旋混勻1 min，以5 000 r·min－1轉速離心，移取6 m L上清液，氮吹至近干，用60% 甲醇溶液定容至1.5 m L，過0.22μm 有機濾膜，按儀器工作條件進行測定。通過試驗發(fā)現(xiàn)，SPE-NH2固相萃取小柱凈化的回收率要明顯高于Qu ECh ERs凈化的回收率。試驗選用傳統(tǒng)的SPE-NH2固相萃取小柱凈化。

2.4 標準曲線和檢出限

用60%甲醇溶液將10 mg·L－1的19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的混合標準儲備溶液逐級稀釋成0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0 mg·L－1的 混 合 標 準 溶液系列。按試驗方法對上述混合標準溶液系列進行測定，以19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的質量濃度為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標進行線性回歸，繪制標準曲線。19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的線性范圍、線性回歸方程和相關系數(shù)見表1。

以3倍信噪比計算方法的檢出限(3S/N)，結果見表1。

表1 線性范圍、線性回歸方程、相關系數(shù)和檢出限Tab.1 Linearity ranges，linear regression equations，correlation coefficients and detection limits

表1(續(xù))

2.5 回收試驗

按試驗方法對空白花菜樣品進行加標回收試驗，平行測定6次，計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD)，結果見表2。

表2 回收試驗結果(n＝6)Tab.2 Results of test for recovery(n＝6)

表2(續(xù))

由表2可知:回收率為47.7%～110%，RSD 為1.0%～12%。本方法能滿足蔬菜中19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的測定要求，其中乙硫苯威的回收率普遍偏低，主要原因是乙硫苯威在前處理過程中，容易轉變成另外一個未知物質，該物質有待進一步研究。

空白花菜樣品加標前后的色譜圖見圖2。

圖2 空白花菜樣品加標前后的色譜圖Fig.2 Chromatograms of blank cauliflower sample before and after addition of standard

2.6 樣品分析

按試驗方法對菠菜、生菜、蒲瓜、甘薯、韭菜、大白菜、黃瓜、四季豆、彩椒、辣椒、苦瓜、荷蘭豆、皇帝菜等樣品進行分析，均未檢出19 種氨基甲酸酯類農(nóng)藥。

本工作以乙腈為提取溶劑，選用SPE-NH2固相萃取小柱凈化，采用高效液相色譜法測定蔬菜中19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥。本方法測定范圍廣、分離度高、簡便、靈敏、高效，可滿足蔬菜中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的測定需求。