阿托伐他汀在蛛網(wǎng)膜下腔出血腦血管痙攣中的預(yù)防作用機(jī)制

侯鵬飛，劉展會(huì)，張 睿，程文佳

蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)主要表現(xiàn)為突發(fā)爆裂樣頭痛，頭痛在開始時(shí)即達(dá)高峰，占所有腦卒中的5%，由于有腦積水、腦血管痙攣(CVS)等眾多并發(fā)癥，所以致死率高[1]。CVS是SAH常見而嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，CVS造成的后遺癥和死亡占SAH病人的10%左右[2]。蛛網(wǎng)膜下腔血液及其相應(yīng)的裂解產(chǎn)物刺激腦血管引起異常收縮，使受累顱內(nèi)動(dòng)脈管徑變小從而導(dǎo)致供血量減少，出現(xiàn)腦組織缺血損傷，極易導(dǎo)致病人死亡[3]，但迄今為止尚未對(duì)其發(fā)生的病理生理學(xué)機(jī)制及其預(yù)防、治療做出明確的闡述[4]。他汀類是羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，抑制體內(nèi)膽固醇合成[5]。大量臨床試驗(yàn)證明他汀類藥物對(duì)冠心病的一級(jí)和二級(jí)預(yù)防有效[6-7]。阿托伐他汀的藥理作用廣泛，藥理學(xué)研究顯示阿托伐他汀除了具有降脂作用外，還具有抗血小板聚集、清除自由基、調(diào)節(jié)免疫等作用[8]，同時(shí)其在SAH后的血管功能障礙起到保護(hù)性作用[9]，但其具體作用機(jī)制尚不明確。本研究探討阿托伐他汀對(duì)SAH后CVS的作用和可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性清潔級(jí)SD大鼠，購(gòu)自南京博恩生物技術(shù)有限公司，月齡5～8個(gè)月，體質(zhì)量300～350 g。飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在22～25 ℃，12 h晝夜節(jié)律，自由進(jìn)食和飲水。

1.1.2 藥物與試劑 阿托伐他汀(Pfizer)20 mg，β-actin抗體均購(gòu)自Abcam公司；ELISA試劑盒由上海群己生物科技有限公司提供；內(nèi)皮素-1(ET-1)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS) 試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供；核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)試劑盒由上海蔚霆生物科技有限公司提供。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.1.3 主要儀器 Multiskan MK3型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo-Labsysytems公司)，倒置顯微鏡(Nikon)，蛋白電泳儀、電轉(zhuǎn)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，HE掃描與分析工作站(德國(guó)徠卡)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與模型的建立 54只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組(18只)、模型組(18只)、治療組(18只)。治療組：術(shù)前灌胃20 mg/(kg·d)阿托伐他汀，共7 d，采用枕大池二次注血法建立SAH模型[10]，10%水合氯醛麻醉后，將大鼠置于頭低位的立體定位框架中，鉆孔小腦延髓池，使用導(dǎo)管在60 s內(nèi)將來自股動(dòng)脈的自體血(0.2 mL)注射到小腦延髓池中。24 h后通過相同的導(dǎo)管給予第2次血液注射(0.1 mL，30 s)。模型組：模型建立手術(shù)操作同治療組，在建模前后均未應(yīng)用阿托伐他汀。對(duì)照組：大鼠按照治療組相同步驟接受2次腦池內(nèi)注射生理鹽水，參考Qi等[11]實(shí)驗(yàn)劑量，手術(shù)操作同治療組。建模后3 h神經(jīng)行為評(píng)分≥1分的大鼠判定為造模成功。

1.2.2 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 在完成SAH模型24 h評(píng)定后對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)，參照Bederson方法[12]評(píng)定。

1.2.3 基底動(dòng)脈血管橫截面積和血管壁厚度測(cè)量 將分離的基底動(dòng)脈血管制成切片進(jìn)行HE染色。使用徠卡Aperio Versa微血管分析系統(tǒng)測(cè)量血管周長(zhǎng)，并計(jì)算基底動(dòng)脈血管橫截面積、血管壁厚度。

1.2.4 腦水腫檢測(cè) 24 h行為學(xué)評(píng)分結(jié)束后，每組取6 只大鼠采用空氣栓塞法處死，評(píng)估腦含水量。完整分離腦組織，保持蛛網(wǎng)膜完整，測(cè)量腦組織濕重，將樣品在105 ℃的烘箱中加熱24 h，稱量腦組織干重。腦水含量的百分比為：(濕重-干重)/濕重×100%。每組使用6只大鼠進(jìn)行計(jì)算。

1.2.5 ET-1蛋白檢測(cè) 將采集的血液以3 000 r /min離心10 min，取上清液，暫時(shí)保存至-20 ℃的冰箱中待測(cè)。

1.2.6 蛋白免疫印跡測(cè)定 eNOS蛋白和NF-κB蛋白行為學(xué)評(píng)分結(jié)束后，每組取6 只大鼠采用空氣栓塞法處死，Western blot 檢測(cè)eNOS蛋白和NF-κB蛋白表達(dá)。取腦組織，于4%多聚甲醛固定24 h標(biāo)本在電泳前將蛋白樣品按5∶1比例加入6×上樣緩沖液(loading buffer)，煮沸5 min后用12%聚丙烯胺凝膠電泳。4 ℃條件下23 V電壓濕轉(zhuǎn)12 h，預(yù)制5%TBS-脫脂奶粉封閉液，室溫封閉1 h后加入1∶1 000稀釋的eNOS蛋白和NF-κB蛋白抗體或β-actin一抗，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗5 min×4次。暗室內(nèi)浸入ECL液顯色，并使膠片曝光，全自動(dòng)X光洗片機(jī)洗片，免疫印跡條帶經(jīng)掃描后用Image J軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)量的灰度分析，測(cè)得蛋白表達(dá)量與β-actin比對(duì)。

2 結(jié) 果

2.1 各組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較 SAH后24 h對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，模型組為(4.8±2.2)分，治療組為(3.7±1.9)分，對(duì)照組為(2.6±1.4)分。模型組與治療組評(píng)分均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.34，P=0.02)。

2.2 各組基底動(dòng)脈血管橫截面積比較 對(duì)照組基底動(dòng)脈厚度在3組中最薄； 模型組基底動(dòng)脈厚度明顯增厚；治療組基底動(dòng)脈厚度較模型組厚度降低(P<0.05)，仍比對(duì)照組厚(P<0.05)。詳見圖1、表1。

圖1 大鼠SAH后24 h基底動(dòng)脈HE染色切片圖(×400)

表1 各組大鼠基底動(dòng)脈橫截面積和血管壁厚度比較(±s)

2.3 各組腦組織水含量比較 對(duì)照組大鼠腦組織水分含量為(75.12±3.85)%，模型組腦組織水含量為(86.12±6.78)%，腦水腫較為明顯；治療組腦水腫程度相對(duì)于模型組減輕，腦組織水含量為(78.25±3.25)%，3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01)。

2.4 各組ET-1蛋白表達(dá)比較 ELISA檢測(cè)血管收縮劑ET-1蛋白表達(dá)變化，以確定阿托伐他汀對(duì)SAH后腦水腫的影響，與對(duì)照組(39.72±4.67)pg/mL比較，模型組和治療組ET-1蛋白表達(dá)水平均增加[(85.24±6.25)pg/mL與(62.92±7.27)pg/mL]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，治療組ET-1蛋白表達(dá)低于模型組(P<0.05)。詳見圖2。

與對(duì)照組比較， *P<0.05；

2.5 各組eNOS蛋白表達(dá)情況 eNOS存在于內(nèi)皮細(xì)胞，以促進(jìn)NO生成。模型組eNOS表達(dá)減少，予阿托伐他汀干預(yù)后，治療組與模型組相比eNOS蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.001)，提示阿托伐他汀可能通過上調(diào)eNOS防止CVS。詳見圖3。

與對(duì)照組比較， *P<0.001；

2.6 各組NF-κB蛋白表達(dá)情況 NF-κB在細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過程中起到關(guān)鍵性作用。模型組與對(duì)照組相比，NF-κB蛋白水平上調(diào)，引起炎癥反應(yīng)，而治療組與模型組相比，NF-κB蛋白水平明顯下調(diào)(P<0.001)。詳見圖4。

與對(duì)照組比較， *P<0.001；

3 討 論

CVS是SAH的嚴(yán)重并發(fā)癥，多種因素均可導(dǎo)致顱內(nèi)動(dòng)脈收縮，減少動(dòng)脈供應(yīng)區(qū)域的腦血流量[13]，增高顱內(nèi)壓、氧化應(yīng)激導(dǎo)致炎癥等[14]。阿托伐他汀具有抗炎、穩(wěn)定斑塊、改善內(nèi)皮細(xì)胞功能以及抑制免疫反應(yīng)等作用[15]。本研究探討阿托伐他汀對(duì)SAH后CVS的作用和分子機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組與對(duì)照組相比神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分升高，而治療組神經(jīng)行為評(píng)分低于模型組，表明阿托伐他汀可以緩解神經(jīng)損傷。阿托伐他汀的抗CVS或神經(jīng)保護(hù)功能的基礎(chǔ)機(jī)制可能是維持血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，調(diào)節(jié)腦血流量，但作用的具體分子機(jī)制仍不清楚，血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)、ET-1均是由血管內(nèi)皮合成和釋放的有效活性肽，并且是內(nèi)皮功能的標(biāo)志物。研究表明，ET-1可導(dǎo)致血管收縮和內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并且破壞水穩(wěn)態(tài)和血腦屏障完整性，造成腦水腫[16]。在正常的生理?xiàng)l件下，這些細(xì)胞因子的表達(dá)很少，當(dāng)生物體被嚴(yán)重刺激或腦內(nèi)皮細(xì)胞自動(dòng)調(diào)節(jié)功能受損時(shí)， ET-1的表達(dá)將增加。因此，ET-1被認(rèn)為是評(píng)價(jià)腦內(nèi)皮細(xì)胞功能和腦血管自動(dòng)調(diào)節(jié)功能的“金標(biāo)準(zhǔn)”[17]。

本實(shí)驗(yàn)表明，阿托伐他汀可減輕SAH后的腦水腫，降低ET-1表達(dá)水平，推測(cè)阿托伐他汀通過調(diào)節(jié)ET-1水平緩解腦水腫，修復(fù)遭到破壞的血管內(nèi)皮細(xì)胞，這與其在SAH誘導(dǎo)的CVS中的抗痙攣?zhàn)饔孟鄬?duì)應(yīng)[8]。炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡在SAH遲發(fā)性神經(jīng)功能缺損的機(jī)制中起重要作用。研究表明，p53/NF-κB途徑在實(shí)驗(yàn)性SAH誘導(dǎo)后的細(xì)胞凋亡起著重要作用[18]。作為轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB參與黏附分子、單核細(xì)胞趨化蛋白、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的表達(dá)調(diào)節(jié)[19]。最近的研究表明，在炎癥作用下，CVS表現(xiàn)出eNOS的下調(diào)和NO生物利用度的降低[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SAH導(dǎo)致NF-κB的表達(dá)上調(diào)，血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS表達(dá)下調(diào)。阿托伐他汀干預(yù)后下調(diào)NF-κB表達(dá)，上調(diào)eNOS表達(dá)，表明阿托伐他汀可以通過抑制炎癥介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增加NO的合成抗血管痙攣。

阿托伐他汀可改善大鼠SAH后的CVS，推測(cè)可能的機(jī)制是由其下調(diào)NF-κB、上調(diào)eNOS的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，然而，阿托伐他汀的確切分子作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。