基于網(wǎng)絡藥理學探究蓮子心治療高血壓的分子機制

占秋曉，李丹丹，劉 璐，鞠春曉，薛 冰，徐鳳芹

高血壓以體循環(huán)動脈壓升高為特征，并可伴隨心、腦、腎等靶器官損害。我國高血壓診斷標準為收縮壓≥140mmHg(1mmHg=0.133kPa)和(或)舒縮壓≥90 mmHg[1]，而在最新版美國高血壓指南[2-3]中，其診斷標準更為嚴格。高血壓的病因和發(fā)病機制極其復雜，在高血壓的治療過程中，單一靶向某一特定靶點或某一特定因素有時并不能將血壓控制在滿意范圍，對于一些頑固高血壓病人需要3種甚至4種降壓藥連用。中藥具有多組分、多靶點的特點，在治療高血壓等由多基因、多因素導致的疾病中具有優(yōu)勢。

中醫(yī)學中并沒有高血壓這一特定病名，按照癥狀，高血壓在中醫(yī)學分屬“眩暈”“頭痛”“中風”等范疇。中醫(yī)學將高血壓分為肝陽上亢、痰濕內(nèi)盛、瘀血內(nèi)停、肝腎陰虛及腎陽虛衰5個證型，治療時病證結(jié)合、辨證施治。蓮子心為睡蓮科植物蓮成熟種子的綠色胚芽，其味苦、性寒，能清心安神、交通心腎、澀精止血，可用于熱入心包、神昏譫語、心腎不交、失眠遺精、血熱吐血等癥治療中。中醫(yī)學在長期的臨床實踐中也發(fā)現(xiàn)蓮子心具有治療高血壓的作用，這在雷燕等[4]臨床研究中得到證實，此外在高楓等[5]關(guān)于高血壓合并動脈粥樣硬化的臨床實驗中，也發(fā)現(xiàn)蓮子心在治療高血壓的同時還具有抗粥樣硬化作用。網(wǎng)絡藥理學是基于系統(tǒng)生物學理論，對特定生物系統(tǒng)進行網(wǎng)絡分析，用于輔助新藥研發(fā)的一種方法。通過借助網(wǎng)絡藥理學方法不僅可以輔助了解中藥的毒副作用，探索中藥的治療機制，還有助于中藥現(xiàn)代化為臨床用藥提供參考價值[6]。本研究借助網(wǎng)絡藥理學的研究方法探討蓮子心治療高血壓的可能機制，以期為后續(xù)基礎研究及臨床用藥提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 篩選活性成分，構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡 中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)是一個為中藥研究提供在線中藥化學組成、毒藥物動力學(absorption，distribution， metabolism and excretion， ADME)、作用靶點等信息，并捕捉靶點與疾病之間關(guān)系的藥理學平臺，其涵蓋了449味中藥數(shù)據(jù)，通過在TCMSP中輸入需要檢索單味中藥可以較全面地檢索到其化學組分及作用靶點等信息[7]。BATMAN-TCM (a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine， BATMAN-TCM)(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm)也是一個專門用于研究中藥作用靶點的在線生物信息學分析工具[8]。UniProt(Universal Protein， UniProt)(http://www.uniprot.org/)整合了多個數(shù)據(jù)庫的信息，是一個免費在線的較為豐富全面的蛋白數(shù)據(jù)庫。通過借助上述3個平臺，在TCMSP及BATMAN-TCM兩個數(shù)據(jù)庫中檢索蓮子心的化學組成及靶點蛋白信息。隨后將得到的靶點蛋白信息輸入UniProt數(shù)據(jù)庫，在庫中檢索靶點蛋白所對應的靶基因名稱，并通過Cytoscape3.6.1軟件構(gòu)建“藥物-靶點網(wǎng)絡”。

1.2 構(gòu)建疾病-靶點網(wǎng)絡 治療靶標數(shù)據(jù)庫(Therapeutic Target Database， TTD)(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)、比較毒物遺傳數(shù)據(jù)庫(Comparative Toxicogenomics Database，CTD)(http://ctdbase.org/)及DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/)是面向醫(yī)藥等研究領域，并提供疾病、治療靶點及相應藥物的綜合信息平臺。通過借助上述3個數(shù)據(jù)庫，檢索高血壓疾病目前已被證實有治療作用的靶點，并借助Cytoscape3.6.1軟件繪制“疾病-靶點網(wǎng)絡”。

1.3 構(gòu)建藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡及蛋白互作網(wǎng)絡 通過Cytoscape3.6.1將“藥物-靶點網(wǎng)絡”與“疾病-靶點網(wǎng)絡”進行合并，篩選出藥物作用靶點中與高血壓治療靶點重合的靶點，即關(guān)鍵靶點。String 數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)是一個在線搜索已知蛋白質(zhì)直接或間接相互作用的數(shù)據(jù)庫，可用于構(gòu)建蛋白互作(protein protein interaction，PPI)網(wǎng)絡[9]。借助String 數(shù)據(jù)庫，輸入上述關(guān)鍵靶點，物種限定設置為人類，隨后進行PPI網(wǎng)絡構(gòu)建與分析。

1.4 GO功能注釋及KEGG通路富集 注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫(The Database for Annotation， Visualization and Integrated Discovery， DAVID)(https://david.ncifcrf.gov/)能對輸入的基因列表進行分析，從而得到與之相關(guān)的基因本體(gene ontology，GO)功能注釋信息及基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG)通路信息[10]。在上述數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵靶點的基因信息，并對上述關(guān)鍵靶點基因進行GO功能注釋及KEGG通路富集。

2 結(jié) 果

2.1 蓮子心活性成分-靶點網(wǎng)絡構(gòu)建 經(jīng)TCMSP及BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫檢索蓮子心活性成分，其中TCMSP數(shù)據(jù)庫共檢索出31種活性成分，BATMAN-TCM檢索出19種活性成分，剔除掉兩數(shù)據(jù)庫重復及無作用靶點的25種活性成分，最后篩選得到25種有效活性成分，共588個作用靶點，圖1為構(gòu)建的藥物靶點網(wǎng)絡圖。表1中僅列出靶點數(shù)量排名前10位的活性成分。

圖1 蓮子心活性成分-靶點網(wǎng)絡圖

表1 蓮子心中靶點數(shù)量排前10位的活性成分

2.2 高血壓-靶點網(wǎng)絡構(gòu)建 經(jīng)檢索，TTD中共檢索出與高血壓相關(guān)的靶點57個，CTD中共檢索出與高血壓相關(guān)的靶點205個，DRUGBANK數(shù)據(jù)庫中共檢索出與高血壓相關(guān)的靶點172個，將上述靶蛋白輸入UniProt數(shù)據(jù)庫并剔除重復的靶點，最后共得到212個與高血壓相關(guān)的治療靶點。通過Cytoscape3.6.1構(gòu)建高血壓-靶點網(wǎng)絡。詳見圖2。

圖2 高血壓-靶點網(wǎng)絡圖

2.3 高血壓-靶點-蓮子心網(wǎng)絡構(gòu)建 將蓮子心-靶點網(wǎng)絡與高血壓-靶點網(wǎng)絡進行合并，共得到59個關(guān)鍵靶點，并構(gòu)建高血壓-靶點-蓮子心網(wǎng)絡(見圖3)。59個關(guān)鍵靶點通過String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡見圖4。

圖3 高血壓-靶點-蓮子心網(wǎng)絡圖

圖4 關(guān)鍵靶點PPI網(wǎng)絡

2.4 GO功能注釋及KEGG通路富集 在DAVID中對上述關(guān)鍵靶點進行GO功能注釋和KEGG通路富集，P值越小意味著相關(guān)度越高，根據(jù)P值進行排序。圖5為細胞定位、分子功能和生物學過程的GO功能注釋結(jié)果，圖6為KEGG通路富集結(jié)果，均依據(jù)P值大小，選擇P值最小即相關(guān)度最高的10位。圖7為作用于神經(jīng)遞質(zhì)通路關(guān)鍵靶點的細胞定位。

圖5 GO功能注釋

圖6 KEGG通路富集

圖7 多種神經(jīng)遞質(zhì)通路中關(guān)鍵靶點的細胞定位

3 討 論

借助網(wǎng)絡藥理學方法，蓮子心中共篩選出25種活性成分及588個作用靶點，其中59個作用靶點與高血壓的治療靶點一致，即關(guān)鍵靶點。通過對上述59個關(guān)鍵靶點進行GO功能注釋及KEGG通路分析，按照P值進行排名，P值越小排名越靠前，篩選出排名前10位的GO功能注釋及KEGG通路。通過對細胞學組分(cellular components，CC)、分子生物學功能(molecular function，MF)和生物學過程(biological process，BP)進行功能富集分析，該59個關(guān)鍵靶點主要分布于質(zhì)膜、突觸前膜及突觸后膜等部位，具有調(diào)控電壓門控鉀、鈣通道活性及腎上腺素、乙酰膽堿、5-羥色胺等多種神經(jīng)遞質(zhì)受體活性的作用。提示蓮子心治療高血壓的機制可能涉及膜電位的去極化、血管平滑肌張力的調(diào)節(jié)、心肌舒張功能及心率的調(diào)節(jié)、多種神經(jīng)遞質(zhì)的信號轉(zhuǎn)導等生物學過程。通過對KEGG信號通路進行

富集分析，蓮子心治療高血壓的機制可能涉及多種神經(jīng)遞質(zhì)通路、鈣信號通路、cGMP-PKG通路等。

高血壓的治療目的在于控制血壓及保護靶器官，血壓的持續(xù)升高往往涉及一個或多個生理調(diào)控系統(tǒng)失調(diào)。這些影響血壓的調(diào)控系統(tǒng)涉及共同的最終通路，包括中樞及交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活、血管的收縮、腎臟排鈉的調(diào)節(jié)等，此外炎癥與免疫也參與了血壓的調(diào)控過程[11-12]。鈣離子及內(nèi)皮細胞的參與在上述過程中起了重要作用，其中，鈣離子不僅可以通過調(diào)控血管平滑肌的張力參與血壓的調(diào)節(jié)，還可以通過改善心肌舒張功能從而起到保護心肌的作用；NO作為一種血管活性物質(zhì)主要由內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，NO通過激活cGMP-PKG信號通路可使血管平滑肌舒張。而在早期關(guān)于蓮子心降壓或改善高血壓靶器官損害的基礎研究中，認為其治療高血壓的機制可能是通過阻斷α腎上腺素受體及鈣拮抗[13]、清除氧自由基及抗氧化[14]、影響心肌肌漿

網(wǎng)鈣泵活力[15]，從而起到調(diào)控血壓和保護靶器官等作用，近年研究發(fā)現(xiàn)，蓮子心對血管內(nèi)皮也有保護作用[16]。這與通過網(wǎng)絡藥理學預測得到的關(guān)于蓮子心治療高血壓的可能機制是一致的。

中醫(yī)學將高血壓分為5個證型，其中肝陽上亢最為多見[17]，病人表現(xiàn)為頭暈、頭痛、面紅、脾氣急躁、易怒、舌紅苔黃、脈弦細，即大多數(shù)高血壓病人伴有急躁、易怒等情志的改變。將多巴胺、5-羥色胺等多種神經(jīng)遞質(zhì)通路上的關(guān)鍵靶點進行細胞定位分析，發(fā)現(xiàn)主要是位于鈣離子通道上的各種受體亞基以及位于突觸后膜的5-羥色胺及多巴胺受體。5-羥色胺[18]和多巴胺[19]作為神經(jīng)系統(tǒng)重要神經(jīng)遞質(zhì)，它們均參與了情緒調(diào)控的生物過程。突觸前膜內(nèi)囊泡遞質(zhì)的釋放呈鈣離子依賴的量子式釋放，位于突觸前膜的鈣離子通道活性的改變可以影響5-羥色胺及多巴胺等遞質(zhì)的釋放并進而調(diào)控情緒，而位于突觸后膜的5-羥色胺及多巴胺受體活性的改變也可以影響情緒[20]。結(jié)合網(wǎng)絡藥理學分析結(jié)果，蓮子心或許可以通過調(diào)控遞質(zhì)釋放及突觸后膜受體活性而改善高血壓病人急躁、易怒等情緒癥狀。這為后續(xù)探討蓮子心治療高血壓的同時是否能改善高血壓病人伴有的情緒癥狀提供了思考方向。