沉默Beclin1 基因?qū)Ζ?欖香烯抑制人胃癌SGC-7901 細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)自噬的影響

陳璐婷 胡夢(mèng)奕 潘 磊 陳培豐

β-欖香烯由溫郁金（溫莪術(shù)）中提取，具有抗癌作用強(qiáng)、細(xì)胞毒性小、抗癌譜廣等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于臨床治療各種惡性腫瘤及癌性胸腹水。Liu 等[1]研究發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性自噬。Beclin1 基因又稱BECN1 基因，是自噬通路中的重要調(diào)控因子[2]，研究發(fā)現(xiàn)，Beclin1 基因在胃癌呈現(xiàn)高表達(dá)[3]。本課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了Beclin1 的mRNA 在SGC-7901、MKN-45、BGC-835 等多個(gè)胃癌細(xì)胞的表達(dá)水平，結(jié)果顯示在SGC-7901 細(xì)胞中表達(dá)最高，故選用SGC-7901 細(xì)胞為本次實(shí)驗(yàn)的靶細(xì)胞[5]。本研究探討β-欖香烯作用SGC-7901 細(xì)胞前后細(xì)胞增殖和保護(hù)性自噬的變化，以及Beclin1 基因?qū)Ζ?欖香烯抗癌作用和誘導(dǎo)自噬的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株和慢病毒載體 人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所（批號(hào)TCHu 46）。本研究中GV112-NC-shRNA、GV112-Beclin1-shRNA1 慢病毒載體系課題組前期實(shí)驗(yàn)構(gòu)建成功并通過(guò)驗(yàn)證，且經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real Time PCR）及免疫蛋白印跡（Western blot）篩選出對(duì)Beclin1 基因沉默效率最高的慢病毒載體[4]。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 β-欖香烯注射液，購(gòu)自大連華立金港藥業(yè)有限公司（批號(hào)1506221，規(guī)格:20mL:0.1g）。分子式:C15H24，相對(duì)分子量:204.351，以其為本實(shí)驗(yàn)用β-欖香烯母液，濃度為5mg/mL。

1.3 主要試劑及儀器 胎牛血清（澳大利亞Ausbian公司，批號(hào)VS500T）；RPMI-1640 培養(yǎng)液（杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)公司，批號(hào)2017070304）；胰酶[（生工生物工程（上海）公司，批號(hào)T0458-50G]；Puromycin（美國(guó)Clontech 公司，批號(hào)631305）；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，美國(guó)Genview 公司，批號(hào)JT343）；二甲基亞砜（DMSO，上海試一化學(xué)試劑公司，批號(hào)130701）；BCA Protein Assay Kit、RIPA 裂解液（碧云天研究所，批號(hào)P0010S、P0013B）；LC3A/B 抗體（美國(guó)CST 公司，批號(hào)#12741）；GAPDH 抗體（美國(guó)Santa Cruz 公司，批號(hào)sc-47724）；辣根過(guò)氧化酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔多克隆IgG 抗體（美國(guó)Santa Cruz 公司，批號(hào)sc-2004）；倒置顯微鏡（上海蔡康光學(xué)儀器公司，型號(hào)XDS-100）；酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司，型號(hào)M2009PR）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本三洋公司，型號(hào)MCO-175）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人胃癌SGC-7901 細(xì)胞置于體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

2.2 細(xì)胞感染 SGC-7901 細(xì)胞分為以下三組:空白對(duì)照組，未做特殊處理、常規(guī)培養(yǎng)的SGC-7901 細(xì)胞；陰性對(duì)照組，感染非特異性短發(fā)夾樣RNA（shRNA）慢病毒載體GV112-NC-shRNA 的SGC-7901 細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組，感染GV112-Beclin1-shRNA1 慢病毒載體（即前期實(shí)驗(yàn)篩選出的對(duì)Beclin1 基因沉默效率最高的慢病毒載體） 的SGC-7901 細(xì)胞。將SGC-7901 細(xì)胞接種于12 孔板中培養(yǎng)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)所得的最佳感染參數(shù)[感染條件:Eni.S+polybrene，感染復(fù)數(shù)（MOI）:20]，取GV112-Beclin1-shRNA1 和GV112-NC-shRNA 慢病毒顆粒各4μL，分別感染實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組胃癌細(xì)胞，觀察細(xì)胞狀態(tài)，未出現(xiàn)細(xì)胞毒性反應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)并于感染后16h 換液；若出現(xiàn)細(xì)胞毒性則立即換液。感染72h 后換用含嘌呤霉素（Puromycin，3μg/mL）的培養(yǎng)基進(jìn)行藥篩處理，至空白對(duì)照組細(xì)胞全部被殺死后（大約24h），收集存活的細(xì)胞并擴(kuò)增培養(yǎng)建立穩(wěn)定表達(dá)GV112-shRNABeclin1 及陰性對(duì)照質(zhì)粒GV112-shRNA-NC 的細(xì)胞模型。

2.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

2.3.1 劑量依賴實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞并用胰酶消化處理，完全培養(yǎng)基重懸制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。取96 孔板鋪板，細(xì)胞密度為10000 細(xì)胞數(shù)/孔（cell/well），100μL。統(tǒng)一鋪好后，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)37℃、5%CO2培養(yǎng)24h。分為空白對(duì)照組、空白對(duì)照加藥組（加入β-欖香烯藥物濃度分別為10、20、50、100μg/mL），每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。藥物作用細(xì)胞24h后，每孔加入20μL 濃度為5mg/mL 的MTT 溶液。孵育4h 后徹底吸盡培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO。經(jīng)振蕩器震蕩3～5min 后，用酶標(biāo)儀490nm 檢測(cè)OD值，計(jì)算抑制率。

2.3.2 β-欖香烯聯(lián)合Beclin1 shRNA 實(shí)驗(yàn) 胰酶消化陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組胃癌細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液，取96 孔板鋪板，細(xì)胞密度為10000cell/well，100μL。統(tǒng)一鋪好后，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)37℃、5%CO2培養(yǎng)24h。取上述MTT 實(shí)驗(yàn)中最佳濃度的β-欖香烯處理胃癌細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照不加藥組（即陰性對(duì)照組SGC-7901 胃癌細(xì)胞，不加藥）、陰性對(duì)照加藥組（即陰性對(duì)照組SGC-7901 胃癌細(xì)胞，加入濃度為100μg/mL 的β-欖香烯藥物）；實(shí)驗(yàn)不加藥組（即實(shí)驗(yàn)組SGC-7901 胃癌細(xì)胞，不加藥）、實(shí)驗(yàn)加藥組（即實(shí)驗(yàn)組SGC-7901 胃癌細(xì)胞，加入濃度為100μg/mL的β-欖香烯藥物），每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。加藥處理24h后每孔加入20μL 濃度為5mg/mL 的MTT 溶液。孵育4h 后徹底吸盡培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO。經(jīng)振蕩器震蕩3～5min 后，用酶標(biāo)儀490nm 檢測(cè)OD值，計(jì)算抑制率。細(xì)胞抑制率=（1-OD加藥組/OD對(duì)照組）×100%。

表1 針對(duì)Beclin1 基因的shRNA 和陰性對(duì)照shRNA

2.4 Western blot 檢測(cè)LC3-II、P62 蛋白 收集空白對(duì)照組、空白對(duì)照加藥組、實(shí)驗(yàn)加藥組、陰性對(duì)照加藥組的胃癌細(xì)胞，提取總蛋白并測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取相同質(zhì)量的蛋白樣品上樣SDS-PAGE 凝膠（12%分離膠，5%濃縮膠）電泳分離。電泳結(jié)束后，使用轉(zhuǎn)移電泳裝置，在4℃、300mA 恒流條件下電轉(zhuǎn)150min，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用封閉液（含5%脫脂牛奶的TBST 溶液）4℃下封閉PVDF 膜過(guò)夜，孵育一抗、二抗。PVDF 膜置于平鋪好的保鮮膜上，以1:40的比例混合ECL 試劑盒中的A 液和B 液，混合液均勻滴加在PVDF 膜上，避光反應(yīng)5min。將膜取出，稍稍瀝干多余的ECL 底物反應(yīng)液，放入暗盒，鋪上保鮮膜，放上X 光片，關(guān)上暗盒，曝光1～2min。取出X 光片，放入顯影液中，約1min 后取出，在清水中漂洗幾min，后放入定影液中至少2min，取出X 光片再次用清水漂洗，晾干。以GAPDH 為內(nèi)參。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 重組慢病毒質(zhì)粒的鑒定 前期實(shí)驗(yàn)中，課題組根據(jù) Genebank 提供的人 Beclin1 基因信息（NM_003766）設(shè)計(jì)3 條小干擾RNA（siRNA）序列，同時(shí)選用公認(rèn)陰性對(duì)照序列。合成上述序列的短發(fā)夾RNA（shRNA），分別命名為Beclin1-shRNA1、Beclin1-shRNA2、Beclin1-shRNA3，NC-shRNA（見(jiàn)表1）。退火反應(yīng)生成dsDNA，將獲得的dsDNA 連接到經(jīng)Age I、EcoR I 雙酶切的GV112 載體，即獲得Beclin1-shRNA 慢病毒載體，分別命名為實(shí)驗(yàn)1（GV112-Beclin1-shRNA1）、實(shí)驗(yàn)2（GV112-Beclin1-shRNA2）、實(shí)驗(yàn)3（GV112-Beclin1-shRNA3）、陰性對(duì)照（GV112-NC-shRNA）。經(jīng)陽(yáng)性克隆的PCR 鑒定及測(cè)序分析驗(yàn)證，Beclin1 基因RNAi 慢病毒載體構(gòu)建成功。

3.2 基因沉默效果鑒定 Real Time PCR 檢測(cè)慢病毒感染后各組SGC-7901 細(xì)胞Beclin1 相對(duì)表達(dá)量，以陰性對(duì)照組（感染GV112-NC-shRNA 的SGC-7901 細(xì)胞）作為對(duì)照，采用2-ΔΔCt 法分析比較，結(jié)果顯示，相對(duì)于陰性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)1 組（感染GV112-Beclin1-shRNA1 的SGC-7901 細(xì)胞）、實(shí)驗(yàn)2 組（感染GV112-Beclin1-shRNA2 的SGC-7901 細(xì)胞）、實(shí)驗(yàn)3 組（感染GV112-Beclin1-shRNA3 的SGC-7901細(xì)胞）的Beclin1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.01，見(jiàn)表2）。其中實(shí)驗(yàn)1 組Beclin1 基因沉默效率達(dá)91.8%，判定實(shí)驗(yàn)1 為最有效干擾載體。為進(jìn)一步確定穩(wěn)定篩選是否成功，選取最有效干擾載體實(shí)驗(yàn)1組和陰性對(duì)照組行Western blot 檢測(cè)，兩組樣本GAPDH 蛋白表達(dá)一致，實(shí)驗(yàn)1 組Beclin1 目的條帶明顯減弱（見(jiàn)圖1），證明在蛋白質(zhì)水平實(shí)驗(yàn)1 沉默目的基因有效。

圖1 Western blot 鑒定實(shí)驗(yàn)1 組Beclin1 蛋白表達(dá)

表2 感染重復(fù)3 次Beclin1 基因相對(duì)表達(dá)量（）

表2 感染重復(fù)3 次Beclin1 基因相對(duì)表達(dá)量（）

注:陰性對(duì)照組為感染GV112-NC-shRNA 的SGC-7901 細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)1組為感染GV112-Beclin1-shRNA1 的SGC-7901 細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)2 組為感染GV112-Beclin1-shRNA2 的SGC-7901 細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)3 組為感染GV112-Beclin1-shRNA3 的SGC-7901 細(xì)胞；與陰性對(duì)照組比較，aP＜0.01

3.3 β-欖香烯抑制SGC-7901 細(xì)胞增殖作用 不同濃度的β-欖香烯作用人胃癌SGC-7901 細(xì)胞，24h后測(cè)定OD 值，計(jì)算抑制率。結(jié)果顯示，β-欖香烯能夠抑制胃癌細(xì)胞增殖，且抑制作用隨濃度的增加而遞增。濃度20、50、100μg/mL 時(shí)的抑制率分別為21.5%、31.7%和37.4%，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。濃度為10μg/mL 時(shí)抑制率14.0%，與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 MTT 法檢測(cè)不同濃度β-欖香烯對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響（）

表3 MTT 法檢測(cè)不同濃度β-欖香烯對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響（）

注:與0μg/mL 比較，bP＜0.05，bbP＜0.01

3.4 β-欖香烯誘導(dǎo)SGC-7901 細(xì)胞發(fā)生自噬作用選用濃度為100μg/mL 的β-欖香烯作用于SGC-7901 細(xì)胞，24h 后Western blot 檢測(cè)LC3-Ⅱ、P62 蛋白表達(dá)。與空白對(duì)照組比較，經(jīng)β-欖香烯處理24h后，空白對(duì)照加藥組的LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，P62 蛋白表達(dá)下降（見(jiàn)圖2），表明β-欖香烯在抑制胃癌SGC-7901 增殖的同時(shí)，也誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。

圖2 Western blot 檢測(cè)β-欖香烯處理SGC-7901 細(xì)胞后LC3-Ⅱ、P62 的蛋白表達(dá)

3.5 GV112-Beclin1-shRNA1 感染SGC-7901 細(xì)胞慢病毒感染人胃癌SGC-7901 細(xì)胞72h 后，加入Puromycin 進(jìn)行藥篩處理，維持藥物濃度為3μg/mL，24h 后未感染慢病毒的空白對(duì)照組細(xì)胞全部死亡，感染重組慢病毒后的細(xì)胞存活且狀態(tài)良好（見(jiàn)圖3）。

圖3 倒置顯微鏡下，嘌呤霉素篩選后人胃癌SGC-7901 細(xì)胞的存活情況（×100 明亮視野）

3.6 沉默Beclin1 基因?qū)Ζ?欖香烯誘導(dǎo)自噬及抗癌效果的影響 GV112-Beclin1-shRNA1、GV112-NCshRNA 慢病毒顆粒感染SGC-7901 細(xì)胞后，Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)下降，P62 蛋白表達(dá)升高（見(jiàn)圖4），表明沉默Beclin1 基因可抑制胃癌細(xì)胞的自噬活性。加入濃度為100μg/mL 的β-欖香烯，24h 后采用Western blot 檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白。與陰性對(duì)照加藥組比較，實(shí)驗(yàn)加藥組的LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平明顯下降，P62 蛋白表達(dá)增加（見(jiàn)圖4），表明自噬作用受到抑制。MTT 結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)加藥組細(xì)胞抑制率42.3%，陰性對(duì)照加藥組的細(xì)胞抑制率為36.1%，實(shí)驗(yàn)加藥組對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制效果強(qiáng)于陰性對(duì)照加藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表4。

圖4 沉默Beclin1 基因?qū)?xì)胞自噬及β-欖香烯自噬誘導(dǎo)作用的影響

表4 MTT 法檢測(cè)沉默Beclin1 基因?qū)Ζ?欖香烯抑制胃癌增殖的影響

4 討論

欖香烯注射液，由姜科植物溫郁金（溫莪術(shù)）中提取，以β-欖香烯為主要成分。本研究顯示，β-欖香烯對(duì)人胃癌SGC-7901 細(xì)胞有明顯的抑制增殖的作用，且該作用隨著β-欖香烯濃度的升高而增強(qiáng)，呈現(xiàn)劑量依賴性。自噬（Autophagy）被稱為Ⅱ型程序性死亡，是細(xì)胞降解并回收利用長(zhǎng)壽蛋白質(zhì)及細(xì)胞器等成分而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的分解代謝過(guò)程，與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病有密切的關(guān)聯(lián)[5-6]。LC3 是自噬的標(biāo)志性因子，自噬發(fā)生時(shí)，LC3-I 酯化形成LC3-II 并定位于自噬體的膜上，LC3-II 的高低可反映自噬水平[6]。P62 是評(píng)價(jià)自噬體降解的重要指標(biāo)，當(dāng)自噬被激活時(shí)，P62 會(huì)與泛素化的蛋白質(zhì)及自噬體膜上的LC3-Ⅱ結(jié)合形成復(fù)合物，在自噬溶酶體內(nèi)完成降解過(guò)程[7]，P62 的表達(dá)水平與自噬活化程度呈負(fù)相關(guān)。本研究選用100μg/mL 的β-欖香烯作用于SGC-7901細(xì)胞，觀察到LC3-Ⅱ蛋白明顯增加，P62 蛋白明顯下降，提示β-欖香烯誘導(dǎo)SGC-7901 細(xì)胞發(fā)生了自噬，通過(guò)慢病毒顆粒感染SGC-7901 細(xì)胞后，加入β-欖香烯后細(xì)胞自噬活性較前增強(qiáng)，從而再次證明欖香烯誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生。

研究顯示，自噬在腫瘤細(xì)胞中具有抑制和保護(hù)的雙重作用，自噬與惡性腫瘤的關(guān)系可以根據(jù)腫瘤微環(huán)境、腫瘤類型和其他因素的變化而變化。有學(xué)者提出，在腫瘤早期，細(xì)胞自噬可以通過(guò)消除突變或受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器等成分以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、抑制腫瘤發(fā)展；在進(jìn)展期，當(dāng)腫瘤細(xì)胞處于營(yíng)養(yǎng)匱乏、缺氧及抗腫瘤治療等應(yīng)激環(huán)境時(shí)，升高的自噬活性通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)能量和代謝產(chǎn)物循環(huán)利用，協(xié)助癌細(xì)胞逃避損害，維持腫瘤的生長(zhǎng)，即保護(hù)性自噬[8]。亦有研究表明，藥物誘導(dǎo)的自噬既可以是自噬性細(xì)胞死亡，也可以是保護(hù)性自噬拮抗其抗腫瘤活性[9]。

自噬的發(fā)生受到多種分子機(jī)制的調(diào)控影響，其中Beclin1 基因起到重要作用[10]。Beclin1 是自噬過(guò)程的正向調(diào)控基因[11]，通過(guò)與PI3K3 結(jié)合形成復(fù)合物，參與吞噬泡的聚集與組裝，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[12]。研究證實(shí)，上調(diào)Beclin1 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)能夠刺激自噬的發(fā)生，而沉默Beclin1 基因則會(huì)引起自噬水平的降低[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默Beclin1 基因可下調(diào)SGC-7901 細(xì)胞的自噬活性，并可抑制β-欖香烯對(duì)SGC-7901 細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用，但增強(qiáng)β-欖香烯對(duì)SGC-7901 細(xì)胞增殖的抑制作用。由此認(rèn)為，β-欖香烯誘導(dǎo)SGC-7901 細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性自噬，這與Liu等[1]研究結(jié)果一致，沉默Beclin1 基因的表達(dá)能夠增強(qiáng)β-欖香烯的抗癌作用。

綜上所述，β-欖香烯能夠劑量依賴性的抑制胃癌細(xì)胞增殖，在抑制增殖的同時(shí)也誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性自噬，Beclin1 基因或?yàn)槠湔T導(dǎo)保護(hù)性自噬的靶點(diǎn)。沉默Beclin1 基因能夠抑制保護(hù)性自噬的發(fā)生，并且提高β-欖香烯的抗腫瘤增殖作用。