多階導數(shù)紫外光譜法快速測定生物轉化液中的肉桂醇、肉桂醛和肉桂酸

江艷艷，粟桂嬌，馬 麗,，黃秋容，于 唱，李麗麗

（1.廣西大學化學化工學院，廣西 南寧 530004；2.廣西大學生命科學與技術學院，廣西 南寧 530004）

天然香料以其綠色、安全、環(huán)保等特點，日益受到消費者的青睞。采用物理提取的方法從動、植物體內(nèi)獲取的天然香料遠不能滿足人們的消費需求。利用微生物轉化技術獲得的香料可視為“天然品”[1-3]，附加值高，是天然香精香料研究領域關注的焦點[4-6]。在微生物轉化以應中，高效生產(chǎn)菌株的篩選是開展微生物轉化研究的前提，可以通過監(jiān)測轉化體系實現(xiàn)，但工作量非常繁重。因此，建立用于監(jiān)測生物轉化體系的簡便、快捷、有效的分析方法，對于實驗菌株的高效篩選具有非常重要的意義。

肉桂醇是風信子香精的主香劑，在香石竹、玫瑰、茉莉、鈴蘭、葵花、紫丁香等香精中也經(jīng)常使用，還可用于杏子、桃子、草莓、檸檬等食品及白蘭地酒用香精中[7]。通過肉桂醛選擇性加氫制備肉桂醇，一直以來是催化領域研究的熱點[8-9]，但通過化學催化法得到的肉桂醇不能視為“天然品”，產(chǎn)品附加值低。利用微生物轉化可以實現(xiàn)由肉桂醛選擇加氫制備肉桂醇，開辟了天然肉桂醇的新來源[10-12]。篩選高活性菌株是提高轉化以應轉化率和以應選擇性的有效手段。在微生物轉化肉桂醛的以應中，肉桂醛容易被氧化成肉桂酸，與產(chǎn)物肉桂醇同時存在。文獻報道同時測定肉桂醇、肉桂醛和肉桂酸3 個組分的分析方法主要為色譜法[13-15]。雖然色譜法靈敏度高、可信度強，但設備價格昂貴，樣品需要進行前分離處理，操作繁瑣耗時，在生物轉化的前期篩菌工作中需要投入較高的成本和精力。

紫外分光光度法操作簡便、迅速，廣泛應用于食品、藥品及精細化學品等的分析[16-18]。但是直接掃描肉桂醇、肉桂醛、肉桂酸3 個組分得到的紫外光譜相互重疊，而且由于生物轉化液含有多種有機培養(yǎng)基及無機鹽，成分復雜，對產(chǎn)物的測定會造成一定的干擾，因此，紫外分光光度法不能直接用于實驗菌株的篩選。

導數(shù)光譜是通過對吸收光譜進行一階或多階求導變換獲得，是紫外吸收光譜派生的一個分支。導數(shù)光譜法能從重疊的吸收光譜中分離出多組分樣品各自對應的吸收峰，排除背景和基質(zhì)的干擾，提高重疊譜帶及平坦譜帶的分辨率，可用于定性鑒別和定量分析[19-21]。復雜的多組分試樣可不經(jīng)分離直接用導數(shù)光譜法進行測定，方法簡便、快速、準確，可大大節(jié)省試劑、時間和人力，被廣泛用于藥品[22-25]、食品[26-29]和生物質(zhì)[30]的分析。但其用于篩選微生物轉化菌株的研究還鮮有報道。本研究利用導數(shù)光譜法的特點，對3 個組分的紫外吸收光譜進行二階或三階導數(shù)處理，不僅解決了肉桂醇、肉桂醛、肉桂酸3 個組分紫外光譜相互重疊的問題，還消除了轉化液培養(yǎng)基對檢測的干擾，實現(xiàn)了3 個組分的快速測定。利用該方法對微生物轉化樣品直接進行測定，操作簡便快捷、成本低、實用性強，可大大提高利用微生物轉化肉桂醛制備天然肉桂醇前期篩菌工作的效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉桂醇標準品（98%）、肉桂酸標準品（純度≥99.5%） 國藥集團化學試劑有限公司；肉桂醛標準品（98%） 上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇（分析純） 廣東光華科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

8453紫外-可見分光光度計 美國Agilent公司；Precisa XB120A分析天平 上海精科天美儀器有限公司；3-18K臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

培養(yǎng)液空白溶液：以培養(yǎng)實驗菌株的液體培養(yǎng)基作為培養(yǎng)液空白溶液；單一標準品儲備液：準確稱取肉桂醇、肉桂醛和肉桂酸標準品適量，以無水乙醇為溶劑，配制成質(zhì)量濃度分別為109.4、103.0、102.7 mg/L的標準液，將其作為儲備液備用。

1.3.2 樣品的制備

在肉桂醛生物轉化后的以應液中加入等體積的無水乙醇，充分振蕩混勻后，8 000 r/min離心20 min，取上清液稀釋到一定濃度后用于紫外光譜的測定。

1.3.3 紫外光譜的采集

準確移取肉桂醇、肉桂醛和肉桂酸標準儲備液0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL分別置于10 mL容量瓶中，無水乙醇作溶劑，配制成系列不同質(zhì)量濃度的標準液。于200～400 nm波長范圍內(nèi)分別測定各組分的紫外吸收光譜。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將所測紫外光譜數(shù)據(jù)導出，然后采用Origin軟件對數(shù)據(jù)作多階求導處理。

2 結果與分析

2.1 各組分檢測波長的選擇

2.1.1 多組分紫外吸收光譜

將肉桂醇、肉桂醛、肉桂酸、培養(yǎng)液空白以及各組分的混合物進行紫外掃描，其紫外吸收光譜如圖1所示。

圖1 紫外吸收光譜Fig. 1 UV absorption spectra

由圖1可看出，以應體系中各組分的紫外吸收光譜相互之間均有部分重疊，難以分辨。

2.1.2 肉桂醛、肉桂酸檢測波長的選擇

紫外吸收光譜的導數(shù)光譜能夠有效消除被測組分與共存組分因重疊所帶來的吸收干擾。為此，對肉桂醇、肉桂醛、肉桂酸及培養(yǎng)液空白的紫外吸收光譜進行二階求導得到相應的二階導數(shù)光譜，如圖2所示。

圖2 二階導數(shù)光譜Fig. 2 Second-order derivative spectra

由圖2可看出，在230～400 nm波長范圍內(nèi)，培養(yǎng)液空白的吸光度二階導數(shù)值為零，對樣品中其余3 個組分肉桂醛、肉桂酸和肉桂醇的檢測沒有干擾。

在300～350 nm波長范圍，進一步考察不同質(zhì)量濃度肉桂酸、肉桂醛和肉桂醇3 個組分的二階導數(shù)光譜圖，如圖3所示。

圖3 不同質(zhì)量濃度下肉桂酸、肉桂醛和肉桂醇二階導數(shù)光譜Fig. 3 Second-order derivative UV spectra of cinnamaldehyde and cinnamic acid at different concentrations

由圖3可知，在300～350 nm波長范圍內(nèi)，不同質(zhì)量濃度肉桂醇的二階導數(shù)值始終趨近于0，肉桂醇的紫外吸光度二階導數(shù)值不會干擾肉桂醛和肉桂酸的測定；在306 nm波長處，不同質(zhì)量濃度的肉桂醛二階導數(shù)光譜都相交于一點，且該點的二階導數(shù)值為零，因此，在306 nm波長處檢測肉桂酸，其紫外吸收的二階導數(shù)值不受肉桂醛的干擾，故選取306 nm作為肉桂酸的檢測波長；在320 nm波長處，不同質(zhì)量濃度肉桂酸所對應的吸光度趨于零，同理可選取320 nm作為肉桂醛的檢測波長。

2.1.3 肉桂醇的檢測波長的選擇

由于培養(yǎng)液空白、肉桂醇、肉桂醛和肉桂酸的二階導數(shù)光譜在200～300 nm波長范圍內(nèi)均有吸收，且吸收峰相互重疊，無法定量分析肉桂醇含量。因此，對4 種物質(zhì)的紫外吸收光譜進行三階求導，得到的三階導數(shù)光譜如圖4所示。

圖4 三階導數(shù)光譜Fig. 4 Third-order derivative UV spectra

由圖4可知，在235～275 nm波長范圍內(nèi)，培養(yǎng)液空白、肉桂醛和肉桂酸的紫外吸收三階導數(shù)值都趨于零，對肉桂醇的紫外吸收三階導數(shù)值的測定無干擾，故實驗選取干擾最小且有最大紫外吸收三階導數(shù)值的256 nm作為肉桂醇的檢測波長。

2.2 工作曲線線性回歸方程

按2.1.2節(jié)所述方法獲得肉桂酸和肉桂醛的二階導數(shù)光譜，分別選取肉桂酸在306 nm和肉桂醛在320 nm波長處的二階導數(shù)值為定量指標，分別建立肉桂酸和肉桂醛的紫外吸收二階導數(shù)值YII對質(zhì)量濃度C（mg/L）的工作曲線的線性回歸方程；按2.1.3節(jié)所述方法獲得肉桂醇的三階導數(shù)光譜，選取肉桂醇在256 nm波長處的三階導數(shù)值為定量指標，建立肉桂醇的紫外吸收三階導數(shù)值YIII對質(zhì)量濃度C（mg/L）的工作曲線的線性回歸方程，結果如表1所示。

表1 線性回歸方程、線性范圍及相關系數(shù)Table 1 Linear regression equations, linear ranges and correlation coefficients

2.3 精密度實驗

在低、中、高不同質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，取不同質(zhì)量濃度的肉桂酸、肉桂醛和肉桂醇溶液各3 份。在306 nm和320 nm波長處分別測定肉桂酸和肉桂醛的吸光度二階導數(shù)值，在256 nm波長處測定肉桂醇的吸光度三階導數(shù)值，并分別計算測量結果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果如表2所示，各組分的RSD（n=6）均不超過5%，具有良好的重復性。

表2 精密度測定（n=6）Table 2 Precision of the presented method (n= 6)

2.4 回收率實驗

模擬肉桂醛轉化體系，在培養(yǎng)液空白液中分別加入一定量的肉桂醛（3.78 mg/L）、肉桂酸（1.93 mg/L）、肉桂醇（2.16 mg/L），分別按低、中、高3 個質(zhì)量濃度加入各組分的標準溶液進行測定，結果見表3。肉桂醛、肉桂酸和肉桂醇平均回收率分別為103.3%、104.1%和98.0%，RSD分別為4.1%、2.1%和3.5%。

表3 回收率測定（n=3）Table 3 Recoveries of the method (n= 3)

2.5 樣品的測定

按1.3.2節(jié)方法處理3 批不同質(zhì)量濃度的樣品，并按1.3.3節(jié)方法對樣品進行紫外掃描和分析處理，平行測定6 次，結果如表4所示，其RSD（n=6）均小于4%，表明該方法穩(wěn)定可靠。

表4 樣品測定結果（n=6）Table 4 Quantitative results for actual samples (n= 6)

3 結 論

實驗表明，通過對紫外吸收光譜進行數(shù)學變換為多階導數(shù)光譜測定生物轉化液中的肉桂醛、肉桂酸和肉桂醇，不僅能夠消除在生物催化以應中的媒介（培養(yǎng)液空白）對樣品測定的干擾，同時也能消除各組分樣品相互影響所帶來的測定誤差。該方法操作簡單、準確度高、適用性強，相比于傳統(tǒng)的色譜法，避免了萃取、分離等繁瑣操作以及價格昂貴、成本高、分析時間過長所帶來的不便，適合頻繁和大量的前期篩菌工作的測量，能夠廣泛使用。