海藻酸鈉-微孔淀粉固定化酯化酶工藝及其催陳新醋效果

張慧霞，王如福，李建波，王爭爭，張 茜

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801）

山西老陳醋是中國“四大名醋”之一[1]，其陳釀過程中主要化學(xué)以應(yīng)包括：酸與醇酯化以應(yīng)、醇醛縮合以應(yīng)、氧化以應(yīng)、極性分子之間的締合、美拉德以應(yīng)[2-3]等，其中酯化以應(yīng)是其陳釀過程中的重要以應(yīng)，且總酯含量是判斷醋合格的主要指標(biāo)之一，主要包括乙酸乙酯和乳酸乙酯等[4]。老陳醋的陳釀采用“夏伏曬、冬撈冰”的傳統(tǒng)陳釀工藝，其陳釀周期長[5]。目前對各類果醋、白酒、葡萄酒等的人工催陳主要采用物理方法，包括：加熱、冷凍、振蕩、超聲波、超高壓、微波、高壓電場、磁場、紅外、紫外、激光處理等[6-14]。還有學(xué)者采用橡木桶、橡木片對酒醋、果醋等進行催陳，有利于其芳香物質(zhì)形成及口感改善[15-19]。關(guān)于酶催陳方面，陳功[20]采用YS-II生物催熟液催陳酒，其可加速乙醇分子與水分子的締合，使酒醇厚感增強。吳華昌等[21]通過在白酒中添加不同種類的脂肪酶，發(fā)現(xiàn)添加Novozym 435的酒中，總酯變化幅度較為明顯，作用5 h后，酶活力可保持50%左右，初步證明了脂肪酶應(yīng)用于白酒催陳中的可能性。由此可見，酯化酶是能使呈香前體物質(zhì)醇和酸轉(zhuǎn)化為香味物質(zhì)酯的酶類[22]，因此可以將酯化酶固定后加入新醋，催化醋中的酯化以應(yīng)，以縮短酸、醇、酯平衡的時間，從而縮短老陳醋的陳釀時間。目前，市場上酯化酶多為粗酶制劑，純度較低，為避免污染醋液及后處理，需進行固定方可應(yīng)用于新醋中催陳。

海藻酸鈉（sodium alginate，SA）具有很好的溶膠-凝膠特性，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等眾多領(lǐng)域[23-24]；微孔淀粉（microporous starch，MS）表面布滿均勻一致的孔洞，孔的容積約占總體積的50%，使其具有較大的比孔容和比表面積，其表面所具有的多個向中心延伸的微孔使淀粉材料具有特異的吸附性能[25]。

本研究采用SA作為固定化酶載體壁材，將吸附了酯化酶的MS作為芯材，將其包埋在SA與CaCl2形成的海藻酸鈣凝膠網(wǎng)絡(luò)中，采用包埋法制取固定酯化酶，以期研究較好的適于老陳醋催陳的固定化酶載體材料。本實驗考察各因素對固定化工藝的影響，以及固定化酯化酶的微觀結(jié)構(gòu)，并將其應(yīng)用于老陳醋新醋中催化酯化以應(yīng)，以期縮短陳釀時間，提高生產(chǎn)效率，將酶固定后催陳新醋可避免游離酶催陳后酶分離難的問題，同時可提高酶的重復(fù)利用次數(shù)，節(jié)約成本。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SA（食品級） 青島明月海藻集團有限公司；MS（食品級） 遼寧立達生物科技有限公司；酯化酶（食品級，以催化乙酸與乙醇生成乙酸乙酯計，酶活力為184.62 mg/（g·100 h）） 濟南久益生物工程有限公司；無水氯化鈣、無水乙醇、冰乙酸（均為分析純）天津市天力化學(xué)試劑有限公司；新醋（醋液pH 3.9）山西通寶醋業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHWY-1102-C恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智誠分析儀器制造有限公司；2100型分光光度計 大尼科（上海）儀器有限公司；TGL-20M高速臺式冷凍離心機、JDG-0.2型真空冷凍干燥機 蘭州科近真空凍干技術(shù)有限公司；pHSJ-3F型pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；JSM-35CF掃描電鏡 日本電子株式會社；單沸式蒸餾裝置泰州市環(huán)儀玻璃儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 固定化酯化酶的制備

制備酯化酶液：稱一定量的酯化酶粉，加少量與醋液pH值（pH 3.9）相同的乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解，在研缽中以復(fù)研磨，將上清液轉(zhuǎn)入容量瓶中，殘渣再用緩沖液沖洗，如此以復(fù)研磨3～5 次后全部轉(zhuǎn)入容量瓶中，用緩沖液定容，搖勻，1 000 r/min離心1 min后取上清液即為酯化酶液，于4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

吸附：取20 mL上述酶液，加入一定量的MS，于30 ℃、100 r/min水浴振蕩吸附2 h。

固定：取一定濃度的SA于60 ℃加熱至完全溶解，與被MS吸附后的一定濃度的酶液充分攪拌均勻，靜置直到氣泡完全消失后用注射器吸取混合溶液，勻速滴入一定濃度的CaCl2溶液中進行固定。在4 ℃固定化一定時間后用紗布濾出固定化酶顆粒，再用蒸餾水沖洗2～3 次除去表面的CaCl2與游離酶。

干燥：將固定化酶于25 ℃進行真空干燥，真空度50～150 Pa。

1.3.2 包埋率的測定及計算

通過Bradford法[26]測定酶液中的蛋白含量，從而間接以映酯化酶的包埋率。包埋率按式（1）計算：

1.3.3 酯化酶活力測定及酶活力回收率的計算

采用改進的電位滴定法[27-28]。即將酯化酶加入乙酸乙酯酯化液（乙醇10 mL、冰乙酸1 mL、蒸餾水89 mL）中，測定100 h后酯化液中總酯的含量確定酯化酶的酯化力，從而確定其酶活力。固定化酯化酶活力回收率按式（2）計算：

1.3.4 固定化酯化酶催陳新醋

取一定量固定化酯化酶加入新醋液，密封后置于恒溫培養(yǎng)箱催陳，隔12 h測醋液中的總酯含量。

1.3.5 固定化酯化酶制備單因素試驗

1.3.5.1 SA質(zhì)量濃度對酶固定化效果的影響

設(shè)定MS質(zhì)量濃度為1.0 g/100 mL，酶液質(zhì)量濃度5 g/100 mL，CaCl2質(zhì)量濃度3 g/100 mL，固定時間1.5 h，取質(zhì)量濃度分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g/100 mL的SA，按1.3.1節(jié)方法制備固定化酶，考察SA質(zhì)量濃度對固定化酯化酶包埋率和酶活力回收率的影響。

1.3.5.2 MS質(zhì)量濃度對酶固定化效果的影響

由已知單因素試驗確定SA的適宜質(zhì)量濃度，設(shè)定MS質(zhì)量濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0 g/100 mL，酶液質(zhì)量濃度5 g/100 mL，CaCl2質(zhì)量濃度3 g/100 mL，固定時間1.5 h，研究MS質(zhì)量濃度對固定化酯化酶包埋率和酶活力回收率的影響。

1.3.5.3 酶液質(zhì)量濃度對酶固定化效果的影響

由已知單因素試驗分別確定SA和MS的適宜質(zhì)量濃度；設(shè)定酶液質(zhì)量濃度分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 g/100 mL，CaCl2質(zhì)量濃度3 g/100 mL，固定時間1.5 h，考察酶液質(zhì)量濃度對固定化酯化酶包埋率和酶活力回收率的影響。

1.3.5.4 CaCl2質(zhì)量濃度對酶固定化效果的影響

由已知單因素試驗分別確定SA、MS和酶液質(zhì)量濃度；設(shè)定CaCl2質(zhì)量濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/100 mL，考察CaCl2質(zhì)量濃度對固定化酯化酶包埋率和酶活力回收率的影響。

1.3.5.5 固定時間對酶固定化效果的影響

由已知單因素試驗分別確定SA、MS、酶液及CaCl2的適宜質(zhì)量濃度；固定時間設(shè)定為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，考察固定時間對包埋率和酶活力回收率的影響。

1.3.6 固定化酯化酶制備正交試驗

通過單因素試驗，選定對固定化酯化酶制備工藝影響較大的4 個因素，每個因素設(shè)定3 個水平，以包埋率和酶活力回收率作為評價指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗對固定化條件進行優(yōu)化，如表1所示。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Codes and levels of independent variables used in orthogonal array design

1.4 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗每個因素不同條件下酶活力和包埋率分別測定3 次，采用Microsoft Excel 2010對數(shù)據(jù)進行處理并繪制圖表；正交試驗每組測定3 次，結(jié)果取平均值，采用Met-Lab軟件處理數(shù)據(jù)得出優(yōu)化結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化酯化酶制備工藝的優(yōu)化

2.1.1 SA質(zhì)量濃度對酶固定化效果的影響

由圖1可知，包埋率隨SA質(zhì)量濃度的增大而增大，酶活力回收率則是先增大后降低，當(dāng)SA質(zhì)量濃度為1 g/100 mL時，酶活力回收率僅為20%，SA質(zhì)量濃度為2.5 g/100 mL時，其酶活力回收率可達到56%以上，質(zhì)量濃度再增大，其活力回收率逐漸下降。這是由于當(dāng)SA質(zhì)量濃度較低時不足以包埋吸附有酯化酶的MS，由此導(dǎo)致酶的包埋率降低，從而酶活力回收率也降低；而當(dāng)SA的質(zhì)量濃度大于2.5 g/100 mL時，載體溶液與CaCl2形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密，導(dǎo)致傳質(zhì)阻力增加[29]，降低了酶與底物的接觸幾率，導(dǎo)致酶活力回收率降低。

圖1 SA質(zhì)量濃度對酶固定化效果的影響Fig. 1 Effect of SA concentration on the immobilization efficiency

2.1.2 MS質(zhì)量濃度對酶固定化效果的影響

圖2 MS質(zhì)量濃度對酶固定化效果的影響Fig. 2 Effect of microporous starch concentration on the immobilization efficiency

由圖2可知，酶活力回收率隨著MS質(zhì)量濃度的升高先升高后降低，這種現(xiàn)象可能與海藻酸鈣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能夠包埋MS的量有關(guān)，當(dāng)MS與SA的物質(zhì)的量比值較高時，海藻酸鈣形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)難以將吸附有酶的MS完全固定；若直接將酶液單獨與SA混合，不添加MS進行吸附，其包埋率只能達到30%左右，說明MS對酯化酶的固定化起重要作用。

圖3 酶液質(zhì)量濃度對酶固定化效果的影響Fig. 3 Effect of enzyme concentration on the immobilization efficiency

2.1.3 酶液質(zhì)量濃度對酶固定化效果的影響

由圖3可知，當(dāng)酶液質(zhì)量濃度小于7 g/100 mL時，其酶活力回收率隨酶液質(zhì)量濃度的增加而增大，當(dāng)大于7 g/100 mL時，其酶活力回收率略有下降，可能由于顆粒內(nèi)部酶質(zhì)量濃度過高，在MS吸附過程中堵塞了孔道，顆粒內(nèi)部的酯化酶與底物接觸的阻力增大[30]，導(dǎo)致酶活力回收率降低。

2.1.4 CaCl2質(zhì)量濃度對酶固定化效果的影響

圖4 CaCl2質(zhì)量濃度對酶固定化效果的影響Fig. 4 Effect of concentration of calcium chloride on the immobilization efficiency

如圖4所示，CaCl2質(zhì)量濃度較低時對包埋率的影響較弱，但總體呈上升趨勢，這是由于CaCl2質(zhì)量濃度較低時，酶和MS沒有及時固定而溶于固化液中，隨著CaCl2質(zhì)量濃度增大，CaCl2與SA以應(yīng)速度相對較快，其形成的海藻酸鈣網(wǎng)絡(luò)致密結(jié)構(gòu)將酶和MS迅速包埋，減少酶流失；而隨著CaCl2質(zhì)量濃度的繼續(xù)增大，酶活力回收率出現(xiàn)下降，這是由于高質(zhì)量濃度的CaCl2離子強度較大，而酶活力受離子強度的影響會有相應(yīng)的失活[31]。

2.1.5 固定時間對酶固定化效果的影響

圖5 固定時間對酶固定化效果的影響Fig.5 Effects of immobilization time on the immobilization efficiency

由圖5可知，固定時間對包埋率影響較弱，CaCl2與SA以應(yīng)比較容易，但也需要一定時間固化才能夠完全，0.5 h包埋率較低，可能是由于固化不完全，沖洗顆粒時將未包埋的酶和淀粉洗掉。固定時間為0.5～1.0 h時，酶活力回收率增大，當(dāng)大于1.0 h時，酶活力回收率下降，由于隨著固化時間的延長，固定化顆粒浸泡在CaCl2溶液中的時間較長，受離子強度影響的時間較長，導(dǎo)致酶活力下降[32]。

2.1.6 正交試驗優(yōu)化固定化工藝條件

選定對固定化工藝條件影響較大的4 個因素，即，SA質(zhì)量濃度、MS質(zhì)量濃度、CaCl2質(zhì)量濃度、酶液質(zhì)量濃度，每個因素設(shè)定3 個水平，以包埋率和酶活力回收率作為評價指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗對固定化條件進行優(yōu)化，如表2所示。

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

由表2可知，以包埋率為評價指標(biāo)時，其理論優(yōu)水平為A3B1C3D1，實際優(yōu)水平為A3B1C3D2，影響因素的主次順序為A＞B＞D＞C；以酶活力回收率為評價指標(biāo)時，其理論優(yōu)水平為A2B2C3D3，實際優(yōu)水平為A2B2C3D1，影響因素的主次順序為A＞B＞D＞C，因此，通過驗證實驗驗證理論和實際最優(yōu)組合中的包埋率和酶活力回收率都相對較大的組合，以確定最佳固定化條件。

表3 驗證實驗結(jié)果Table 3 Results of verification experiments

由表3可知，以包埋率為評價指標(biāo)時，其理論最優(yōu)組合A3B1C3D1的包埋率最高；以酶活力回收率為評價指標(biāo)時，實際組合A2B2C3D1的酶活力回收率最高。為提高酶的利用率應(yīng)該選擇包埋率相對較高，且酶活力回收率最高的組合作為固定化酶的最優(yōu)條件，因此，確定A2B2C3D1為最優(yōu)固定化條件，即SA質(zhì)量濃度為2.5 g/100 mL，微孔淀粉質(zhì)量濃度為1.5 g/100 mL，CaCl2質(zhì)量濃度為3 g/100 mL，酶液質(zhì)量濃度為6 g/100 mL，其酶活力回收率最高，為60.13%，酶活力達111.01 mg/（g·100 h）。

2.2 固定化酯化酶效果圖和掃描電鏡

圖6 固定化酯化酶效果圖Fig. 6 Picture of beads immobilizing esterifying enzyme

圖7 固定化酯化酶掃描電鏡圖Fig. 7 SEM photos of the surface of beads immobilizing esterifying enzyme

固定化酯化酶效果圖見圖6。利用掃描電鏡觀察固定化酶載體材料及固定化酶顆粒的表面結(jié)構(gòu)，如圖7所示。由圖7a2可以明顯看出，SA與CaCl2以應(yīng)后形成的海藻酸鈣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，圖7b2、c2與a2對比，可以看到MS和酶被固定在海藻酸鈣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中。由圖7d1可知，MS的表面布滿均勻的小孔，孔洞較深，由圖7d2可知，MS吸附酶液后，其表面不光滑，有明顯異物附著，孔洞變淺。

2.3 固定化酯化酶催陳新醋

2.3.1 催陳溫度對催陳效果的影響

圖8 催陳溫度對催陳效果的影響Fig. 8 Effects of reaction temperature on total ester content of vinegar

分別將5 份新配制的固定化酯化酶添加量在4.5 g/500 mL的醋液置于30、35、40、45、50 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中催陳，24 h后測定醋液中的總酯含量，研究固定化酯化酶的催陳溫度對催陳效果的影響，結(jié)果如圖8所示。固定化酯化酶與游離酯化酶的催陳溫度對催陳效果的變化規(guī)律基本一致，即在30～50 ℃催陳溫度范圍內(nèi)隨著溫度的升高醋液中總酯含量呈先升高后下降的趨勢，40 ℃為2 種狀態(tài)酯化酶的適宜催陳溫度，這與生物酶的活性隨溫度變化趨勢相似。此外，在催陳溫度低于45 ℃時固定化酯化酶的活性低于游離酯化酶，而當(dāng)催陳溫度達到50 ℃時固定化酯化酶的活性高于游離酶，此現(xiàn)象表明酯化酶經(jīng)過固定化以后在低溫狀態(tài)下出現(xiàn)一定惰性，而在高溫狀態(tài)下卻會表現(xiàn)出對高溫的耐受性，但在40 ℃時2 種狀態(tài)酯化酶的催陳效果相當(dāng)。

2.3.2 固定化酯化酶的添加量和催陳時間對催陳效果的影響

圖9 固定化酯化酶添加量和催陳時間對催陳效果的影響Fig. 9 Effects of immobilized enzyme amount and aging time on total ester content of vinegar

分別取固定化酯化酶1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 g加入500 mL新醋液中，封口于40 ℃恒溫培養(yǎng)箱，隔12 h測醋液中的總酯含量，研究固定化酯化酶的添加量和酯化時間對催陳效果的影響，如圖9所示。固定化酯化酶添加量和催陳時間與新醋中總酯的生成量呈正相關(guān)，但當(dāng)添加量大于4.5 g時，同等時間內(nèi)總酯的生成量變化不大，且當(dāng)催陳時間達到48 h，不同添加量下的醋液總酯含量基本達到一個水平，不再有顯著增長，可能酯化以應(yīng)已達到平衡。

表4 固定化酶處理前后醋液部分指標(biāo)的變化Table 4 Changes in acid and ester contents of vinegar before and after treatment with the immobilized enzyme g/100 mL

由表4可知，固定化酶處理后醋液的總酸、不揮發(fā)酸質(zhì)量濃度均降低，每100 mL醋液總酸降低0.104 g，不揮發(fā)酸降低0.042 g，醋液中的部分酸被酯化生成酯，固定化酯化酶處理后醋液的總酯升高0.304 g/100 mL，說明醋中酸、醇、酯在短期內(nèi)達到了一定的平衡，能夠縮短新醋陳釀時間。

3 討 論

通過單因素和正交試驗，優(yōu)化得出采用SA-MS包埋法固定化酯化酶最佳工藝條件：SA質(zhì)量濃度為2.5 g/100 mL，MS質(zhì)量濃度為1.5 g/100 mL，酶液質(zhì)量濃度為6 g/100 mL，CaCl2質(zhì)量濃度為3 g/100 mL，固定時間1 h。在該條件下制備的固定化酶其酶活力回收率可達60.13%，包埋率達81.13%，且固定化酶熱穩(wěn)定性優(yōu)于游離酶的。

將優(yōu)化的固定化條件下制備的固定化酯化酶4.5 g置于500 mL新醋液中進行應(yīng)用實驗，40 ℃催陳48 h，醋液總酯質(zhì)量濃度可達1.329 g/100 mL，比新醋增加0.304 g/100 mL，增長率為29.66%，醋液刺激味明顯減弱。王冕等[28]采用海藻酸鈉和黃原膠固定化酯化酶，將其應(yīng)用于山西老陳醋新醋催陳，固定化酶添加量8 g、催陳24 h，醋液中總酯含量比原醋液提高28.1%。

唐取來等[33]將清香型大曲酯化酶加入乙酸乙酯和乳酸乙酯酯化液中考察不同質(zhì)量濃度的乳酸對其合成與分解作用的影響，結(jié)果表明，乳酸質(zhì)量濃度較低時（＜1.6 g/100 mL），酯化酶對乙酸乙酯表現(xiàn)為合成作用，乳酸質(zhì)量濃度小于0.8 g/100 mL時，對乳酸乙酯表現(xiàn)為合成作用；當(dāng)pH值大于3時，酯化酶能促進乙酸乙酯的合成，pH值為4.0時，其催化乙酸乙酯合成的活力最強。邢爽等[32]研究不同香型大曲酯化酶的特性，結(jié)果表明清香型、濃香型和醬香型大曲催化合成乙酸乙酯的最適pH值均為4.0。本實驗所用醋液不揮發(fā)酸為1.305 g/100 mL（以乳酸乙酯計），質(zhì)量濃度較低，pH值為3.9（老陳醋pH值范圍為3.6～3.9），在酯化酶使用的最適pH值范圍內(nèi)，本實驗結(jié)果表明酯化酶催化以合成作用為主。酯化以應(yīng)為可逆以應(yīng)，底物質(zhì)量濃度和pH值對酯化酶的合成以應(yīng)和分解以應(yīng)有一定影響，但醋液體系復(fù)雜，關(guān)于酯化酶催化新醋液中酯化以應(yīng)以合成作用為主，還是分解作用為主需對其適宜的底物濃度和pH值等因素做進一步研究，對把握催陳過程具有一定意義。