共表達分子伴侶PDI和轉(zhuǎn)錄因子Aft1對畢赤酵母表達人溶菌酶的影響

王儒昕，韓 琴，陳園園，吳 菁，閆達中，劉 軍，李 鑫

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

細菌對傳統(tǒng)抗生素耐藥性的增強使得越來越多的研究人員致力于開發(fā)新型的抗菌化合物。溶菌酶又稱胞壁質(zhì)酶或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，能夠水解細菌細胞壁中β-1,4糖苷鍵，破壞細胞壁肽聚糖的結(jié)構(gòu)[1-2]，保護宿主細胞免受細菌感染，是一種安全性高的藥品及飼料食品添加劑[3]。人溶菌酶（human lysozyme，HLY）與雞蛋清溶菌酶同屬于c型溶菌酶，由130 個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量14 700，含4 個二硫鍵，活力中心由Glu35和Asp53構(gòu)成[4]。目前，市場上銷售的溶菌酶主要是從雞蛋清中提取獲得[3]。相比于雞蛋清溶菌酶，HLY具有高的生物活力和熱穩(wěn)定性，抗菌活力是雞蛋清溶菌酶的3 倍[5]，同時HLY還具有抗病毒、增強免疫力和抗腫瘤的功效，在臨床具有較高的應(yīng)用價值[3]。HLY受限于原料來源、純化精制成本等因素，制備量少，無法滿足市場需求。構(gòu)建基因工程菌株，生產(chǎn)重組HLY是解決這一問題的有效手段。

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）具有遺傳操作簡單、生長快速、易于培養(yǎng)、培養(yǎng)基廉價、擁有強誘導(dǎo)型甲醇氧化酶（alcohol oxidase，AOX）啟動子、能對外源蛋白進行轉(zhuǎn)錄后修飾等諸多優(yōu)點，是表達重組溶菌酶理想系統(tǒng)。Goda等[6]在畢赤酵母中實現(xiàn)了HLY的表達，并分析了氮末端殘基對酶穩(wěn)定性及折疊的影響。Zhou Xiaoyu等[7]通過優(yōu)化表達條件和高密度補料分批發(fā)酵，實現(xiàn)HLYLYZL6在巴斯德畢赤酵母分泌表達，30 L發(fā)酵罐中蛋白分泌量達到331 mg/L。劉思彤等[8]用乳酸克魯維酵母表達HLY，搖瓶發(fā)酵酶活力達到1 430 U/mL。陳姍姍等[9]根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性，對α-信號肽序列和人源溶菌酶基因序列進行整體優(yōu)化，在5 L發(fā)酵罐中畢赤酵母工程菌分泌產(chǎn)胞外總蛋白達3.02 g/L。為降低生產(chǎn)成本，需要進一步提高工程菌表達HLY的水平。

通常提高畢赤酵母生產(chǎn)異源蛋白的產(chǎn)量策略如下：增加目的基因拷貝數(shù)，提高目的基因轉(zhuǎn)錄水平[10]；優(yōu)化基因序列，提高目的基因的翻譯水平[11]；選擇信號肽與信號肽改造[12]；共表達分子伴侶和轉(zhuǎn)錄因子[13-14]；使用蛋白酶缺陷型宿主菌[15]或優(yōu)化培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組分，減少目標蛋白的降解[16]。

過表達分子伴侶是提高外源蛋白表達水平的有效手段。蛋白質(zhì)二硫鍵形成和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的折疊是蛋白分泌過程主要限速步驟。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase，PDI）是來自硫氧還蛋白超家族的多功能蛋白質(zhì)，它催化二硫鍵形成并有助于蛋白質(zhì)的正確折疊。研究表明，PDI的過表達能增加畢赤酵母產(chǎn)異源蛋白[17-19]。過表達分子伴侶能否提高畢赤酵母外源蛋白表達水平，與所表達的外源蛋白性質(zhì)相關(guān)[20]。HLY具有4 個二硫鍵，在工程菌中過表達PDI，可能有助于重組HLY形成二硫鍵，并正確折疊成其天然構(gòu)相，從而提高畢赤酵母工程菌產(chǎn)HLY水平。

過表達轉(zhuǎn)錄因子是提高外源蛋白表達水平的另一重要手段。轉(zhuǎn)錄因子能同時調(diào)節(jié)涉及折疊和分泌的不同蛋白質(zhì)，有克服宿主蛋白生產(chǎn)瓶頸的巨大潛力。Guerfal等[21]過表達轉(zhuǎn)錄因子Hac1，提高了mIL-10蛋白和抗體片段的分泌量。轉(zhuǎn)錄因子Nrg1的過表達提高了豬和人胰蛋白酶原，以及抗體Fab片段2F5的分泌產(chǎn)量[22]。畢赤酵母轉(zhuǎn)錄因子Aft1過表達，對畢赤酵母分泌表達來自Sphingopyxis sp. MTA144的羧酸酯酶具有促進效應(yīng)，在補料分批發(fā)酵中，羧酸酯酶分泌量提高了2.5 倍[23]。

基于以上分析，本研究將構(gòu)建共表達HLY和PDI及共表達HLY和Aft1的畢赤酵母工程菌株，分析共表達PDI和Aft1對菌株產(chǎn)HLY的影響，以期提高HLY產(chǎn)量，并為后續(xù)進一步構(gòu)建高效產(chǎn)HLY畢赤酵母細胞工廠、降低HLY生產(chǎn)成本打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與載體

表達載體pPICZαA、pPIC9K 美國Invitrogen公司；溶壁微球菌 廣東微生物菌種保藏中心；大腸桿菌DH5α、畢赤酵母KM71、畢赤酵母工程菌株KM71-HLY（表達重組HLY）為本實驗室保藏。

1.1.2 酶、試劑與引物

DNA限制性內(nèi)切酶、DNA Marker（DL 2 000及DL 10 000）、PrimeSTAR Max DNA聚合酶、DNA連接酶、無氨基酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，YNB） 大連TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、聚合酶鏈式以應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物回收試劑盒、DNA膠回收試劑盒、酵母基因組提取試劑盒、山梨醇、Tris、十二烷基硫酸鈉、卡那霉素、G418遺傳霉素 上海捷瑞生物公司；蛋白胨酵母粉 英國Oxoid公司；牛血清蛋白標準品、考馬斯亮藍G250中國Biosharp公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰、四甲基乙二胺 美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

引物由上海捷瑞生物工程公司合成，具體序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primer pairs used in this study

1.1.3 培養(yǎng)基

Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母浸出物5 g/L，NaCl 10 g/L。

酵母培養(yǎng)基：酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖含山梨醇（yeast extract peptone dextrose with sorbitol，YPDS）培養(yǎng)基、含甘油緩沖復(fù)合（buffered complex medium containing glycerol，BMGY）培養(yǎng)基、含甲醇緩沖復(fù)合（buffered complex medium containing methanol，BMMY）培養(yǎng)基配制及培養(yǎng)方法參照EasySelectTMPichiaExpression Kit方法。

1.2 儀器與設(shè)備

TProfessional PCR儀 德國Biometra公司；5417R臺式高速冷凍離心機、Electroporator 2010電轉(zhuǎn)化儀德國Eppendorf公司；DYY-6C電泳儀、DYCZ系列垂直式電泳槽 北京六一儀器廠；GBox-HR-E-M凝膠成像系統(tǒng) 英國Syngene公司。

1.3 方法

1.3.1 載體構(gòu)建

以pPIC9K質(zhì)粒為模板，用引物PG418-上與PG418-下擴增出卡那霉素基因序列，用BamHI和NcoI酶切回收的片段，連接到經(jīng)BamHI和NcoI酶切回收的pPICZαA載體，構(gòu)建出載體pG418。

根據(jù)GenBank中PDI基因序列（AJ302014.1）和Aft1基因序列（CP014715.1）設(shè)計引物PPDI-上/PPDI-下和PAft1-上/PAft1-下，以畢赤酵母KM71基因組為模板，擴增出PDI基因與Aft1基因片段；用BspT104I和NotI分別酶切回收擴增的片段，將它們連接到經(jīng)BspT104I和NotI酶切回收的pG418載體，構(gòu)建出重組載體pG418-PDI和pG418-Aft1。

1.3.2 電轉(zhuǎn)化及重組畢赤酵母的鑒定

分別用SacI酶切質(zhì)粒pG418-PDI和pG418-Aft1，將線性化回收的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71-HLY。電轉(zhuǎn)化條件為：電壓1.5 kV，電擊時間4 ms。電擊后，立即加入1 mL冰預(yù)冷的1 mol/L山梨醇溶液，用移液器吸打混勻，涂布在含G418的YPDS平板上（500 μg/mL）[24]。對在含G418的YPDS平板生長的菌落進行PCR擴增，鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。

1.3.3 重組菌株誘導(dǎo)表達

從YPD平板上挑取篩選的單菌落接入裝有25 mL BMGY培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600nm值為2～6。菌液用8 000 r/min離心5 min，棄上清液。用25 mL BMMY重懸菌體，裝入250 mL三角瓶中，加入無水甲醇，使其體積分數(shù)為0.5%。28 ℃、220 r/min進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。每隔24 h向培養(yǎng)基中補加甲醇，使其體積分數(shù)為0.5%。誘導(dǎo)物經(jīng)8 000 r/min離心后，取上清液檢測分析。

1.3.4 工程菌表達水平分析

用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）對工程菌株表達的HLY進行定性分析[25]。采用12%分離膠，5%濃縮膠，電泳電壓120 V，電流100 mA。

用Bradford法[26]對菌株產(chǎn)胞外總蛋白進行定量分析。配制10%考馬斯亮藍G250溶液，每100 μL樣品加入5 mL考馬斯亮藍G250溶液，以應(yīng)5 min，測定595 nm波長處吸光度，以牛血清白蛋白為標準品制備標準曲線。

1.3.5 HLY活力檢測

參照GB/T 30990—2014《溶菌酶活性檢測方法》培養(yǎng)溶壁微球菌。制備含溶壁微球菌的LB平板，采用管蝶法對重組HLY活力進行定性分析。取發(fā)酵上清液，用磷酸緩沖液（pH 6.2）稀釋4 倍，取200 μL加入牛津杯。37 ℃培養(yǎng)20 h，比較抑菌圈大小。

采用Olmo等[27]的方法測定重組HLY活力。以溶壁微球菌作為底物，通過450 nm波長處菌懸液吸光度的變化確定酶活力。將溶壁微球菌用磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）稀釋至A450nm值為1.3，將稀釋的菌懸液25 ℃溫育，取2.5 mL加于1 cm的玻璃比色皿，再向比色皿中加入0.5 mL的待測樣品，混勻，定時測定以應(yīng)液吸光度。以每分鐘450 nm波長處吸光度降低0.001為1 個酶活單位。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010分析數(shù)據(jù)，Origin 8.5繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組載體的構(gòu)建

圖1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig. 1 Construction of recombinant plasmids

圖2 pG418重組質(zhì)粒的鑒定Fig. 2 Identification of recombinant plasmid pG418

重組載體的構(gòu)建見圖1。挑取在含卡那霉素（50 μg/mL）的LB平板上長出的菌落培養(yǎng)，從中提取重組質(zhì)粒，用引物PG418-上/PG418-下對提取的重組質(zhì)粒及質(zhì)粒pPIC9K進行擴增，并用BamHI和NcoI酶切提取的重組質(zhì)粒，結(jié)果見圖2。從圖2可知，PCR擴增和質(zhì)粒酶切均能得到1 604 bp的片段，與卡那霉素基因片段大小一致，且構(gòu)建的重組質(zhì)粒大小與預(yù)期3 925 bp一致，表明pG418質(zhì)粒構(gòu)建成功。

將擴增的PDI基因和Aft1基因克隆至pG418，構(gòu)建重組質(zhì)粒pG418-PDI和pG418-Aft1。用PPDI-上/PPDI-下和PAft1-上/PAft1-下分別對在含卡那霉素的LB平板上長出的轉(zhuǎn)化子進行PCR鑒定，并用BspT104I和NotI酶切提取的重組質(zhì)粒，結(jié)果見圖3。圖3A表明，重組質(zhì)粒PCR擴增與酶切均得到1 554 bp的片段，與以KM71基因組為模板擴增的PDI基因片段大小相同；圖3B表明，重組質(zhì)粒PCR擴增與酶切均得到1 092 bp的片段，與以KM71基因組為模板擴增的Aft1基因片段大小相同。因此，重組質(zhì)粒pG418-PDI和pG418-Aft1構(gòu)建成功，并經(jīng)測序進行了確證。

2.2 重組畢赤酵母的構(gòu)建

將pG418-PDI和pG418-Aft1用SacI酶切線性化，分別電轉(zhuǎn)化至KM71-HLY。對在含G418的YPDS平板上生長的菌落，提取基因組作為模板，進行PCR，鑒定陽性轉(zhuǎn)化子，結(jié)果見圖4。

圖4 工程菌株KM71-HLY-pG418-PDI（A）和KM71-HLY-pG418-Aft1（B）PCR鑒定Fig. 4 Identification of strains KM71-HLY-pG418-PDI (A) and KM71-HLY-pG418-Aft1 (B) by PCR

用PPDI-上/PAOX-下和PAft1-上/PAOX-下分別擴增pG418-PDI和pG418-Aft1轉(zhuǎn)化后得到的轉(zhuǎn)化子，擴增片段為1 750 bp和1 288 bp，大小與預(yù)期pG418-PDI質(zhì)粒擴增片段一致，而以KM71-HLY基因組為模板沒有相應(yīng)擴增條帶；對擴增的產(chǎn)物進行測序，證實重組質(zhì)粒pG418-PDI和pG418-Aft1分別整合進KM71-HLY基因組，分別得到共表達PDI和Aft1工程菌株KM71-HLY-pG418-PDI和KM71-HLY-pG418-Aft1。

2.3 工程菌發(fā)酵產(chǎn)HLY及活力分析

圖5 工程菌表達HLY的SDS-PAGE分析Fig. 5 SDS-PAGE analysis of HLY expression in recombinant strains

對KM71-HLY、KM71-HLY-pG418-PDI和KM71-HLY-pG418-Aft1進行甲醇誘導(dǎo)表達。對誘導(dǎo)96 h的發(fā)酵液離心，取上清液進行SDS-PAGE分析，3 種工程菌株誘導(dǎo)后均產(chǎn)生14.7 kDa蛋白條帶，大小與HLY一致（圖5）。

圖6 管碟法測定發(fā)酵液抑菌活力Fig. 6 Assay of antibacterial activity of fermentation broth by the cylinder-plate method

采用管碟法檢測工程菌表達的HLY活力，由圖6可見，未加甲醇誘導(dǎo)KM71-HLY上清液未出現(xiàn)抑菌圈；KM71-HLY、KM71-HLY-pG418-PDI和KM71-HLY-pG418-Aft13 種菌株經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后，其上清液均產(chǎn)生HLY，在平板上出現(xiàn)明顯抑菌圈，抑菌圈直徑大小分別為17、20、24 mm。

2.4 共表達PDI和Aft1對工程菌生長及產(chǎn)酶的影響

菌株生長及產(chǎn)溶菌酶情況見圖7及表2。KM71-HLY、KM71-HLY-pG418-PDI和KM71-HLY-pG418-Aft1在前70 h生長量差異不大，隨后3 種菌株生長出現(xiàn)不同（圖7A）。在發(fā)酵結(jié)束時，生物量OD600nm值分別為33.87、31.43、28.47。共表達PDI和Aft1對菌株生長會產(chǎn)生一定的影響，KM71-HLY-pG418-PDI和KM71-HLY-pG418-Aft1發(fā)酵最終生物量分別為KM71-HLY的92.8%與84.1%。

在發(fā)酵結(jié)束時，3 種菌株的胞外總蛋白量分別為324.02、350.87、474.80 mg/L。KM71-HLY-pG418-Aft1發(fā)酵分泌到胞外總蛋白量較KM71-HLY提高了46.5%，KM71-HLY-pG418-PDI胞外總蛋白量與KM71-HLY沒有明顯差異（圖7B）。

隨著誘導(dǎo)時間延長，KM71-HLY、KM71-HLY-pG418-PDI和KM71-HLY-pG418-Aft1產(chǎn)HLY活力逐漸增加，發(fā)酵結(jié)束后，3 種工程菌株發(fā)酵液所產(chǎn)HLY活力達到34 880、45 600 U/mL和50 180 U/mL（圖7C）。KM71-HLY-pG418-PDI和KM71-HLY-pG418-Aft1總酶活力分別較KM71-HLY提高30.7%和43.9%。

如表2所示，KM71-HLY、KM71-HLY-pG418-PDI和KM71-HLY-pG418-Aft1所產(chǎn)胞外蛋白酶比活力分別為107 600、129 900 U/mg和105 600 U/mg。相對于對照菌株，過表達PDI的工程菌株所產(chǎn)HLY比酶活力得到提高，而過表達Aft1工程菌株所產(chǎn)HLY比酶活力有所降低。

圖7 工程菌搖瓶發(fā)酵Fig. 7 Time courses of shake flask fermentation

表2 工程菌株搖瓶發(fā)酵結(jié)束指標Table 2 Biomass, total protein production and lysozyme activity of recombinant strains at the end of shake flask fermentation

3 討 論

畢赤酵母具有高效表達外源蛋白的能力，但在胞內(nèi)大量表達的外源蛋白常無法及時折疊、加工而聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中無法分泌到胞外，影響外源蛋白的分泌表達水平。分子伴侶促進蛋白正確折疊從而提高蛋白表達量[13-14]。本研究結(jié)果表明，誘導(dǎo)168 h后，KM71-HLY-pG418-PDI工程菌分泌的外源蛋白量與KM71-HLY無顯著差別，但發(fā)酵液比酶活力提高了20.7%，胞外總酶活力提高了30.7%，這與PDI催化蛋白質(zhì)分子二硫鍵形成并有助于蛋白質(zhì)折疊的生物學(xué)功能一致。

與共表達PDI不同，KM71-HLY-pG418-Aft1較KM71-HLY菌株產(chǎn)胞外總蛋白量提高了46.5%，總酶活力較KM71-HLY菌株提高了43.9%，發(fā)酵液酶比活力與KM71-HLY相當。生物信息分析表明，在許多與蛋白分泌相關(guān)的基因啟動子中發(fā)現(xiàn)有Aft1結(jié)合位點：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中兩種重要的分子伴侶Pdi1和BiP[28-29]；參與COPII囊泡形成和ER至高爾基體運輸?shù)腟ec12和Sec23[30]；參與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)位進出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通道形成的Sec61[31]；參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體轉(zhuǎn)位，及高爾基體內(nèi)部運輸?shù)牡鞍譍os1[32]；參與氧化應(yīng)激以應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子Yap1[33]；參與蛋白質(zhì)糖基化作用的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶Och1[34]；參與胞吐作用的蛋白激酶Kin1[35]。推測畢赤酵母Aft1在蛋白折疊、糖基化、胞內(nèi)運輸及蛋白胞吐外排等系列蛋白分泌途徑中起重要作用[23]。因此，本研究的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄因子Aft1可能的生物學(xué)功能一致。

目前，利用共表達轉(zhuǎn)錄因子Aft1提高外源蛋白的表達量僅見Ruth等[23]報道，本研究中，畢赤酵母轉(zhuǎn)錄因子Aft1能有效提高HLY產(chǎn)量，這為利用畢赤酵母轉(zhuǎn)錄因子Aft1提高畢赤酵母工程菌株產(chǎn)外源蛋白提供了又一參考。

畢赤酵母工程菌株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)HLY最高水平為16 973.5 U/mL，本研究構(gòu)建的畢赤酵母工程菌株產(chǎn)HLY超過了已報道的最高水平[6-9]，后續(xù)將對所構(gòu)建的工程菌株在發(fā)酵罐中生長及產(chǎn)酶情況進行研究。共表達PDI和轉(zhuǎn)錄因子Aft1對提高畢赤酵母產(chǎn)HLY有促進作用，這為進一步構(gòu)建高效產(chǎn)HLY工程菌株提供了方向。后續(xù)會進一步將兩種因子同時共表達于同一宿主細胞，分析它們在表達HLY中的協(xié)同作用，也會將他們與其他影響外源蛋白表達的因素結(jié)合起來，構(gòu)建高效產(chǎn)HLY畢赤酵母細胞工廠，降低生產(chǎn)成本。