高通量測序分析不同地區(qū)紅腐乳細(xì)菌多樣性

徐 瓊，劉 洋,，曲勤鳳，竇同海，陳羽菲，張娜娜，趙 磊，鐘 江，翁史昱，楊捷琳，趙國屏

（1.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院，上海 200233；2.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433；3.上海海關(guān)動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心，上海 200135）

腐乳是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵豆制品，至今已有一千多年的生產(chǎn)歷史。它是用豆?jié){的凝乳狀物經(jīng)微生物發(fā)酵所制成的一種干酪型產(chǎn)品，故又被譽(yù)為“中國干酪”[1]。經(jīng)微生物發(fā)酵后的腐乳除大豆本身所具有較高蛋白質(zhì)、脂肪和大豆異黃酮[2]等營養(yǎng)外，還具有抗氧化[3-4]、抗高血壓[5]、抗乙酰膽堿酯酶活性[6]等生理功能，深受人們的喜愛。

由于腐乳是半開放式生產(chǎn)，且大多為傳統(tǒng)的手工操作，未有加熱殺菌的過程，因此有可能被環(huán)境中的微生物雜菌污染[7]，從而影響產(chǎn)品的品質(zhì)，甚至給消費者的安全帶來隱患。如腐乳中常見的生物胺，主要是由微生物對游離氨基酸的脫羧作用產(chǎn)生[8]，諸如芽孢桿菌屬（Bacillus）、梭菌屬（Clostridium）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）均能產(chǎn)生脫羧酶[9-10]。此外，氨基甲酸乙酯[11]、腸毒素[12]、丙烯酰胺[13]也是常見的發(fā)酵過程中的微生物產(chǎn)生的副產(chǎn)物。

廖新浴等[14]利用純培養(yǎng)和16S rDNA測序相結(jié)合對不同類型腐乳優(yōu)勢菌群進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)不同腐乳中的菌群結(jié)構(gòu)各不相同，同時存在優(yōu)勢的食源性致病菌如蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）和惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）。由于該結(jié)果依賴于純培養(yǎng)，對于含量較低和非可培養(yǎng)微生物可能有所遺漏，無法對樣品中的所有微生物群落進(jìn)行全面分析。

近年來，隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，高通量測序技術(shù)也被稱為下一代測序技術(shù)，由于成本低、可讀量和質(zhì)量高，是目前評估微生物多樣性的有力工具[15-16]。許多研究已經(jīng)將該技術(shù)用于發(fā)酵食品中菌群多樣性的分析，如豆豉[17]、豆汁[18]、大醬[19]、曲拉[20]等，但運(yùn)用高通量測序技術(shù)分析華東、華北和東北地區(qū)腐乳菌群多樣性的研究鮮見報道。

本研究以我國不同地區(qū)紅腐乳為研究對象，采用高通量測序技術(shù)對細(xì)菌16S rDNA V1-V3區(qū)進(jìn)行測序，以期更加全面地了解不同地域紅腐乳中細(xì)菌菌群多樣性，明確各自的優(yōu)勢菌群，為建立地域性特色發(fā)酵食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅腐乳樣品從我國6 個省市當(dāng)?shù)爻匈徺I，每例樣品來源于不同生產(chǎn)廠家，共計9 例，具體地區(qū)與樣品情況見表1。

表1 樣品信息Table 1 Information about the samples tested in this study

聚合酶鏈?zhǔn)揭詰?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix（M7505） 美國Promega公司；膠回收試劑盒（Code No. 9762）、引物 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW22振蕩水浴槽 德國Julabo公司；Centrifuge 5417R冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；Nanodrop2000超微量分光光度計 美國Thermo Scientific公司；VERITI梯度PCR儀 美國ABI公司；Sub-Cell電泳儀、Geldoc XR+型凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 核酸提取

采用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）法[21]并稍作修改。取同批次樣品3 份，從每份樣品中倒取50 mL腐乳湯汁，共計150 mL?；旌虾?，取混合樣品湯汁5 mL，9 000 r/min離心10 min，去上清液，沉淀中加入10 mL的無菌水，在振蕩器上振蕩混勻，9 000 r/min離心10 min，去上清液，沉淀加入800 μL溶菌酶（10 mg/mL），37 ℃水浴1 h；然后加入40 μL的蛋白酶K和CTAB裂解液，56 ℃水浴2 h。每管裂解液中加入等量Tris飽和酚-三氯甲烷-異戊醇（25∶24∶1，V/V），混勻，13 000 r/min離心10 min。取上清液至新離心管中，加入等體積三氯甲烷-異戊醇（24∶1，V/V），混勻，13 000 r/min離心10 min。上清液移至新離心管中，加入2 倍體積無水冰乙醇，混勻，靜置30 min左右，13 000 r/min離心2 min。棄上清液，用70%乙醇溶液洗滌沉淀2～3 次，得到的沉淀放置于室溫條件下進(jìn)行自然風(fēng)干。風(fēng)干后加入50 μL Tris-乙二胺四乙酸緩沖液，溶解沉淀。

1.3.2 PCR擴(kuò)增及16S rRNA測序

以提取的總細(xì)菌基因組D N A為模板，引物針對16S rRNA基因V1-V3區(qū)合成特異引物，利用27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和534R（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’）引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系：基因組模板DNA 2 μL，2×PCR Master Mix 12.5 μL，正以引物各0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火50 s；72 ℃延伸45 s，擴(kuò)增40 個循環(huán)；4 ℃保存。對所得的PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，對符合要求的PCR產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)實驗。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，使用Illumina MiSeq平臺進(jìn)行高通量測序及生物信息學(xué)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

高通量測序得到的雙端序列數(shù)據(jù)使用FASTQC（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc）進(jìn)行質(zhì)量控制。Raw data上的接頭使用CUTADAPT（http://code.google.com/p/cutadapt/）去除。然后使用FLASH（https://sourceforge.net/projects/fl ashpage/ fi les/）連接Pair-end兩端Reads。使用QIIME[22]篩選序列和嵌合體，嵌合體去除使用QIIME的Usearch[23]算法，參數(shù)默認(rèn)。

基于可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析結(jié)果，研究環(huán)境中微生物的多樣性，使用QIIME分析流程中pick_open_reference方式進(jìn)行OTU聚類。聚類算法使用Uclust[23]，數(shù)據(jù)庫使用Greengenes 2013-08 release（http://greengenes.lbl.gov/Download/）版本，相似度閾值為97%，對所有序列進(jìn)行OTU劃分并進(jìn)行生物信息統(tǒng)計分析，其余參數(shù)為QIIME默認(rèn)參數(shù)。根據(jù)樣本分析所得OTU情況使用QIIMEα_diversity分析模塊進(jìn)行α多樣性分析，其中菌群豐度可由Chao 1指數(shù)進(jìn)行評估，其數(shù)值越高表明群落物種豐富度越高；菌群多樣性由Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)進(jìn)行評估，Shannon指數(shù)與群落多樣性呈正相關(guān)，與Simpson指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。Coverage指數(shù)是測序深度指標(biāo)，代表每個樣品文庫的覆蓋率。

使用β多樣性分析進(jìn)行不同樣品在微生物群落構(gòu)成上的比較。使用軟件QIIMEβ_diversity_through_plots,jackknifed_β_diversity模塊進(jìn)行β多樣性分析。在之前分析步驟中，已經(jīng)將序列按照其堿基組成的相似性，劃歸到各個OTU中。在進(jìn)行分類學(xué)分析時，首先，將每一條典型序列都與Greengenes 2013-08 release（http://greengenes.lbl.gov/Download/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，找出其最相近且可信度達(dá)80%以上的種屬信息，以獲得每個OTU的分類學(xué)信息。根據(jù)物種注釋，統(tǒng)計每個樣品在分類水平上的序列數(shù)目，分類水平分別是門水平（將相對豐度＜0.1%及unidentified歸入others）和屬水平（相對豐度＜5%及unidentified歸入others）。使用軟件QIIME，算法為rdp_classifier[24]v2.2。熱圖使用R語言的“pheatmap”包繪制。基于菌群之間Unifrac[25]算法加權(quán)的主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）可以實現(xiàn)多個樣品的分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌α多樣性分析

α多樣性以映樣品內(nèi)部微生物群落的物種豐富度，根據(jù)97%相似性水平下的OTU信息，采用α多樣性指標(biāo)的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Chao 1指數(shù)對樣品微生物物種的豐富度和多樣性進(jìn)行評估，結(jié)果見表2。所有樣本的測序Coverage指數(shù)大于0.9，說明腐乳樣品文庫種序列基本都被測出，未被測到的概率較低，測序結(jié)果可以以映樣品真實情況。由表2可知，東北地區(qū)樣品（R7和R8）的Chao 1指數(shù)和Simpson指數(shù)均低于其他樣品，說明該地區(qū)紅腐乳樣品中細(xì)菌群落豐度和群落多樣性較低，與其他地區(qū)存在一定差異。

表2 紅腐乳樣品中細(xì)菌α多樣性Table 2 α-Diversity of bacteria present in red sufu samples

采用對測序序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU數(shù)目構(gòu)建曲線，即稀釋性曲線。當(dāng)曲線趨于平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量對發(fā)現(xiàn)新OTU的邊際貢獻(xiàn)很??；以之則表明繼續(xù)測序還可能產(chǎn)生較多新的OTU。因此，通過作稀釋性曲線，可以得出樣品的測序深度情況。由圖1可知，多數(shù)樣本在序列數(shù)在接近10 000時，OTU已經(jīng)接近飽和，再增加測序量對于發(fā)現(xiàn)新OTU的邊際貢獻(xiàn)很小。說明測序數(shù)據(jù)量合理，所含菌種數(shù)較多。現(xiàn)有測序量已經(jīng)可以以映樣品中細(xì)菌豐度信息。

圖1 各樣品中細(xì)菌稀釋曲線Fig. 1 Rarefaction curves of bacteria in samples

2.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性分析

圖2 門水平下紅腐乳樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布Fig. 2 Distribution of bacterial communities in red sufu samples at phylum level

由圖2可知，紅腐乳中主要細(xì)菌優(yōu)勢門分別為：平均相對豐度為73.93%的厚壁菌門（Firmicutes）、15.12%的放線菌門（Actinobacteria）以及9.63%的變形菌門（Proteobacteria）。不同地區(qū)紅腐乳中細(xì)菌主要優(yōu)勢菌群基本相同，但是相對豐度差異較大，即樣品R2和R8中放線菌門的相對豐度分別為42.21%和44.96%，而樣品R9的放線菌門相對豐度只有2.34%；R1中變形菌門的相對豐度是所有紅腐乳中最高的，達(dá)到31.63%。說明在門水平下，不同地區(qū)紅腐乳中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成相同，僅組成比例存在一定差異。其中厚壁菌門是不同地區(qū)紅腐乳中的絕對優(yōu)勢菌群。

在屬水平下，9 個紅腐乳樣品共檢測出296 個細(xì)菌屬，圖3顯示相對豐度前12的物種。其中共有的菌屬分別為：棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、Rummeliibacillus、乳球菌屬（Lactococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、鏈球菌屬（Streptococcus）、叢毛單胞菌屬（Comamonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）以及Trabulsiella。

圖3 屬水平下紅腐乳樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布Fig. 3 Distribution of bacterial communities in red sufu samples at genus level

從群落結(jié)構(gòu)分布圖可以發(fā)現(xiàn)不同樣品中優(yōu)勢菌在種類及相對分布上有較大的差異。同一地區(qū)的樣品間細(xì)菌群落組成相似：R3、R5和R6樣品中優(yōu)勢屬為明串珠菌屬（29.45%、36.86%、30.72%）、乳球菌屬（9.59%、12.55%、20.72%）以及四聯(lián)球菌屬（8.75%、11.36%、12.05%）；R4樣品在豐度上與上述樣品有所差異，分別對應(yīng)明串珠菌屬（13.33%）、乳球菌屬（10.81%）、四聯(lián)球菌屬（47.11%）；而同樣來自華東地區(qū)的樣品R1，則展現(xiàn)了不同的細(xì)菌群落組成，相對豐度為22.83%的叢毛單胞菌屬是該樣品的優(yōu)勢菌屬，這個屬在其他樣品中的相對豐度均小于2%。叢毛單胞菌屬在1985年由De Vos等[26]建立，該屬中的菌株更多地與環(huán)境污染物的降解有關(guān)[27-28]，在食品中鮮有報道。因此在食品發(fā)酵中對于該菌屬的認(rèn)識值得深入研究。

此外，樣品R5、R6中的魏斯氏菌屬（5.55%、4.03%）是相比于其他樣品所特有的菌屬。芽孢桿菌屬和鹽厭氧菌屬（Halanaerobium）主要出現(xiàn)在R7、R8和R9樣品中，芽孢桿菌屬為R7和R9的優(yōu)勢菌，相對豐度分別為58.08%和52.24%。華東地區(qū)的優(yōu)勢菌屬明串珠菌屬在R7、R8和R9中相對豐度較低，均低于5%。R8中棒狀桿菌屬（44.08%）是該樣品的優(yōu)勢菌屬。相比于其他樣品，R8中梭菌屬（Clostridium）相對豐度最高，達(dá)到7.12%。梭菌屬是能形成芽孢、厭氧生長的革蘭氏染色陽性大桿菌，可以分解糖、蛋白質(zhì)，通?？梢援a(chǎn)生混合的有機(jī)酸和醇類，不還原硫酸鹽。它們的代謝物極富多樣性，廣泛分布在環(huán)境中，許多種可產(chǎn)生外毒素危害人類和牲畜生命健康[29]。

2.3 細(xì)菌β多樣性分析

根據(jù)OTU的豐度數(shù)據(jù)，熱圖可在屬水平上將不同的OTU分塊聚類，并根據(jù)顏色梯度以映不同樣品中細(xì)菌群落相似性、差異性及物種聚類關(guān)系。利用R語言繪制熱圖，可以直觀地顯示不同地區(qū)樣品中微生物的差異。由圖4可知，上側(cè)為樣品聚類樹，左側(cè)為OTU聚類樹，不同地區(qū)的9 種紅腐乳可分為3 個聚類：R7、R8和R9聚為一類，R3、R4、R5和R6聚為一類，R1和R2聚為一類，說明不同樣品間細(xì)菌群落存在一定的差異性。

圖4 樣品中不同屬組成和相對豐度的熱圖Fig. 4 Heatmap of composition and relative abundance of different genera

圖5 不同地區(qū)腐乳樣品中細(xì)菌群落主成分分析Fig. 5 Principal coordinate analysis of bacterial communities in red sufu samples

基于UniFrac距離的加權(quán)主坐標(biāo)法對9 種紅腐乳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。如圖5所示，細(xì)菌群落第1主成分（PC1）貢獻(xiàn)率為52.36%，第2主成分（PC2）貢獻(xiàn)率為22.77%。兩主成分之和大于70%，表明2 個成分較好地代表了樣品中的細(xì)菌群落信息。從圖5可知，不同腐乳樣本中的菌群與地理位置存在一定關(guān)系，同一地區(qū)的紅腐乳樣品具有一定的聚類趨勢，這與熱圖樣品聚類結(jié)果相似：R3、R4、R5和R6聚為一類，均來源于華東地區(qū)；樣品R7（東北）和R9（華北）聚為一類；R1（華東）、R2（華北）、R8（東北）3 個樣品較為離散，各自獨立。

3 討 論

腐乳是中國獨具特色的大豆發(fā)酵食品之一，大豆經(jīng)微生物發(fā)酵后所制成的一種干酪型產(chǎn)品[30]。通常根據(jù)其色澤風(fēng)味可分為白腐乳、紅腐乳、青（臭）腐乳三大類[31]。紅腐乳添加紅曲浸潤數(shù)月后釀制而成，故表面呈自然紅色。腐乳風(fēng)味的形成主要取決于微生物的發(fā)酵，腐乳中微生物群落特征的差異是不同地區(qū)風(fēng)味不同的重要原因之一。有學(xué)者對紅腐乳中的紅曲霉進(jìn)行遺傳學(xué)比較，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的紅曲霉存在一定的遺傳差異性[32]。由于腐乳特殊的生產(chǎn)工藝以及未有加熱殺菌的過程，使得腐乳中微生物種類和數(shù)量受到廣大學(xué)者的關(guān)注。因此對腐乳中微生物菌群的分析研究有助于為產(chǎn)品質(zhì)量控制、挖掘潛在功能性微生物及風(fēng)味改良提供理論支持。目前對于腐乳中微生物菌群的研究主要分為培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法兩種。利用傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)法，紅腐乳中主要的優(yōu)勢菌種為蠟狀芽孢桿菌和Virgibacillus senegalensis[14]；植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乳桿菌Akporo7和嗜鹽乳桿菌[33]也被發(fā)現(xiàn)存在于腐乳中。周婷婷等[34]分析了不同品牌白腐乳樣品的蠟樣芽孢桿菌總數(shù)，其中有2 個樣品的蠟樣芽孢桿菌數(shù)達(dá)到106CFU/g。Han等[31]對3 種類型腐乳中的不同微生物進(jìn)行了鑒定和計數(shù)，發(fā)現(xiàn)腐乳中致病菌有蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌。值得注意的是，由于樣品中存在大量的芽孢菌，干擾了金黃色葡萄球菌在選擇性平板上的生長，樣品中未能檢測到金黃色葡萄球菌，但在白腐乳和臭腐乳樣品中檢測到金黃色葡萄球菌腸毒素A?？梢?，運(yùn)用純培養(yǎng)法對于腐乳中微生物菌群的認(rèn)識有一定的局限性。

利用PCR-變性梯度凝膠電泳技術(shù)，比較不同品牌腐乳細(xì)菌多樣性，發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌屬是腐乳中細(xì)菌的優(yōu)勢菌群[35]。耿予歡等[36]建立了不依賴純培養(yǎng)的腸桿菌基因間重復(fù)一致序列-PCR技術(shù)，監(jiān)測了腐乳發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化。上述兩種方法雖然彌補(bǔ)了傳統(tǒng)純培養(yǎng)法的缺陷，但是均依賴于電泳技術(shù)，結(jié)果重現(xiàn)性相對較低。

高通量測序技術(shù)不僅能夠快速地分析復(fù)雜微生物群落多樣性，還能檢測到低存在率以及不可培養(yǎng)的微生物。劉亞棟[37]利用高通量測序分析菌屬發(fā)現(xiàn)同一品牌的紅、白和青腐乳之間細(xì)菌組成具有較大的差異性。Huang Xiaoning等[38]利用Illumina MiSeq高通量測序平臺發(fā)現(xiàn)腸桿菌屬、不動桿菌屬、乳球菌屬是紅腐乳發(fā)酵生產(chǎn)過程中的主要優(yōu)勢菌屬。

本研究利用高通量測序技術(shù)對不同地區(qū)紅腐乳中細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析。從屬水平上菌群結(jié)構(gòu)分布可知，不同地區(qū)的腐乳中細(xì)菌的多樣性存在差異。華東地區(qū)的腐乳主要優(yōu)勢菌屬為明串珠菌屬、乳球菌屬以及四聯(lián)球菌屬；芽孢桿菌屬則是東北地區(qū)紅腐乳的主要優(yōu)勢菌屬；此外，魏斯氏菌屬、梭菌屬則分別是華東地區(qū)（江蘇?。?、東北地區(qū)（黑龍江?。┧赜械木鷮?。

對9 種紅腐乳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行主成分分析，發(fā)現(xiàn)同一地區(qū)的紅腐乳樣品中菌群存在一定的聚類關(guān)系。目前，我國腐乳生產(chǎn)發(fā)酵依據(jù)豆腐坯培菌的菌種不同，可分為毛霉型、根霉型和細(xì)菌型[39]，如R8樣品是采用藤黃微球菌（Micrococcus luteus）進(jìn)行發(fā)酵的細(xì)菌型腐乳，使得菌群結(jié)構(gòu)不同于其他東北地區(qū)的樣品，兩個東北地區(qū)樣品菌群結(jié)構(gòu)距離較遠(yuǎn)。由于腐乳的生產(chǎn)過程多為開放式生產(chǎn)，且多為傳統(tǒng)的手工操作，生產(chǎn)車間空氣、主要接觸面以及生產(chǎn)過程中的原輔料中的微生物均會對最終的產(chǎn)品產(chǎn)生影響[7]，使得每個廠家的腐乳中微生物菌群具有一定的獨特性，這可能是R1樣品與其他華東地區(qū)樣品離散的原因；而R2樣品中還添加了玫瑰花作為輔料，玫瑰花中的微生物在后發(fā)酵過程中影響了該樣品的菌群結(jié)構(gòu)。

4 結(jié) 論

本研究通過高通量測序技術(shù)對不同地區(qū)紅腐乳中細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，對其中優(yōu)勢菌群組成進(jìn)行了初步分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本次測序深度有效地覆蓋了樣品中微生物種類，不同地區(qū)紅腐乳樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有豐富多樣性。在門水平上，厚壁菌門、放線菌門和變形菌門為紅腐乳中主要的門；而在屬水平上，不同地區(qū)紅腐乳樣品中優(yōu)勢菌在種類及相對分布上有較大的差異，明串珠菌屬、乳球菌屬以及四聯(lián)球菌屬為華北地區(qū)樣品中主要的優(yōu)勢菌屬，而東北地區(qū)腐乳樣品中的芽孢桿菌屬和鹽厭氧菌屬為主要的優(yōu)勢菌屬。