高通量測序分析大頭菜發(fā)酵過程中真菌的多樣性

吳進菊，曾瑞萍，張俊毅，張一舟，余海忠，于 博

（湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院·化學(xué)工程學(xué)院，湖北 襄陽 441053）

傳統(tǒng)發(fā)酵食品制作和食用歷史悠久，發(fā)酵系統(tǒng)開放，其中蘊藏了豐富的微生物資源[1]。近年來隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，高通量測序技術(shù)廣泛地用于發(fā)酵食品微生物多樣性的研究，如酸魚[2]、意大利香腸[3]、食醋[4-5]、甜面醬[6]、發(fā)酵酒[7-10]、發(fā)酵蔬菜[11-14]、發(fā)酵豆制品[15-19]、發(fā)酵乳[20-22]等。

湖北襄陽大頭菜是我國四大名腌菜之一，是襄陽市地理標志產(chǎn)品，具有2 000多年種植史，相傳是三國時期被諸葛亮發(fā)現(xiàn)并引入軍中廣泛食用，故又名諸葛菜。襄陽大頭菜需經(jīng)歷長達數(shù)月的發(fā)酵過程才能成熟。襄陽大頭菜的制作采用“三腌、五鹵、六曬”的傳統(tǒng)工藝，在發(fā)酵過程中逐步加入食鹽，大頭菜成熟時發(fā)酵液中的食鹽含量幾乎達到飽和狀態(tài)。目前，對傳統(tǒng)發(fā)酵大頭菜中微生物群落結(jié)構(gòu)、種群多樣性的研究相對較少，早期的研究基本是建立在傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)方法上[23-25]，近年來有研究人員采用聚合酶鏈式以應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）-變性梯度凝膠電泳技術(shù)和高通量測序技術(shù)對襄陽大頭菜腌制液膜醭進行了多樣性分析[26-28]，主要針對襄陽大頭菜正常發(fā)酵腌制液和長膜腌制液中細菌和真菌多樣性進行比較研究，找出引起發(fā)酵液長膜的主要微生物，為后續(xù)控制大頭菜的品質(zhì)提供一定的幫助。

本實驗采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對不同發(fā)酵時期傳統(tǒng)發(fā)酵大頭菜的真菌多樣性和菌群結(jié)構(gòu)進行分析，從基因水平全面揭示傳統(tǒng)發(fā)酵大頭菜發(fā)酵過程中真菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化，以期為今后傳統(tǒng)發(fā)酵大頭菜的工業(yè)化、標準化生產(chǎn)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大頭菜發(fā)酵液樣本 湖北孔明菜食品有限公司；FastPfu polymerase 北京全式金生物技術(shù)有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司；QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統(tǒng) Promega公司；DL2000 DNA Marker 寶生物工程（大連）有限公司；土壤基因組提取試劑盒 美國MP Biomedicals公司。

1.2 儀器與設(shè)備

9700型PCR儀 美國ABI公司；MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina公司；臺式冷凍離心機 德國Eppendorf公司；NanoDrop 2000紫外-可見分光光度計賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

大頭菜發(fā)酵液樣本由湖北孔明菜食品有限公司提供，采用“三腌、五鹵、六曬”的傳統(tǒng)工藝進行加工，按照加工工序的特點，在每一道腌制和鹵制工序完成后采集樣本，分別編號為1_1～1_8，每個發(fā)酵時期平行取3 個樣本，分別編號為a、b和c。樣本采集后低溫運送至實驗室，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣本總DNA的提取和PCR

將大頭菜發(fā)酵液樣本送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，采用土壤基因組提取試劑盒提取總DNA。以樣本中微生物總DNA為模板，以ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和ITS2R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）為上下游引物擴增真菌的ITS基因序列[29]。PCR采用20 μL（下同）以應(yīng)體系：總DNA 10 ng，5×FastPfu buffer 4 μL，dNTP mixture（各2.5 mmol/L）2 μL，上下游引物（各5 μmol/L）0.8 μL，F(xiàn)astPfu polymerase 0.4 μL，牛血清白蛋白0.2 μL，添加雙蒸水補充至20 μL。PCR條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.3.3 Illumina MiSeq測序和數(shù)據(jù)分析

將PCR產(chǎn)物純化和熒光定量后，構(gòu)建MiSeq文庫并進行雙端測序，測序讀長300 bp。MiSeq測序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進行拼接，同時對序列質(zhì)量進行質(zhì)控和過濾，得到優(yōu)化序列。采用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司I-Sanger云平臺進行在線數(shù)據(jù)分析。采用Usearch進行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析，對于相似性水平大于等于97%的OTU進行生物信息統(tǒng)計，其中每個OTU代表一個物種[30]。采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學(xué)分析，在各個分類水平統(tǒng)計樣本群落的組成。利用Mothur軟件計算樣本的α多樣性，包括Chao 1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Coverage值，以表征真菌群落的豐富度和多樣性。采用Qiime軟件計算樣本β多樣性距離矩陣，使用非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA）算法構(gòu)建樹狀結(jié)構(gòu)。

1.3.4 樣本序列的提交及序列號

將本研究中48 個fastq序列文件提交到美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）SRA數(shù)據(jù)庫（https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/sra），序列號為PRJNA534371。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果和α多樣性分析

通過Illumina MiSeq高通量測序，24 份大頭菜發(fā)酵液樣品共獲得1 299 970 條優(yōu)化序列，平均長度234.4～313.5 bp（表1）。去除無重復(fù)的單序列和嵌合體后，共獲得1 272 007 條有效序列。經(jīng)OTU分析，這些序列歸屬于4 個門、19 個綱、56 個目、106 個科、190 個屬、303 個種、516 個OTU。為保證樣本測序序列的均一性，對所有樣品有效序列按最小樣本序列數(shù)進行抽平（每個樣本30 774 條有效序列）。抽平后，所有樣品序列歸屬于4 個門、18 個綱、50 個目、99 個科、175 個屬、284 個種、483 個OTU，每個樣品的OTU分類信息見表1。

表1 樣品信息Table 1 Fungal community composition and OTUs identified in samples

Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù)以映群落的豐富度，Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Coverage值以映群落多樣性。每個樣品的Coverage值均為0.998以上，表明測序深度良好，覆蓋率高，可以真實展示樣品中的絕大多數(shù)真菌（表2）。在樣品1_1和1_2中，Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù)較高，表明樣品中群落的豐富度較高。而隨著發(fā)酵的進行，Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù)明顯下降，而在1_8中又有所提高。分析Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)在各樣品中的變化可知，群落多樣性也呈現(xiàn)出相似的趨勢。這可能是由于發(fā)酵前期加入的食鹽相對較少，所以樣品中真菌群落的豐富度和多樣性較高，而隨著發(fā)酵的進行，食鹽的添加量逐漸提高，導(dǎo)致不耐鹽的真菌逐漸消失，所以真菌群落的豐富度和多樣性有所下降。而在發(fā)酵的最后時期，真菌群落的豐富度和多樣性又有所提高，推測可能是有些真菌逐漸適應(yīng)了高鹽的環(huán)境，所以提高了真菌群落的豐富度和多樣性。

表2 α多樣性指數(shù)分析Table 2 α Diversity indices

2.2 不同發(fā)酵時期大頭菜發(fā)酵液樣本真菌群落結(jié)構(gòu)分析

在對大頭菜發(fā)酵液中不同分類學(xué)水平真菌菌群相對豐度進行分析的基礎(chǔ)上，進一步采用樣本層級聚類分析和主成分分析（principal component analysis，PCA）研究不同樣本真菌群落結(jié)構(gòu)的相似性和差異關(guān)系。在OTU分類水平上，采用bray-curtis距離算法，根據(jù)β多樣性距離矩陣進行層級聚類分析，使用UPGMA算法構(gòu)建樹狀結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖1所示。24 個大頭菜發(fā)酵液樣品可聚為3 類，其中1_1和1_2的6 個樣品聚為一類，1_3、1_4、1_5的9 個樣品和1_6a聚為一類，1_7、1_8的6 個樣品和1_6b、1_6c聚為一類。由此也可將整個發(fā)酵過程大致分為3 個階段，發(fā)酵前期、中期和后期。在發(fā)酵的相同階段，真菌群落組成結(jié)構(gòu)相似。

圖1 OTU水平上樣本真菌群落聚類分析Fig. 1 Cluster analysis of fungal communities of the samples at the OTU level

進一步PCA可知，不同樣本真菌群落結(jié)構(gòu)信息主要集中在前3 個主成分，其累計方差貢獻率為93.14%，其中PC1的貢獻率為53.01%，PC2的貢獻率為26.6%。如圖2所示，樣本之間的距離代表真菌群落結(jié)構(gòu)的差異程度。24 個大頭菜發(fā)酵液樣本呈現(xiàn)出明顯的聚類趨勢，除1_6a與II類有交叉外，1_1和1_2聚為I類，1_3、1_4和1_5聚為II類，1_6、1_7和1_8聚為III類，這與UPGMA聚類分析結(jié)果一致。

圖2 OTU水平上樣本真菌群落PCAFig. 2 Principal component analysis of fungal communities at the OTU level

2.3 門水平真菌群落組成分析

如圖3所示，去除未分類的真菌后，樣品中真菌群落包含3 個門，分別為子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）和接合菌門（Zygomycota）。其中子囊菌門為優(yōu)勢菌門，相對豐度為74.2%～99.8%。其次為擔子菌門，相對豐度為0.25%～25.7%。擔子菌門在前期和后期相對豐度較高，在中期較低。在所有樣品中接合菌門相對豐度最低，在0.2%以下。

圖3 門水平上真菌群落組成分析Fig. 3 Fungal community composition at the phylum level

2.4 目水平真菌群落組成分析

不同發(fā)酵時期大頭菜樣品在目水平的真菌群落組成如圖4所示，主要歸屬于11 個菌目，包括酵母目（Saccharomycetales）、炭角菌目（Xylariales）、散囊菌目（Eurotiales）、肉座菌目（Hypocreales）、格孢菌目（Pleosporales）、煤炱目（Capnodiales）、銀耳目（Tremellales）、Cystofilobasidiales、節(jié)擔菌目、norank_c__Sordariomycetes和傘型束梗孢菌目（Agaricostilbales），其他菌目相對豐度均為1%以下。

在1_1和1_2中，炭角菌目為優(yōu)勢菌目，相對豐度分別為60.2%和45.7%（平均值，下同），酵母目相對豐度僅為0.00%和0.07%。而在后續(xù)發(fā)酵過程中，酵母目取代炭角菌目，占據(jù)絕對優(yōu)勢，相對豐度達到了63.6%～99.5%。在1_1中，銀耳目相對豐度較高，為17.0%，而在1_2～1_4中降為3%以下，在1_5～1_8中降至1%以下。在整個發(fā)酵過程中，Cystofilobasidiales在1_1中相對豐度最高，為8.4%，其次為1_4中（2.1%），在其他6 個發(fā)酵時期相對豐度均在1%以下。

圖4 目水平上真菌群落組成分析Fig. 4 Fungal community composition at the order level

2.5 屬水平真菌群落組成分析

對屬水平總豐度排在前30的物種進行層級聚類，采用平均聚類方式，得到如圖5所示的群落組成熱圖。圖5表明了襄陽大頭菜不同發(fā)酵時期樣本間不同真菌菌屬的相對豐度以及真菌組成的差異性和和樣品間的相似性。在1_1和1_2中，明梭孢屬（Monographella）為優(yōu)勢菌屬，相對豐度分別為60.1%和45.6%。在1_3～1_5中，德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）占據(jù)了絕對的優(yōu)勢，相對豐度達到63.5%～96.3%。而在1_6～1_8中，接合酵母屬（Zygosaccharomyces）相對豐度大大提高，發(fā)展為優(yōu)勢菌屬，德巴利氏酵母屬相對豐度有較大幅度的下降，在1_7中接合酵母屬相對豐度超過德巴利氏酵母屬，成為相對豐度最高的菌屬（86.5%）。

由圖5可知，整個發(fā)酵過程樣品可聚為3 類，1_1和1_2在屬水平真菌群落結(jié)構(gòu)比較接近，歸為一類，1_3、1_4和1_5歸為一類，1_6、1_7和1_8歸為一類，分別對應(yīng)于發(fā)酵的前期、中期和后期，這與聚類分析和PCA結(jié)果一致?？傌S度排在前30的菌屬可聚為5 類，接合酵母屬和德巴利氏酵母屬聚為一類，在發(fā)酵前期豐度較低，而在發(fā)酵中后期豐度較高；赤霉菌屬（Gibberella）、unclassified_f__Trichocomaceae、鏈格孢屬（Alternaria）、Cystofilobasidium、Hannaella、Dioszegia、隱球菌屬（Cryptococcus）和鐮刀菌屬（Fusarium）聚為一類，在發(fā)酵前期和中期相對豐度較高，而在發(fā)酵后期相對豐度較低。

圖5 屬水平上真菌群落組成熱圖Fig. 5 Heatmap of fungal communities at the genus level

2.6 不同發(fā)酵階段OTU Venn圖分析

圖6 3 個發(fā)酵階段真菌群落OTU水平的Venn圖Fig. 6 Venn diagram analysis of fungal communities at the OTU level in the samples from three fermentation stages

利用Venn圖統(tǒng)計多個樣本中共有的和獨有的OTU的數(shù)量，可以直觀地顯示出不同分類水平樣本的組成相似性和重疊程度。24 個大頭菜發(fā)酵液樣本中共檢出483 個OTU，發(fā)酵前期OTU數(shù)量最多，達到329 個，其次為發(fā)酵中期（266 個），發(fā)酵后期樣本中OTU數(shù)量最少，為246 個。隨著發(fā)酵的進行，OTU數(shù)量有所降低，這可能是由于在發(fā)酵過程中逐步加入了大量的食鹽，抑制了不耐鹽真菌的生長。從圖6可以看出，3 個發(fā)酵階段共有OTU數(shù)為124 個，發(fā)酵前期、中期和后期特有OTU數(shù)分別為118、58 個和73 個，分別占各發(fā)酵階段總OTU數(shù)的35.87%、21.80%和29.67%。

3 結(jié) 論

采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對發(fā)酵過程中傳統(tǒng)發(fā)酵大頭菜的真菌多樣性和菌群結(jié)構(gòu)進行分析，經(jīng)OTU分類學(xué)分析，24 份樣本中共發(fā)現(xiàn)4 個門、19 個綱、56 個目、106 個科、190 個屬、303 個種、516 個OTU。α多樣性分析表明，在整個發(fā)酵過程中，前期真菌群落的豐富度和多樣性更高。通過聚類分析和PCA發(fā)現(xiàn)，24 個樣品可根據(jù)微生物群落結(jié)構(gòu)特征劃分為3 個聚類，將發(fā)酵的整個過程分為發(fā)酵前期、中期和后期，3 個發(fā)酵階段共有OTU數(shù)為124 個。去除未分類的真菌后，子囊菌門為優(yōu)勢菌門，相對豐度為74.2%～99.8%。目水平上，發(fā)酵前期炭角菌目為優(yōu)勢菌目，相對豐度為45.7%～60.2%，后續(xù)發(fā)酵過程中，酵母目取代炭角菌目，占據(jù)絕對優(yōu)勢，相對豐度達到63.6%～99.5%。屬水平上，發(fā)酵前期明梭孢屬為優(yōu)勢菌屬，相對豐度為45.6%～60.1%。發(fā)酵中期，德巴利氏酵母屬占據(jù)了絕對的優(yōu)勢，相對豐度達到63.5%～96.3%。而在發(fā)酵后期，接合酵母屬相對豐度大大提高，發(fā)展為優(yōu)勢菌屬，甚至超過德巴利氏酵母屬。本研究全面揭示了傳統(tǒng)發(fā)酵大頭菜發(fā)酵過程中真菌群落結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化，可為后續(xù)大頭菜發(fā)酵劑的制備提供一定理論基礎(chǔ)，對今后傳統(tǒng)發(fā)酵大頭菜的工業(yè)化、標準化生產(chǎn)具有極其重要的意義。