姜黃素與白首烏蛋白以及大豆分離蛋白相互作用的比較

邢永娜，馮 進(jìn)，李春陽,,

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210000）

姜黃素（curcumin，Cur）是姜黃、郁金等姜科植物根莖中最主要的生物活性成分之一，是一種脂溶性多酚[1]，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等功效[2]。Cur遇光容易分解、不耐熱、溶出速率慢，在腸道的堿性環(huán)境中不穩(wěn)定，難以被機(jī)體吸收，因此限制了Cur的生物利用度[3]，從而極大限制了Cur在食品工業(yè)中的應(yīng)用及其活性功能的體內(nèi)發(fā)揮[4]。為克服上述缺陷，研究者構(gòu)建了一系列蛋白質(zhì)納米顆粒用于Cur的荷載與穩(wěn)態(tài)化調(diào)控。其中，大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）來源廣泛、價(jià)格低廉，并且具備良好的表面活性與自主裝性質(zhì)，受到廣大研究者的青睞。陳飛平[5]研究發(fā)現(xiàn)，SPI納米顆粒中疏水區(qū)域的數(shù)量與疏水程度是影響SPI與Cur結(jié)合的重要因素。SPI荷載可以顯著提高Cur的熱穩(wěn)定性和消化過程中的膠束化率。同時(shí)，Cur的結(jié)合也改變了SPI納米顆粒的粒度分布和電位，并促進(jìn)蛋白質(zhì)酶解，從而提高其營養(yǎng)屬性。Tapal等[6]證明Cur主要通過疏水相互作用與SPI納米顆粒結(jié)合。與游離Cur相比，納米Cur的水溶性、胃腸道穩(wěn)定性、紫外穩(wěn)定性以及抗氧化活性均得到顯著提高。

白首烏是江蘇省濱海縣傳統(tǒng)的地產(chǎn)植物，該地區(qū)產(chǎn)量占全國總產(chǎn)量的95%，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益[7]。在深加工過程中，白首烏經(jīng)淀粉提取后所產(chǎn)生的廢渣和黃漿水一般作為廢液丟棄。這樣不僅導(dǎo)致環(huán)境污染，而且造成白首烏蛋白（Cynanchum auriculatum Royle ex Wight protein，CAP）、白首烏多糖等天然資源的浪費(fèi)。本課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)，CAP的pH穩(wěn)定性與SPI基本一致。另外，CAP的乳化性和起泡性均強(qiáng)于SPI，表明其具備良好的加工特性[8]。因此，探索CAP在Cur等活性因子遞送方面的潛力，不僅有助于為食品工業(yè)中微/納米遞送體系的構(gòu)建提供天然新壁材，又能促進(jìn)江蘇省特色白首烏資源的充分開發(fā)利用，帶動(dòng)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)首先通過穩(wěn)態(tài)熒光光譜研究Cur與SPI、CAP相互作用的類型和熱力學(xué)特征，采用傅里葉變換紅外光譜（Fourier-transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析了Cur與2 種蛋白質(zhì)相互作用的主要作用力，并結(jié)合遠(yuǎn)紫外圓二色光譜（circular dichroism，CD）和差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）法監(jiān)測Cur對2 種蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。在此基礎(chǔ)上，采用加速實(shí)驗(yàn)比較2 種納米顆粒對Cur熱穩(wěn)定性的提高效果。本研究結(jié)果可為CAP在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CAP由實(shí)驗(yàn)室自制；SPI（純度≥90%） 上海源葉生物科技有限公司；Cur（純度≥65%；總姜黃色素純度≥80%）、Na2HPO4、NaH2PO4阿拉丁試劑（上海）有限公司；二甲基亞砜 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FDU-1200真空冷凍干燥機(jī) 東京理化器械株式會(huì)社；8400全自動(dòng)凱氏定氮儀 丹麥福斯分析儀器公司；F4600UV-5500型熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；紫外-可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；DK-8D電熱恒溫水槽 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Nano-ZS90型納米粒度儀 英國Malvern Instruments公司；85-2A型磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司；Nicolet FTIR儀 美國Thermo公司；Q20 DSC儀 美國TA公司；J-1500 CD儀 日本Jasco公司。

1.3 方法

1.3.1 CAP提取

選取新鮮的白首烏塊根，清洗表面后，切成薄片，40 ℃烘干，用干燥機(jī)粉碎并過100 目篩。按照料液比1∶10（g/mL）加入去離子水，并用1.5 mol/L的NaOH溶液將提取液調(diào)至pH 9.0，室溫下用磁力攪拌器攪拌提取2 h，5 000 r/min離心20 min后收集上清液。重復(fù)提取2 次，合并上清液，使用1.5 mol/L HCl溶液將上清液調(diào)至pH 4.0，靜置30 min，離心收集沉淀，并用去離子水以復(fù)洗滌，真空冷凍后即得到CAP。采用凱氏定氮法檢測其中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為63.23%。

1.3.2 穩(wěn)態(tài)熒光檢測

分別用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL的SPI、CAP儲(chǔ)備液，充分溶解后過濾備用。用二甲基亞砜配制質(zhì)量濃度為20 mg/mL的Cur儲(chǔ)存液。將蛋白質(zhì)溶液用PBS稀釋至2 mg/mL，在磁力攪拌條件下將Cur儲(chǔ)存液緩慢滴入使其最終濃度分別達(dá)1.4×10-5、2.8×10-5、6×10-5、11.2×10-5、22.4×10-5、44.8×10-5mol/L。設(shè)定激發(fā)波長為278 nm，掃描波長范圍為300～450 nm。分別在35、42、49 ℃條件下收集蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光光譜。

1.3.3 FTIR分析

分別取CAP、SPI、Cur粉末以及Cur-CAP、Cur-SPI復(fù)合物凍干粉與KBr均勻混合研磨后制成透明薄片（樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%）進(jìn)行FTIR掃描。掃描波數(shù)為500～4 000 cm-1，掃描次數(shù)為32 次，分辨率為4 cm-1。

1.3.4 CD分析

將CAP、SPI溶液和Cur-CAP、Cur-SPI復(fù)合物溶液采用PBS適當(dāng)稀釋后，置于光程為1 mm的樣品池中。設(shè)定掃描溫度為25 ℃、掃描速率為50 nm/min，在190～250 nm波長范圍內(nèi)重復(fù)掃描8 次記錄樣品的圖譜，采用PBS溶液為空白對照。

1.3.5 DSC分析

稱取3～5 mg樣品放置在鋁盒中壓緊實(shí)密封，并用同樣條件處理的密封鋁盒作空白對照，升溫速率10 ℃/min，溫度范圍為20～200 ℃，干燥氮?dú)饬魉贋?0 mL/min，采用自帶軟件分析熱力學(xué)參數(shù)。

1.3.6 水動(dòng)力學(xué)直徑（DZ）與Zeta電位分析

采用動(dòng)態(tài)光散射測定蛋白質(zhì)和Cur-蛋白質(zhì)復(fù)合物的DZ、多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）以及Zeta電位。將樣品置于激光粒度儀中，使用He/Ne激光器（λ＝633 nm），測試前在25 ℃條件下平衡120 s，每次測試至少掃描10 次，測試3 次取平均值。

1.3.7 Cur熱穩(wěn)定性分析

分別將游離Cur、CAP復(fù)合Cur以及SPI復(fù)合Cur溶液分別在40 ℃和90 ℃水浴條件下孵育120 min，每間隔30 min取少量樣品與氯仿混合萃取其中Cur，萃取2 次后合并萃取液，用乙醇適當(dāng)稀釋，通過419 nm波長處的吸光度計(jì)算Cur剩余質(zhì)量分?jǐn)?shù)，Cur保留率（R）計(jì)算公式如下：

式中：C為不同時(shí)間樣品中的Cur質(zhì)量分?jǐn)?shù)；C0為Cur的初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用 ±s的形式表示，使用SPSS 18.0進(jìn)行方差分析，采用ANOVA法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 穩(wěn)態(tài)熒光光譜分析

蛋白質(zhì)的內(nèi)源性熒光主要來自于色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸殘基[9]。如圖1所示，278 nm激發(fā)波長條件下，CAP在325 nm波長左右產(chǎn)生熒光發(fā)射峰，而SPI在340 nm波長左右產(chǎn)生熒光發(fā)射峰。該結(jié)果表明，SPI中的熒光氨基酸殘基所處的微環(huán)境疏水性更強(qiáng)。隨著Cur濃度的增高，CAP和SPI的熒光強(qiáng)度逐漸降低并且發(fā)射峰的位置發(fā)生變化，表明兩者之間發(fā)生了強(qiáng)烈的相互作用。Cur可以通過動(dòng)態(tài)和靜態(tài)的方式淬滅蛋白質(zhì)分子的內(nèi)源熒光[10]，淬滅方式可以通過Stern-Volmer方程進(jìn)行分析[11]：

式中：F0和F分別為添加和不添加淬滅劑時(shí)蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光強(qiáng)度；KSV為Stern-Volmer淬滅常數(shù)；Kq為分子淬滅常數(shù)；τ0為不添加淬滅劑時(shí)熒光物質(zhì)的平均壽命（對于蛋白質(zhì)等生物大分子，熒光壽命一般為10-8s）。

圖1 激發(fā)波長278 nm條件下不同濃度Cur對CAP（A）和SPI（B）熒光發(fā)射光譜的影響Fig. 1 Effects of different concentrations of Cur on the fluorescence spectra of CAP (A) and SPI (B)

如圖2所示，對于Cur-CAP和Cur-SPI相互作用，Stern-Volmer方程的線性擬合度較高（R2＞0.9）（表1），表明Cur可以均勻地結(jié)合在蛋白質(zhì)的疏水熒光位點(diǎn)[12]。在35、42、49 ℃條件下，Cur對CAP內(nèi)源熒光的KSV分別為4.851×103、4.676×103、4.277×103L/mol；對SPI內(nèi)源熒光的KSV分別為7.914×103、7.134×103和6.971×103L/mol。由此可知，Cur對SPI的KSV高于CAP，且均隨著溫度的升高而減少。進(jìn)一步計(jì)算得到Cur對2 種蛋白質(zhì)的Kq均高于1011L/（mol·s），高出Kq的最大值（2×1010L/（mol·s））一個(gè)數(shù)量級(jí)[12]。因此，Cur與CAP和SPI 2 種蛋白質(zhì)的結(jié)合是一個(gè)靜態(tài)淬滅的過程，即Cur與2 種蛋白質(zhì)在基態(tài)時(shí)形成了不發(fā)光的復(fù)合物。對于靜態(tài)復(fù)合物，溫度的升高往往導(dǎo)致其穩(wěn)定性的下降，從而導(dǎo)致熒光淬滅程度的降低和KSV的下降[13]。靜態(tài)淬滅現(xiàn)象是多酚類化合物與蛋白質(zhì)結(jié)合的常見方式，在花青素-牛血清蛋白[13]、兒茶素-牛血清蛋白[14]以及白藜蘆醇-SPI相互作用的研究中均有報(bào)道[15]。

圖2 不同溫度條件下Cur與CAP（A）和SPI（B）相互作用的Stern-Volmer曲線Fig. 2 Stern-Volmer plots for Cur-CAP (A) and Cur-SPI (B)interaction at different temperatures

表1 不同溫度條件下Cur與CAP和SPI結(jié)合的Stern-Volmer的KSV和KqTable 1 Stern-Volmer constant KSV and biomolecular quenching constant Kq for Cur-CAP and Cur-SPI interaction at different temperatures

對于靜態(tài)淬滅，研究者多采用雙對數(shù)Stern-Volmer模型來研究小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合常數(shù)Kb和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n[16]：

如圖3所示，在不同溫度條件下，Cur與2 種蛋白質(zhì)相互作用的雙倒數(shù)Stern-Volmer曲線的線性擬合度較高（R2＞0.94）。因此，Kb和n可以通過擬合直線與y軸的交點(diǎn)和斜率確定。在35、42、49 ℃條件下，Cur與CAP的結(jié)合常數(shù)分別為7.620×103、8.786×103、9.508×103L/mol，而Cur與SPI的結(jié)合常數(shù)分別為8.382×103、9.183×103、9.931×103L/mol（表2）。由此可知，Cur與2 種蛋白質(zhì)的結(jié)合常數(shù)均隨溫度的升高而增加，并且相同溫度下Cur與SPI的結(jié)合常數(shù)高于CAP。Cur與CAP或者SPI相互作用的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)接近于1，表明兩者之間形成了一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

圖3 不同溫度條件下Cur與CAP（A）和SPI（B）相互作用的雙倒數(shù)Stern-Volmer曲線Fig. 3 Double reciprocal Stern-Volmer plots for Cur-CAP (A) and Cur-SPI (B) interaction at different temperatures

表2 不同溫度條件下Cur與CAP和SPI的Kb和nTable 2 Binding constant Kb and numbers of binding sites n for Cur-CAP and Cur-SPI interaction at different temperatures

在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步結(jié)合熱力學(xué)方程計(jì)算Cur與蛋白質(zhì)結(jié)合的吉布斯自由能（ΔG）、焓變（ΔH）和熵變（ΔS）等熱力學(xué)參數(shù)：ΔH＞0、ΔS＞0，主要表現(xiàn)為疏水作用力；ΔH＜0、ΔS＜0，主要表現(xiàn)為氫鍵和范德華力；ΔH＜0、ΔS＞0，主要表現(xiàn)為靜電作用力[17]：

式中：K1和K2分別對應(yīng)不同溫度下的結(jié)合常數(shù)/（L/mol）；T1和T2分別對應(yīng)不同的實(shí)驗(yàn)溫度/K；R為理想氣體常數(shù)8.314（J/mol·K）。

如表3所示，Cur與CAP或SPI相互作用ΔH與ΔS均大于0，表明兩者的結(jié)合過程是吸熱的，主要靠兩者之間的疏水相互作用驅(qū)動(dòng)。在此過程中，水分子和以離子的釋放導(dǎo)致體系混亂程度的增加。另外，兩者的結(jié)合是一個(gè)吉布斯自由能降低的自發(fā)以應(yīng)（ΔG＜0）。ΔG絕對值越高，表明結(jié)合作用越強(qiáng)。因此，在相同溫度下，Cur與SPI的結(jié)合能力高于其與CAP的結(jié)合能力，與前面的研究結(jié)果一致。同樣，Ying Ming等[18]發(fā)現(xiàn)，Cur與胃蛋白酶結(jié)合的ΔH與ΔS均大于0。然而，Ali等[19]研究表明，Cur與α-2-巨球蛋白相互作用的是由焓變與熵變共同驅(qū)動(dòng)的結(jié)果，表明除疏水相互作用外，兩者的復(fù)合還有可能伴隨氫鍵的生成。因此，Cur與蛋白質(zhì)的相互作用與蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)有密切的關(guān)系。

表3 不同溫度下Cur與CAP和SPI結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters for Cur-CAP and Cur-SPI interaction

2.2 FTIR分析

圖4 CAP、SPI、Cur以及2 種蛋白質(zhì)的Cur復(fù)合物的FTIR圖譜Fig. 4 FTIR spectra of CAP, SPI, Cur, Cur-CAP and Cur-SPI complexes

FTIR可以測定不同狀態(tài)、不同濃度及不同環(huán)境中蛋白質(zhì)和多肽，是目前研究生物大分子結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的有效手段[20]。如圖4所示，CAP在3 257.66（酰胺A帶，代表N—H伸縮振動(dòng)和氫鍵）、1 636.79（酰胺I帶，代表C＝O伸縮振動(dòng)）、1 508.54 cm-1（酰胺II帶，代表C—N伸縮振動(dòng)和N—H彎曲振動(dòng)）有明顯紅外吸收[21]。Cur的特征吸收峰主要在3 501.98（酚羥基O—H伸縮振動(dòng)、1 601.82（C＝C伸縮振動(dòng)）、1 511.23（C—C—C面內(nèi)彎曲振動(dòng)）、995.56（苯環(huán)C—H面外振動(dòng)）、425.79 cm-1（C—C—C伸縮振動(dòng)、C—OH面內(nèi)彎曲振動(dòng)等）[22]。Cur中代表C＝C伸縮振動(dòng)的特征吸收峰（1 601.82 cm-1）可以在Cur-CAP中檢測到，代表苯環(huán)C—H面外振動(dòng)的特征吸收峰（995.56 cm-1）可以在Cur-SPI中檢測到，表明Cur通過非共價(jià)鍵與2 種蛋白有效結(jié)合形成復(fù)合物。與CAP相比，Cur-CAP復(fù)合物的酰胺I帶吸收峰發(fā)生了藍(lán)移（從1 636.79 cm-1位移至1 625.22 cm-1），而酰胺II帶吸收峰發(fā)生了紅移（從1 508.54 cm-1位移至1 512.49 cm-1）。同時(shí)，與Cur復(fù)合后，CAP在酰胺I帶和酰胺II帶的吸收峰型變尖銳。以上結(jié)果證明，CAP與Cur之間發(fā)生了強(qiáng)烈的疏水相互作用，這與穩(wěn)態(tài)熒光分?jǐn)?shù)據(jù)相吻合[23]。另外，Cur-CAP復(fù)合物的酰胺A帶吸收峰也發(fā)生了藍(lán)移（從3 257.66 cm-1位移至3 250.91 cm-1），表明氫鍵相互作用也參與了該復(fù)合物的形成。與CAP相似，SPI在于Cur結(jié)合后酰胺A帶、酰胺I帶、酰胺II帶吸收峰的位置均發(fā)生了明顯變化。唯一不同的是，Cur-SPI復(fù)合物中的酰胺II帶吸收峰也發(fā)生了藍(lán)移，表明氫鍵和疏水相互作用同樣是Cur與SPI結(jié)合的主要結(jié)合力。Zhou Mingyong等[24]報(bào)道，Cur復(fù)合可以顯著改變低密度脂蛋白/果膠納米凝膠酰胺A、I和II帶的位置和吸收強(qiáng)度。

2.3 遠(yuǎn)紫外CD分析

遠(yuǎn)紫外CD圖譜（190～250 nm）主要以映Cur結(jié)合對2 種蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。如圖5A所示，CAP在210 nm左右波長處存在明顯的負(fù)吸收峰，而Cur的加入導(dǎo)致了CAP負(fù)吸收峰的紅移與強(qiáng)度的減弱，表明其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化。通過Dichroweb在線分析，發(fā)現(xiàn)CAP中含有21.63%α-螺旋、30.20%β-折疊、21.22%β-轉(zhuǎn)角以及26.95%無規(guī)卷曲[25]。與CAP相比，Cur-CAP復(fù)合物中α-螺旋的含量顯著減少，并且伴隨著其他3 種二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的增加。SPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成為：23.62%α-螺旋、25.91%β-折疊、23.42%β-轉(zhuǎn)角以及27.05%無規(guī)卷曲。Cur復(fù)合導(dǎo)致SPI中α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量的降低以及β-折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的增加。前面報(bào)道中，研究人員發(fā)現(xiàn)，Cur結(jié)合可以導(dǎo)致胃蛋白酶中有序α-螺旋和β-折疊含量的降低以及β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量的增加[18]。另外，Li等[26]報(bào)道，Cur對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響與pH有關(guān)，酸性條件下，Cur結(jié)合不會(huì)明顯改變?chǔ)?乳球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，而中性條件下，Cur會(huì)顯著提高β-乳球蛋白中α-螺旋、β-折疊以及β-轉(zhuǎn)角的含量。因此，可推測Cur結(jié)合對蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響可能與蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)以及所處環(huán)境特征有密切關(guān)聯(lián)。

圖5 CAP（A）、Cur-CAP（B）、SPI（C）和Cur-SPI（D）的遠(yuǎn)紫外CD圖Fig. 5 Far-UV CD spectra of CAP (A), Cur-CAP (B), SPI (C)and Cur-SPI (D)

2.4 DSC分析

圖6 DSC分析Fig. 6 DSC thermograms

DSC主要以映Cur的結(jié)合對蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的影響情況，從中可以獲得熔融峰溫度（Tp）及熔融焓（ΔH）等參數(shù)。Tp主要以映維持2 種蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的氫鍵、疏水相互作用的強(qiáng)弱；ΔH主要以映蛋白質(zhì)中有序結(jié)構(gòu)的含量[27]。如圖6所示，CAP在120 ℃左右出現(xiàn)寬吸熱峰，而Cur呈現(xiàn)高結(jié)晶態(tài)，在180 ℃左右出現(xiàn)尖銳的吸熱峰。兩者復(fù)合后，CAP-Cur分別在93.11 ℃和117.04 ℃出現(xiàn)吸熱峰，且吸熱峰的ΔH均小于CAP，表明Cur結(jié)合導(dǎo)致了CAP三級(jí)構(gòu)象穩(wěn)定性的降低以及有序結(jié)構(gòu)的減少。與之相以，Cur結(jié)合將SPI的Tp從121.70 ℃提高至125.23 ℃，將ΔH由232.70 J/g降低至209.76 J/g。因此，Cur提高了SPI的三級(jí)構(gòu)象穩(wěn)定性。另外，Cur的尖銳吸熱峰在2 種復(fù)合物熱譜中均未檢測到，表明Cur以非結(jié)晶態(tài)的形式分散在蛋白質(zhì)基質(zhì)中，從而證明了蛋白質(zhì)對Cur的包埋和荷載。

2.5 DLS分析

表4 CAP、SPI與其復(fù)合物的DZ、PDI和Zeta電位Table 4 DZ, PDI and zeta potential of CAP, SPI, Cur-CAP and Cur-SPI

從表4可以看出，CAP和SPI在水溶液中分別組裝成直徑為110.34 nm和198.23 nm的納米顆粒。兩者的PDI均小于0.3，證明粒度的分布較為均一。在中性條件下（pH 7.0），CAP與SPI顆粒的Zeta電位（-16.02、-20.95 mV）均為負(fù)值，表明兩者表面攜帶大量的負(fù)電荷，這與蛋白質(zhì)中羧基的去質(zhì)子化有關(guān)。在過去研究中，Chen Feiping等[28]報(bào)道SPI納米顆粒的DZ一般小于100 nm，僅為本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的一半。推測這有可能與不同實(shí)驗(yàn)條件下SPI的聚集程度有關(guān)。Cur復(fù)合后，2 種蛋白質(zhì)的直徑、PDI以及Zeta電位均有明顯增加。通過穩(wěn)態(tài)熒光實(shí)驗(yàn)和FTIR實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Cur主要通過疏水相互作用與蛋白質(zhì)結(jié)合。因此，高疏水性的Cur可能作為介質(zhì)將CAP和SPI進(jìn)行進(jìn)一步交聯(lián)。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，Zhou Mingyong等[24]同樣發(fā)現(xiàn)Cur荷載可以增加低密度脂蛋白-果膠納米顆粒的直徑。

2.6 Cur熱穩(wěn)定性分析

Cur的化學(xué)穩(wěn)定性較差，在光照、加熱、中性和堿性條件下易發(fā)生降解。從圖7A可以看出，40 ℃時(shí)，Cur降解迅速，120 min后保留率低于20%。當(dāng)環(huán)境溫度升高至90 ℃時(shí)，Cur的熱穩(wěn)定性進(jìn)一步降低，在30 min時(shí)的損失接近80%，在120 min時(shí)的保留率低于10%（圖7B）。有研究報(bào)道，Cur在90 ℃孵育過程2 h后，保留率在10%左右[28]，與研究結(jié)果較為一致。與CAP或者SPI結(jié)合后，Cur的化學(xué)穩(wěn)定性得到不同程度地提高。在40 ℃條件下，Cur在各時(shí)間點(diǎn)穩(wěn)定性強(qiáng)弱順序?yàn)椋篊AP結(jié)合Cur≈SPI結(jié)合Cur＞游離Cur。在以應(yīng)結(jié)束時(shí)，2 種結(jié)合Cur保留率在70%左右。在90 ℃條件下，SPI結(jié)合Cur的穩(wěn)定性最高，其次為CAP結(jié)合Cur，最后是游離Cur。對于結(jié)合態(tài)Cur，蛋白質(zhì)可以有效將Cur與環(huán)境中的不利因素隔絕，并抑制了Cur在中性條件下去質(zhì)子化向Cur-的轉(zhuǎn)變，從而起到保護(hù)效果。據(jù)報(bào)道，SPI、卵白蛋白均可以提高Cur的熱穩(wěn)定性[28-29]。在90 ℃孵育過程中，各時(shí)間點(diǎn)SPI結(jié)合Cur的保留率均高于CAP結(jié)合Cur。在穩(wěn)態(tài)熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Cur與SPI的相互作用較強(qiáng)（Kb與ΔG更高），因此SPI與Cur的結(jié)合更加緊密，保護(hù)效果較好。通過DSC發(fā)現(xiàn)，Cur復(fù)合后，CAP的熱穩(wěn)定性降低，這也有可能會(huì)降低CAP對Cur的保護(hù)效果。另外，Cur-CAP復(fù)合物的直徑（159.98 nm）低于Cur-SPI復(fù)合物（244.34 nm）。雖然納米結(jié)構(gòu)對提高包埋物質(zhì)的腸道吸收和生物利用度更加有利，但是同時(shí)卻增加了Cur與周圍環(huán)境的接觸面積[30]，導(dǎo)致熱穩(wěn)定性的降低。

圖7 游離Cur、CAP結(jié)合Cur以及SPI結(jié)合Cur保留率隨時(shí)間的變化Fig. 7 Degradation kinetics of free Cur and Cur bound to CAP or SPI

3 結(jié) 論

Cur通過靜態(tài)方式淬滅CAP和SPI的內(nèi)源熒光。Cur與2 種蛋白質(zhì)的結(jié)合是吉布斯自由能降低的自發(fā)以應(yīng)，主要由疏水相互作用驅(qū)動(dòng)。相同溫度下，Cur對SPI的結(jié)合能力高于CAP。FTIR分析進(jìn)一步證實(shí)了Cur與2 種蛋白質(zhì)通過疏水相互作用結(jié)合。Cur結(jié)合改變了2 種蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并降低了CAP的熱穩(wěn)定性、提高了SPI的熱穩(wěn)定性。2 種蛋白質(zhì)在水溶液中均能組裝成直徑小于200 nm的結(jié)構(gòu)。Cur結(jié)合導(dǎo)致2 種蛋白質(zhì)直徑和表面攜帶負(fù)電荷的進(jìn)一步增加。CAP與SPI可以有效提高Cur在熱處理過程中的穩(wěn)定性，CAP的保護(hù)效果相對較弱。從上述結(jié)果來看，CAP具備成為Cur等小分子活性物質(zhì)納米運(yùn)載體系的潛力。在后續(xù)研究中，應(yīng)采用物理、化學(xué)處理或者與多糖復(fù)合進(jìn)一步提高CAP對Cur的保護(hù)效果。