近江牡蠣多糖的結(jié)構(gòu)鑒定及免疫調(diào)節(jié)能力分析

楊大俏，王錦旭，李來好，楊賢慶，馬海霞，岑劍偉，王悅齊

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；3.韓山師范學(xué)院食品工程與生物科技學(xué)院，廣東 潮州 521041）

近江牡蠣（Crassostrea rivularis）是瓣鰓綱牡蠣目牡蠣科海洋雙殼類軟體動(dòng)物，是我國四大養(yǎng)殖貝類之一，在廣東、廣西、福建、山東、浙江等沿海地區(qū)有大量人工養(yǎng)殖[1]。其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，含有豐富的蛋白質(zhì)[2]和碳水化合物，因其鋅含量極高，富含鐵、鈣等元素，素有“海洋牛奶”[3]的稱號(hào)，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，牡蠣重鎮(zhèn)安神，滋陽補(bǔ)陰，軟堅(jiān)散結(jié)，收斂固澀，對(duì)驚悸失眠、勞神傷脾、陽痿、腰痛、崩漏等癥有一定療效。

多糖是由10 個(gè)以上單糖通過糖苷鍵聯(lián)結(jié)在一起的大分子，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和真菌中，具有提高機(jī)體免疫力[4]、抗腫瘤[5-6]、抗氧化[7]、抗病毒[8]、抗衰老[9]等生物活性。前人對(duì)牡蠣多糖的研究集中于牡蠣多糖的提取、活性研究及簡單結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，太平洋牡蠣多糖主要由葡萄糖[10]組成，是以→4）-α-D-Glc-（1→為主鏈，含→3,4）-β-DGlc-（1→）支鏈的D-吡喃型葡聚糖，分子質(zhì)量為1 299 kDa[11]。另外針對(duì)近江牡蠣多糖提取工藝及活性研究，結(jié)果表明，水提醇沉法制備粗多糖得率達(dá)9.72%[12]，近江牡蠣多糖具有增強(qiáng)免疫功能[13]及抗腫瘤[14]的活性。目前有關(guān)近江牡蠣多糖的結(jié)構(gòu)分析及活性研究較少，且多集中于粗多糖的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)[15-16]，關(guān)于近江牡蠣多糖的超濾膜分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及純化多糖的免疫調(diào)節(jié)還鮮有報(bào)道。為高值化利用近江牡蠣資源，本課題對(duì)近江牡蠣粗多糖進(jìn)行純化，得到3 種近江牡蠣純化多糖。采用液相色譜分析法、傅里葉變換紅外光譜法、高碘酸氧化法及Smith降解法研究近江牡蠣多糖的結(jié)構(gòu)；噻唑蘭法、中性紅實(shí)驗(yàn)、利用試劑盒檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌及mRNA的表達(dá)，用于研究近江牡蠣多糖的免疫調(diào)節(jié)能力。以期為近江牡蠣多糖生物活性作用機(jī)制與分子結(jié)構(gòu)間的關(guān)系和近江牡蠣多糖的應(yīng)用提供有用信息和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

近江牡蠣全臟器（-20 ℃冷凍保藏） 廣東省臺(tái)山市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；Alcalase酶（210 AU/mg）、胰蛋白酶（≥250 U/mg） 廣州齊云生物技術(shù)有限公司；離子交換填料DEAE纖維素DE-52、Sephadex G-100葡聚糖凝膠 北京Biotopped科技有限公司；1,9-二甲基亞甲基藍(lán)、葡聚糖、氨基葡萄糖、11 種單糖、D-葡萄糖醛酸等標(biāo)準(zhǔn)品、磷酸緩沖液、DMEM高糖培養(yǎng)基溶液、胰蛋白酶、胎牛血清、鏈霉素、青霉素、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、噻唑蘭 美國Sigma公司；乙腈（色譜純） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；中性紅、腫瘤壞死因子TNF-α、白介素IL-6、白介素IL-1βELISA試劑盒、一氧化氮檢測(cè)試劑盒、FastStart Universal SYBR Green Master試劑盒、Transcriptor cDNA Synth Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、6 孔/96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板、透氣細(xì)胞培養(yǎng)瓶、無菌離心管華宇欣生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Sunrise-basic Tacan吸光酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；FlowMem0021-HP三聯(lián)高壓平板膜設(shè)備 廈門福美科技有限公司；LC-20AD高效液相色譜儀、IRAffinity-1紅外光譜儀、GC-2010氣相色譜儀 日本島津公司；S1000聚合酶鏈?zhǔn)揭詰?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國Bio-Rad公司；Mastercycler realplex實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 德國Eppendorf公司；NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計(jì) 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 近江牡蠣多糖的制備與純化過程

近江牡蠣全臟器→勻漿→均質(zhì)10 min→熱水浸提→調(diào)pH 8.0→酶解→煮沸滅酶→離心（9 000 r/min，10 min）→上清液調(diào)pH 7.0→0.22 μm濾膜除雜→200 kDa膜分離→收集濾過液→濾過液經(jīng)8 kDa膜分離[17]→收集8 kDa截留液→凍干得粗多糖CRRS-B[18]→樣品溶解→DEAE-52陰離子交換柱層析→蒸餾水洗脫→收集組分→乙酸鈉洗脫→收集組分→氯化鈉洗脫→收集組分→透析→冷凍干燥→得近江牡蠣純化多糖CRP-1、CRP-2、CRP-3。

1.3.2 近江牡蠣多糖分子質(zhì)量和純度測(cè)定

采用高效凝膠滲透色譜法[19]測(cè)定近江牡蠣多糖組分CRRS-B的分子質(zhì)量分布，流動(dòng)相為0.2 mol/L硫酸鈉溶液，檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積20 μL，流速0.7 mL/min，色譜柱為Tosoh Biosep?G4000SWXL（7.8 mm×300 mm，5 μm），分別用流動(dòng)相配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的不同分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液：平均分子質(zhì)量為1 000、5 000、10 000、50 000、150 000、410 000、670 000 Da的葡聚糖按照一定比例混合后，多糖樣品配制為0.5 mg/mL，用孔徑為0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)高效液相色譜儀，用峰面積歸一法計(jì)算粗多糖分子質(zhì)量的分布情況。

將凍干后的多糖樣品CRRS-B以蒸餾水溶解配制成10 mg/mL，上DEAE-52纖維素柱，分別以蒸餾水、0.1 mol/L乙酸鈉、0.5 mol/L乙酸鈉、0.01 mol/L氯化鈉、0.1 mol/L氯化鈉、1 mol/L氯化鈉梯度洗脫，以苯酚-硫酸法[20]測(cè)定洗脫溶液吸光度，收集洗脫組分，將各洗脫組分透析除鹽。將各洗脫組分分別上Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱，以蒸餾水洗脫，繪制洗脫曲線。

1.3.3 近江牡蠣多糖理化性質(zhì)測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定純化多糖（CRP-1、CRP-2及CRP-3）中總糖含量；采用1,9-二甲基亞甲基藍(lán)[21]測(cè)定純化多糖中酸性糖含量；采用尹珊珊等[22]的方法測(cè)定甲基戊糖含量；采用硫酸-咔唑法[23]測(cè)定己糖醛酸含量；采用明膠-氯化鋇比濁法[24-25]測(cè)定硫酸基含量；采用Wanger法[26]測(cè)定氨基己糖含量。

1.3.4 近江牡蠣多糖單糖組成分析

樣品水解及標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化方法參照陳燕文等[27]的方法，采用液相色譜法測(cè)定樣品中多糖組成。液相色譜條件：Gracesmart C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為100 mmol/L磷酸鈉緩沖溶液，流動(dòng)相B為乙腈；檢測(cè)波長250 nm；柱溫30 ℃；流速1 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；程序洗脫：0～10 min，85% A；10～30 min，85%～83% A；30～35 min，8 3%～8 0% A；35～36 min，80%～60% A；36～40 min，60%～85% A。

1.3.5 近江牡蠣多糖傅里葉變換紅外光譜分析

多糖樣品2 mg與100 mg溴化鉀混合研細(xì)后，在4 000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜掃描[19]。

1.3.6 高碘酸氧化和Smith降解

參照文獻(xiàn)[28]的方法，記錄高碘酸鈉消耗量、甲酸生成量，將經(jīng)過高碘酸氧化及Smith降解的溶液水解、乙酰化后利用氣相色譜及Rtx-1701毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）進(jìn)行醇類化合物定性測(cè)定。

1.3.7 近江牡蠣多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性的測(cè)定

利用噻唑蘭法[29-30]檢測(cè)近江牡蠣多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞存活率的影響；中性紅實(shí)驗(yàn)[30-31]檢測(cè)近江牡蠣多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響；利用試劑盒檢測(cè)近江牡蠣多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞一氧化氮及細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的影響；利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒檢測(cè)近江牡蠣多糖對(duì)巨噬細(xì)胞mRNA表達(dá)的影響。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以上實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過3 次重復(fù)操作，數(shù)值以 ±s表示。采用IBM SPSS Statistics 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用單因素方差分析其顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 近江牡蠣純化多糖的分子質(zhì)量測(cè)定

圖1 不同分子質(zhì)量葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品擬合曲線（a）及近江牡蠣多糖的分子質(zhì)量分布（b）Fig. 1 Fitting curve of glucan standards with different molecular masses (a) and molecular mass distribution of polysaccharides (b) from C. rivularis

由圖1可知，近江牡蠣粗多糖經(jīng)過凝膠滲透色譜分析得3 個(gè)峰的分子質(zhì)量分別為124.5、67.0 kDa和8.3 kDa，使用DEAE-52將其分離，依次使用蒸餾水、0.1 mol/L乙酸鈉、0.5 mol/L乙酸鈉、0.01 mol/L氯化鈉、0.1 mol/L氯化鈉、1 mol/L氯化鈉洗脫，結(jié)果見圖2。得到水洗組分CRP-1，0.5 mol/L乙酸鈉洗組分CRP-2，0.01 mol/L氯化鈉洗組分CRP-3。由圖3可知，3 種組分分別經(jīng)Sephadex G-100檢驗(yàn)得到對(duì)稱的洗脫曲線，與高效凝膠滲透色譜法相互驗(yàn)證，表明近江牡蠣純化多糖CRP-1、CRP-2、CRP-3為純度較好的分子質(zhì)量分別為124.5、67.0 kDa和8.3 kDa的單一組分多糖。

圖2 近江牡蠣多糖的梯度洗脫曲線Fig. 2 Gradient elution curve of polysaccharides from C. rivularis by DEAE-52 column chromatography

圖3 CRP-1～3的Sephadex G-100的洗脫曲線Fig. 3 Elution curves of CRP-1-3 by Sephadex G-100 column chromatography

2.2 近江牡蠣純化多糖理化性質(zhì)分析

苯酚-硫酸法測(cè)得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝7.468 2x-0.004 7，R2＝0.999 0，測(cè)得CRP-1、CRP-2、CRP-3的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（32.40±0.89）%、（78.50±1.90）%、（73.46±2.19）%。1,9-二甲基亞甲基藍(lán)法測(cè)得酸性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝1.257 8x+0.002 2，R2＝0.999 0，測(cè)得結(jié)果中顯示CRP-1、CRP-2、CRP-3的酸性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（0.28±0.01）%、（2.12±0.36）%、（2.74±0.46）%。采用文獻(xiàn)[22]的方法測(cè)得甲基戊糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝0.150 8x+0.215 1，R2＝0.999 6，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、（9.36±0.62）%、（7.55±0.22）%。硫酸-咔唑法測(cè)得己糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝0.007 5x+0.096 9，R2＝0.999 3，測(cè)得結(jié)果顯示CRP-1、CRP-2、CRP-3的己糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（2.29±0.11）%、（16.14±0.63）%、（23.85±0.51）%。明膠-氯化鋇比濁法測(cè)得硫酸基標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝0.473 8x+0.025 5，R2＝0.990 9，測(cè)得其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（1.60±0.08）%、（26.50±1.67）%、（27.02±3.39）%。Wanger法測(cè)得氨基己糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝0.035 2x-0.001，R2＝0.990 8，測(cè)得CRP-1、CRP-2、CRP-3的氨基己糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（18.62±0.55）%、（71.65±9.49）%、（41.04±7.17）%。

2.3 近江牡蠣純化多糖的單糖組成

圖4 單糖標(biāo)準(zhǔn)品和CRP-1～3的單糖高效液相色譜圖Fig. 4 High performance liquid chromatograms of standard monosaccharides and monosaccharides derived from CRP-1 through 3

通過對(duì)多糖水解及其衍生化產(chǎn)物的測(cè)定，可以得出單糖組成和物質(zhì)的量比。多糖經(jīng)水解、衍生化，液相色譜測(cè)定，與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間相互對(duì)比，即可得到樣品中的單糖組成和物質(zhì)的量比。如圖4所示，與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖對(duì)比可知，近江牡蠣多糖CRP-1主要由甘露糖、核糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，9 種單糖的物質(zhì)的量比為5.55∶0.32∶9.08∶0.47∶0.66：48.13∶3.57∶8.53∶0.30，其中葡萄糖、氨基葡萄糖、半乳糖、甘露糖、氨基半乳糖含量之和達(dá)74.86%，葡萄糖含量最高。CRP-2主要由甘露糖、核糖、氨基葡萄糖、葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖組成，6 種單糖的物質(zhì)的量比為7.79∶0.41∶12.69∶32.08∶4.98∶15.92，葡萄糖、半乳糖、氨基葡萄糖、甘露糖、氨基半乳糖的含量之和達(dá)73.87%，其中氨基葡萄糖及氨基半乳糖含量高達(dá)17.67%。CRP-3主要由氨基葡萄糖、半乳糖醛酸、葡萄糖組成，3 種單糖的物質(zhì)的量比為8.91∶5.71∶10.15，醛酸所占比例達(dá)到23.05%。

2.4 近江牡蠣多糖的傅里葉變換紅外光譜分析

圖5 CRP-1～3的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 5 Fourier transform infrared spectra of CRP-1 through 3

從圖5a可以看出，3 442.94 cm-1的強(qiáng)吸收峰為—OH鍵的伸縮振動(dòng)吸收，2 958.8 cm-1為—CH3基團(tuán)的以對(duì)稱伸縮振動(dòng)，2 924.09 cm-1出現(xiàn)C—H強(qiáng)伸縮振動(dòng)峰，2 852.72 cm-1的—CH2的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，2 360.87 cm-1為C—H彎曲振動(dòng)，其中，3 442.94 cm-1及2 924.09 cm-1為糖類化合物的特征峰。1 641.42 cm-1為—CHO的C＝O的伸縮振動(dòng)，1 458.18 cm-1為—CH3基團(tuán)的以對(duì)稱彎曲振動(dòng)峰，1 413.82 cm-1為C—O對(duì)稱振動(dòng)，10 31.92 cm-1為吡喃糖環(huán)的C＝O伸縮振動(dòng)。表明CRP-1為多醛基吡喃環(huán)糖苷的多糖化合物。

從圖5b可以看出，3 439.08 cm-1為—OH鍵的強(qiáng)伸縮振動(dòng)，3 290.56 cm-1為—NH2的以對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，3 184.48 cm-1為—OH與—COOH的二聚體OH的伸縮振動(dòng)，2 983.88 cm-1為芳環(huán)與不飽和碳的伸縮振動(dòng)，2 362.80 cm-1為—CH彎曲振動(dòng)，1 400～1 200 cm-1的吸收峰為C—H的變角振動(dòng)吸收峰，其中，3 439.08 cm-1及C—H變角振動(dòng)峰為糖類化合物的特征峰。1 701.22 cm-1的吸收峰為酮基的C＝O鍵的伸縮振動(dòng)峰，1 683.86 cm-1處的吸收峰為—CH2—CO—NH—等酰胺的C＝O伸縮振動(dòng)峰，1 641.42 cm-1是順式或乙烯基的C＝C伸縮振動(dòng)峰，1 415.75 cm-1吸收峰是C—O對(duì)稱振動(dòng)峰，1 051.20 cm-1及1 020.34 cm-1是C—O伸縮振動(dòng)峰，644.22 cm-1掩蓋吸收峰是—OH搖擺振動(dòng)峰，644.22 cm-1為—C≡CH鍵的彎曲振動(dòng)峰的基頻峰，1 238.56 cm-1為其彎曲振動(dòng)倍頻峰。表明CRP-2為多酮基不飽和多糖化合物。

從圖5c可以看出，3 446.79 cm-1為—OH鍵的強(qiáng)伸縮振動(dòng)，3 288.63 cm-1為—NH2的以對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，3 176.76 cm-1為—OH與—COOH的二聚體OH的伸縮振動(dòng)，3 014.74 cm-1為芳環(huán)與不飽和碳的伸縮振動(dòng)，2 360.87 cm-1為—CH彎曲振動(dòng)，1 400～1 200 cm-1的吸收峰為C—H的變角振動(dòng)吸收峰，其中，3 446.79 cm-1及2 360.87 cm-1為C—H變角振動(dòng)峰是糖類化合物的特征峰。1 703.14 cm-1的吸收峰為酮基的C＝O鍵的伸縮振動(dòng)峰，1 687.71 cm-1的吸收峰為—CH2—CO—NH—等酰胺的C＝O的伸縮振動(dòng)峰，1 639.49 cm-1為順式或乙烯基的C＝C的伸縮振動(dòng)峰，1 413.38 cm-1吸收峰為—COOH的彎曲及伸縮振動(dòng)峰，1 051.20 cm-1及1 020.34 cm-1為C—O伸縮振動(dòng)峰，642.30 cm-1為—C≡CH鍵的彎曲振動(dòng)峰的基頻峰。表明CRP-3為多酮基含羧基多不飽和多糖化合物。

2.5 近江牡蠣多糖的高碘酸氧化和Smith降解

近江牡蠣多糖CRP-1～3經(jīng)高碘酸氧化120 h后達(dá)到穩(wěn)定，吸光度分別為0.148、0.027、0.092，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝0.053x-0.055 9（R2＝0.991 8）計(jì)算，可知消耗高碘酸的量分別為0.19、0.08、0.14 mmol；用0.01 mol/L氫氧化鈉溶液滴定，得到甲酸生成量分別為0.041、0.037、0.043 mmol。近江牡蠣多糖CRP-1～3經(jīng)高碘酸氧化后生成甲酸，說明含有1→6位糖苷鍵或非還原末端（1→），高碘酸的消耗量大于甲酸生成量的2 倍，說明含有只消耗高碘酸而不產(chǎn)生甲酸的糖苷鍵，如1→2、1→4、1→2,4、1→4,6位糖苷鍵及不消耗高碘酸也不產(chǎn)生甲酸的1→3位糖苷鍵，根據(jù)甲酸消耗量推測(cè)CRP-1中1→6位或1→位連接的糖苷鍵為0.082 mol，以1→2位或1→4位鍵合的糖基為0.108 mol；CRP-2中1→6位或1→位連接的糖苷鍵為0.074 mol，以1→2位或1→4位鍵合的糖基為0.006 mol；CRP-3中1→6位或1→位連接的糖苷鍵為0.086 mol，以1→2位或1→4位鍵合的糖基為0.094 mol。

樣品經(jīng)過高碘酸氧化后，生成多糖醛，進(jìn)一步經(jīng)過Smith降解，多糖醛還原成醇類化合物，根據(jù)不同生成物質(zhì)判斷糖苷鍵連接方式，其中1→2位糖苷鍵還原，生成甘油；1→4位糖苷鍵還原，生成赤蘚醇和乙二醇；1→6位糖苷鍵還原，生成甘油和乙二醇；1→3位糖苷鍵不被氧化降解。將利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)還原出的醇類化合物進(jìn)行定性，結(jié)果如圖6所示，得知CRP-1被還原出甘油、乙二醇及赤蘚醇，CRP-2被還原出甘油、赤蘚醇、乙二醇，CRP-3被還原出甘油及赤蘚醇，說明CRP-3中無1→4位及1→6位糖苷鍵。

圖6 醇類化合物標(biāo)準(zhǔn)品及近江牡蠣多糖Smith降解后的氣相色譜圖Fig. 6 Gas chromatograms of alcohol standards and Smith degradation products of CRP-1, 2 and 3

2.6 近江牡蠣多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性

2.6.1 近江牡蠣多糖對(duì)細(xì)胞存活率的影響

為排除所用試樣對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞有藥理毒害作用的因素，故以細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)其細(xì)胞毒性及給藥濃度。如圖7所示，各質(zhì)量濃度的近江牡蠣粗多糖及500 μg/mL的純化多糖與RAW264.7共同培養(yǎng)24 h，與對(duì)照組相比，細(xì)胞存活率無明顯差異，判斷近江牡蠣多糖不抑制巨噬細(xì)胞的正常生長作用（P＞0.05），因此近江牡蠣多糖可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

圖7 不同質(zhì)量濃度近江牡蠣粗多糖CRRS-B和500 μg/mL CRP-1～3對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響Fig. 7 Effects of different concentrations of CRRS-B and CRPs-1 through 3 at 500 μg/mL on survival rate of RAW264.7 cells

2.6.2 近江牡蠣多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

圖8 不同質(zhì)量濃度近江牡蠣粗多糖CRRS-B和近江牡蠣純化多糖（500 μg/mL）CRP-1～3對(duì)RAW264.7吞噬中性紅的影響Fig. 8 Effects of different concentrations of CRRS-B and CRPs-1 through 3 (500 μg/mL) on neutral red phagocytosis of RAW264.7 cells

吞噬細(xì)胞的主要功能是吞噬病原體等異物[32]，為了研究近江牡蠣多糖對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響，檢測(cè)經(jīng)試樣培養(yǎng)的RAW264.7對(duì)中性紅試劑的吞噬功能。如圖8所示，與空白組相比，CRRS-B、CRP-1～3和LPS，均能使巨噬細(xì)胞的吞噬能力顯著增強(qiáng)（P＜0.05），在同一質(zhì)量濃度下，近江牡蠣純化多糖對(duì)小鼠吞噬細(xì)胞中性紅吞噬能力的影響力排序?yàn)镃RP-3＞CRP-1＞CRP-2。

2.6.3 近江牡蠣多糖對(duì)效應(yīng)因子和細(xì)胞因子分泌的影響2.6.3.1 近江牡蠣純化多糖對(duì)NO的影響

病原體、細(xì)胞碎片或外來異物刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)因子，進(jìn)一步刺激其他免疫細(xì)胞的生成，以構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)，其中NO是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的主要效應(yīng)分子和活性介質(zhì)，激活淋巴球等其他免疫細(xì)胞而在非特異性免疫應(yīng)答中發(fā)揮主要細(xì)胞效應(yīng)[33-34]。如圖9所示，近江牡蠣多糖CRP-1、CRP-2及CRP-3能夠顯著增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞NO的生成能力（P＜0.01），且CRP-3＞CRP-1＞CRP-2。

圖9 近江牡蠣純化多糖CRP-1～3（500 μg/mL）對(duì)RAW264.7 NO生成的影響Fig. 9 Effects of CRPs-1 through 3 (500 μg/mL) on NO production of RAW264.7 cells

2.6.3.2 近江牡蠣純化多糖對(duì)TNF-α、IL-6和IL-1β的影響

為了研究近江牡蠣多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的影響，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒方法檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌。如圖10所示，與空白組相比，經(jīng)近江牡蠣多糖CRP-1、CRP-3和LPS處理組分泌的TNF-α、IL-6和IL-1β顯著提高（P＜0.01），CRP-2能夠增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌（P＜0.05），且CRP-3＞CRP-1＞CRP-2，表明近江牡蠣多糖能夠顯著誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞生成TNF-α、IL-6和IL-1β，增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答能力。

2.6.4 近江牡蠣多糖對(duì)mRNA表達(dá)的影響

巨噬細(xì)胞分泌NO、TNF-α、IL-6和IL-1β等效應(yīng)因子和細(xì)胞因子，可有效激活其他免疫細(xì)胞，細(xì)胞因子的合成主要受相應(yīng)的一氧化氮合酶iNOS、TNF-α、IL-6和IL-1β等相關(guān)基因的調(diào)控，為了進(jìn)一步確認(rèn)近江牡蠣多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞NO生成和細(xì)胞因子分泌的影響，采用RT-PCR試劑盒法檢測(cè)近江牡蠣多糖對(duì)iNOS、TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA相對(duì)表達(dá)的影響。

圖11 近江牡蠣純化多糖CRP-1～3（500 μg/mL）對(duì)RAW264.7 mRNA表達(dá)的影響Fig. 11 Effects of CRPs-1 through 3 (500 μg/mL) on mRNA expression levels of iNOS and cytokines in RAW264.7 cells

如圖11所示，經(jīng)CRP-1～3和LPS處理后，RAW264.7中iNOS、TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)均被顯著上調(diào)（P＜0.01），CRP-3＞CRP-1＞CRP-2，證明近江牡蠣多糖能夠通過誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞上調(diào)相關(guān)基因的表達(dá)，生成效應(yīng)因子NO和分泌細(xì)胞因子，從而激活免疫應(yīng)答。

3 結(jié) 論

CRP-1的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（32.40±0.89）%，分子質(zhì)量為124.5 kDa，是組分均一的多糖，由甘露糖、核糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，9 種單糖的物質(zhì)的量比為5.55∶0.32∶9.08∶0.47∶0.66∶48.13∶3.57∶8.53∶0.30。CRP-2的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（78.50±1.90）%，分子質(zhì)量為67.0 kDa，是由甘露糖、核糖、氨基葡萄糖、葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖組成，6 種單糖的物質(zhì)的量比為7.79∶0.41∶12.69∶32.08∶4.98∶15.92。CRP-3的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（73.46±2.19）%，分子質(zhì)量為8.3 kDa，是由氨基葡萄糖、半乳糖醛酸、葡萄糖組成，3 種單糖的物質(zhì)的量比為8.91∶5.71∶10.15。傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果顯示，CRP-1為多醛基吡喃環(huán)糖苷的多糖化合物；CRP-2為多酮基不飽和多糖化合物；CRP-3為多酮基含羧基多不飽和多糖化合物。

以小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7為模型，證明近江牡蠣多糖CRP-1～3能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞中性紅的吞噬能力，具有免疫調(diào)節(jié)活性；且近江牡蠣純化多糖CRP-1～3能夠顯著增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞效應(yīng)因子NO和細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌，上調(diào)mRNA表達(dá)iNOS、TNF-α、IL-6和IL-1β等細(xì)胞因子并誘導(dǎo)NO、TNF-α、IL-6、IL-1β等細(xì)胞因子的分泌，近江牡蠣純化多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性大小為CRP-3＞CRP-1＞CRP-2。

本實(shí)驗(yàn)采用分級(jí)膜分離聯(lián)產(chǎn)制備近江牡蠣多糖及近江牡蠣多肽，并對(duì)近江牡蠣多糖進(jìn)行分子質(zhì)量測(cè)定、DEAE-52純化、單糖組成分析、傅里葉變換紅外光譜測(cè)定、糖苷鍵類型測(cè)定及免疫活性測(cè)定，結(jié)果表明聯(lián)產(chǎn)制備出的近江牡蠣多糖具有制備價(jià)值。

4 討 論

CRP-3的氨基葡萄糖和半乳糖醛酸的相對(duì)含量遠(yuǎn)高于CRP-1和CRP-2，其酸性糖含量和己糖醛酸含量較高，且其分子質(zhì)量最小，因而CRP-3的免疫調(diào)節(jié)能力最高，此結(jié)論進(jìn)一步驗(yàn)證了胡雪瓊等[13]對(duì)近江牡蠣糖胺聚糖的研究；對(duì)于CRP-1及CRP-2而言，兩者的主要差別為CRP-2的氨基葡萄糖和氨基半乳糖遠(yuǎn)高于CRP-1，推斷吞噬能力大小為CRP-1＞CRP-2，由不同單糖組成差異導(dǎo)致，具體影響機(jī)制有待進(jìn)一步研究。