QuEChERS凈化結(jié)合UHPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定飼料中β-受體激動(dòng)劑類和喹噁啉類藥物

劉新輝 紀(jì)祥龍 孫艷麗* 王情情 周秀芝 李芳華 劉 梅 張 帥

(1.山東拜爾檢測(cè)股份有限公司，山東濰坊261000；2.山東省綠色食品發(fā)展中心，山東濟(jì)南250000）

β-受體激動(dòng)劑在生物體內(nèi)具有“再分配效應(yīng)”， 使用β-受體激動(dòng)劑可以顯著增加動(dòng)物骨骼肌的重量，同時(shí)減少脂肪的重量，但對(duì)整體的體重沒(méi)有顯著的影響，提高了飼料轉(zhuǎn)化率和胴體的瘦肉率，并可減少蛋白的分解，常見(jiàn)于畜禽養(yǎng)殖中的違法添加。但因添加劑量遠(yuǎn)大于人類的治療劑量，家畜攝入后，較高的殘留量在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間殘留，人類食用后可能會(huì)產(chǎn)生行走不穩(wěn)、肌肉震顫、心律失常、惡心、暈眩等中毒癥狀，對(duì)高血壓、冠心病、甲狀腺功能亢進(jìn)者影響尤為嚴(yán)重[1]。

喹噁啉類藥物是具有喹噁啉-N1，N4-二氧化物基本結(jié)構(gòu)的一類化學(xué)合成的動(dòng)物專用藥，具有廣譜抗菌、提高飼料轉(zhuǎn)化率和增加畜禽瘦肉率的作用。藥物中的N→O 基團(tuán)具有致癌、致畸、致突變性，在體內(nèi)脫氧代謝過(guò)程中伴隨氫氧自由基的產(chǎn)生，對(duì)細(xì)胞組織有很強(qiáng)的破壞作用，引起DNA損傷和毒害[2]。

在飼料β-受體激動(dòng)劑和喹噁啉類的檢測(cè)過(guò)程中，樣品中的脂類物質(zhì)、蛋白質(zhì)、金屬離子會(huì)干擾待測(cè)物檢測(cè)，基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)或抑制效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致化合物的測(cè)試回收率與實(shí)際回收率相差很大，影響回收率的計(jì)算，導(dǎo)致測(cè)試數(shù)據(jù)與實(shí)際結(jié)果存在較大偏差。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)NY/T 3145—2017《飼料中22種β-受體激動(dòng)劑的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》、農(nóng)業(yè)部2086 號(hào)公告-5-2014《飼料中卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》中均采用固相萃取凈化。經(jīng)驗(yàn)證：外加標(biāo)樣品及陽(yáng)性樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的豐度比超出標(biāo)準(zhǔn)要求范圍，通過(guò)調(diào)整色譜分離條件依舊不滿足要求，表明凈化結(jié)果不理想，難以準(zhǔn)確定性。

本研究采用Cleanert LipoNo 和Cleanert PSA進(jìn)行凈化，較固相萃取凈化基質(zhì)去除率更高且豐度比滿足標(biāo)準(zhǔn)要求，并實(shí)現(xiàn)了飼料中20 種β-受體激動(dòng)劑類和3 種喹噁啉類藥物的同時(shí)檢測(cè)，可在一定程度上解決復(fù)雜樣品基質(zhì)分析難的問(wèn)題，并對(duì)飼料中2類藥物的檢測(cè)提供了新的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Cleanert LipoNo、Cleanert PSA（平均粒徑：40～60 μm；平均孔徑：60 ?；比表面：480 m2/g），購(gòu)自天津博納艾杰爾公司；乙腈、甲醇、乙酸、乙酸銨均為色譜純，購(gòu)自德國(guó)CNW公司；無(wú)水硫酸鈉、氯化鈉為分析純，購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；沙丁胺醇、萊克多巴胺鹽酸鹽、硫酸特布他林、馬布特羅鹽酸鹽，購(gòu)自BePure公司；鹽酸克倫特羅、鹽酸班布特羅、克侖普羅、馬噴特羅鹽酸鹽、喹乙醇、卡巴氧，購(gòu)自Dr.Ehrensorfer公司；齊帕特羅、西馬特羅、西布特羅、妥布特羅鹽酸鹽，購(gòu)自WITEGA公司；氯丙那林、溴布特羅、噴布特羅鹽酸鹽、福莫特羅酒石酸鹽、克倫特羅內(nèi)標(biāo)-D9、鹽酸萊克多巴胺-D6、沙丁胺醇-D3，購(gòu)自曼哈格公司；利托君，購(gòu)自TRC公司；喹烯酮，購(gòu)自中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290Ⅱ-6460QQQ(配有電噴霧離子源(ESI)及Masshunter Quantitative B.08.00 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))，購(gòu)自美國(guó)Agilent 公司；ME 240E 分析天平，購(gòu)自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；AS-E40UVT-R純水儀，購(gòu)自重慶奧思德儀器設(shè)備有限公司；DG-2500R 多管漩渦混合儀，購(gòu)自上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司；N-EVAP112 氮吹儀，購(gòu)自O(shè)rganomation Associates Inc 公司；3K15 冷凍離心機(jī)，購(gòu)自德國(guó)sigma 實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)股份有限公司；Dispensette?Organic分液器，購(gòu)自德國(guó)BRAND公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.3.1 單一標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取20 種獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及3 種內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各10 mg（精確到0.01 mg）用甲醇溶解，定容至10 ml 容量瓶中，配制成1.0 mg/ml 的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20 ℃下保存待用。

1.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

從1.3.1 單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中各吸取0.5 ml 溶液于50 ml 容量瓶中，以甲醇將其稀釋定容為10 μg/ml 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0.5 ml 于50 ml容量瓶中，以甲醇將其稀釋定容為100 ng/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃下避光保存；按同樣方式將3 種內(nèi)標(biāo)物稀釋為100 ng/ml 的混合內(nèi)標(biāo)工作液，于4 ℃下避光保存。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Agilent InfinityLabPoroshell 120 EC-C18色譜柱（3.0 mm×10 mm，1.8-Micron，薄殼型反相C18填料）；流動(dòng)相：A 為5 mmol/l 乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸），B 為甲醇（含0.1%甲酸）；流速0.45 ml/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量2 μl；采樣梯度洗脫程序：0～1 min，

10% B；1～2 min，10% B～60% B；2～3 min，60% B；3～3.5 min，60% B～90% B；3.5～5 min，90% B；5～5.5 min，90% B～10% B；5.5～7 min，10% B。

1.4.2 質(zhì)譜條件

儀器系統(tǒng)配備三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI），正離子模式下多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）采集方式。干燥氣溫度為325 ℃，干燥氣流速為9 L/min，鞘氣溫度為350 ℃，鞘氣流速為10 L/min，霧化器壓力為35 psi，具體的質(zhì)譜條件如表1所示。

1.4.3 樣品前處理

制樣：抽取有代表性的飼料樣品，用四分法縮減取樣。粉碎后過(guò)0.45 mm孔徑的分析篩[3]，混勻，裝入磨口瓶中備用。

提取：準(zhǔn)確稱取2.0 g樣品（精確至0.01 g）于50 ml具塞聚丙烯離心管中，加入內(nèi)標(biāo)工作溶液100 μl，靜置10 min。加入5 ml 1%乙酸水溶液，渦旋混勻2 min后靜置10 min[4]。加入20 ml 1%乙酸乙腈，于渦旋振蕩器上劇烈振蕩10 min、40 ℃超聲提取10 min、再劇烈振蕩5 min，加入2 g 氯化鈉[5-6]，渦旋混勻2 min，在8 000 r/min條件下離心5 min。

表1 20種獸藥及3種內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜檢測(cè)條件

凈化：移取10 ml 上清液于Cleanert LipoNo 凈化管中（凈化管中事先稱入2 g無(wú)水硫酸鈉、0.5 g Cleanert PSA[7]），渦旋混勻2 min，靜置分層。移取5 ml 上清液在40 ℃下氮?dú)獯蹈桑尤? ml 復(fù)溶液（甲醇∶乙腈∶水=1∶1∶8）渦旋溶解，過(guò)0.22 μm濾膜后待測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品凈化方式的優(yōu)化

Cleanert LipoNo為大顆粒填料，凈化后靜置1 min即可，無(wú)需離心，操作簡(jiǎn)單。與傳統(tǒng)QuEChERS方法比較，簡(jiǎn)化了操作步驟。在購(gòu)置的Cleanert LipoNo 凈化管中稱入0.5 g Cleanert PSA，PSA有兩個(gè)氨基，pKa值分別為10.1和10.9，可與金屬離子產(chǎn)生螯合作用，用于提取金屬離子，有效降低了金屬離子導(dǎo)致的基質(zhì)效應(yīng)。本研究與固相萃取凈化相比，無(wú)需特殊裝置、成本低、操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短，符合當(dāng)前高通量的發(fā)展趨勢(shì)。

2.2 樣品預(yù)處理?xiàng)l件的優(yōu)化

本試驗(yàn)考察了乙腈、1%乙酸乙腈、1%乙酸水-1%乙酸乙腈3 種提取溶劑對(duì)提取效果的影響。結(jié)果顯示：1%乙酸水-1%乙酸乙腈做提取溶劑時(shí)，回收率最高且精密度最好，乙腈做提取溶劑時(shí)回收率最差。分析原因是因?yàn)橐宜崴乃庾饔眉皹悠方?jīng)過(guò)預(yù)先浸潤(rùn)后目標(biāo)物與提取溶劑的接觸面積增大[8]，故獲得了最高的提取效率。

部分飼料中蛋白質(zhì)含量較高，如不有效去除將影響目標(biāo)物離子化并損傷色譜柱。沉淀蛋白質(zhì)的溶劑主要有酸、沉淀劑和有機(jī)溶劑。本研究考慮到目標(biāo)物的溶解性、提取溶劑的浸潤(rùn)性和與基質(zhì)固相分散萃取的兼容性，采用了有機(jī)溶劑沉淀法[9]，經(jīng)考察比較發(fā)現(xiàn)1%乙酸乙腈比1%乙酸甲醇效果好。

2.3 除脂填料的確定

飼料中脂類的去除程度將決定最終上機(jī)溶液的澄清度及基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱，比較了Cleanert LipoNo、Cleanert ODS C18、Captiva EMR-Lipid、乙腈飽和正己烷4種凈化方式。其中Cleanert LipoNo填料表面修飾了許多長(zhǎng)的碳鏈，可針對(duì)性地吸附脂肪，對(duì)甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯均有高選擇性的吸附效果[10]，其分子結(jié)構(gòu)如圖1所示，可有效降低油脂引起的基質(zhì)效應(yīng)。

C18 能有效吸附油脂，但需要經(jīng)過(guò)離心，且最終復(fù)溶液澄清度差，陽(yáng)性樣品確證實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差大于28.9%，難以滿足法規(guī)要求；Captiva EMR-Lipid可高選擇性、高效地去除脂質(zhì)，而不會(huì)造成分析物損失。新型EMR-Lipid 技術(shù)結(jié)合了體積排阻和疏水相互作用[11-12]，在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)去除，最大程度減少目標(biāo)分析物的離子抑制，從而顯著提高方法的可靠性和耐用性；因飼料樣品種類多且基質(zhì)復(fù)雜，利用乙腈飽和正己烷凈化，極易發(fā)生乳化現(xiàn)象[13]，后續(xù)操作難以進(jìn)行。本試驗(yàn)研究了以上4 種凈化方式對(duì)飼料提取液凈化效果的影響，4 種不同填料分別稱取1 g，考察對(duì)甘油單油酸酯、辛酸甘油二酯、甘油三月桂酸酯的去除效率，結(jié)果如圖2 所示，可以看出，Cleanert LipoNo 和Captiva EMR-Lipid 可獲得較滿意的除脂效果，綜合考量成本和前處理的便捷性，確定Cleanert LipoNo為最佳的除脂填料。

圖1 甘油單油酸酯、辛酸甘油二酯、甘油三月桂酸酯的分子結(jié)構(gòu)

圖2 Cleanert LipoNo、Cleanert ODS C18、Captiva EMR-Lipid、乙腈飽和正己烷對(duì)脂質(zhì)的去除效率

2.4 基質(zhì)去除材料的確定

比較了Cleanert LipoNo+PSA（質(zhì)量比4/1）、C18+PSA（質(zhì)量比1/1）、PRIME HLB、氧化鋯、疏水體積排阻材料5 種基質(zhì)去除方式。以基質(zhì)最為復(fù)雜的配合飼料為試驗(yàn)材料，把5種基質(zhì)去除材料的最終萃取物進(jìn)行GC/MS 全掃描[14]，對(duì)全掃描色譜圖進(jìn)行積分，計(jì)算得出了5種填料對(duì)樣品的基質(zhì)去除率分別為85%、70%、83%、55%、74%。結(jié)果表明5 種材料中，Cleanert LipoNo+PSA 能夠更有效地去除樣品中的基質(zhì)干擾。分析原因可能是因?yàn)镃leanert LipoNo+PSA 的組合高選擇性的吸附了油脂、有機(jī)酸、色素、金屬離子和酚類[15]。

2.5 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

目標(biāo)物經(jīng)色譜分離時(shí)，流動(dòng)相、進(jìn)樣介質(zhì)、進(jìn)樣體系、色譜柱類型均會(huì)影響色譜峰型。飼料提取液經(jīng)凈化后依舊存在復(fù)雜的干擾物，本研究所用色譜柱中的薄殼型反相C18 填料使目標(biāo)物僅在表面薄殼內(nèi)進(jìn)行吸附分配，通過(guò)降低擴(kuò)散路徑改善了被分析物的傳質(zhì)效率[16]，提高了柱效，峰型更尖銳、靈敏度更高；使用純乙腈為進(jìn)樣介質(zhì)時(shí)，會(huì)因溶劑效應(yīng)造成峰分叉，最終確定甲醇∶乙腈∶水=1∶1∶8為最佳復(fù)溶液；使用甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)，化合物色譜峰會(huì)拖尾、不對(duì)稱、靈敏度低，加入乙酸銨改善了分離度，加入甲酸促進(jìn)了目標(biāo)物的離子化，因此選擇5 mmol/l乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）-甲醇（含0.1%甲酸）為最佳流動(dòng)相。

在液質(zhì)聯(lián)用中由于非揮發(fā)性組分與待測(cè)物質(zhì)在霧滴表面離子化的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，這種競(jìng)爭(zhēng)可能會(huì)增強(qiáng)或者抑制被分析物離子的形成效能，也就是說(shuō)被分析物離子的形成效能與進(jìn)入電噴霧離子源的基質(zhì)密切相關(guān)[17]。本研究在質(zhì)譜儀采集方法中設(shè)置分段掃描，將目標(biāo)物出峰前強(qiáng)極性的污染物切入廢液，避免其在離子源中的集聚，進(jìn)一步降低了離子化過(guò)程中基質(zhì)干擾導(dǎo)致的基質(zhì)效應(yīng)[18]。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性范圍與定量限

完成前處理與儀器測(cè)定的優(yōu)化后，按1.4.3 的方法制備空白基質(zhì)溶液，并用此基質(zhì)空白溶液對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液逐級(jí)稀釋成1、5、10、35、50 ng/ml 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液并依次進(jìn)UHPLC-MS/MS 測(cè)定，X 軸設(shè)定為質(zhì)量濃度作為橫向坐標(biāo)，Y軸設(shè)定為峰面積作為縱向坐標(biāo)，由此完成標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制并進(jìn)行線性回歸。所得結(jié)果表明：20種獸藥的濃度范圍為1～50 ng/ml時(shí)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2取值范圍為0.990 3～0.999 1，具備試驗(yàn)的可行性；同時(shí)，以S/N≥10確定β-受體激動(dòng)劑類定量限為5 μg/kg、喹噁啉類定量限為50 μg/kg。

2.6.2 方法的準(zhǔn)確度與精密度

分別選取配合飼料、濃縮飼料、精料補(bǔ)充料、添加劑預(yù)混合飼料陰性樣品基質(zhì)，根據(jù)定量限水平進(jìn)行加標(biāo)，按照確定的提取、凈化方法在選定的儀器條件下進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度水平重復(fù)測(cè)定6 次，計(jì)算所得各種藥物的平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍如表2 所示，可見(jiàn)方法的回收率高、重現(xiàn)性好。

表2 平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍

2.7 與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法比較

與NY/T 3145—2017《飼料中22種β-受體激動(dòng)劑的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》、農(nóng)業(yè)部2086 號(hào)公告-5—2014《飼料中卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》標(biāo)準(zhǔn)相比，無(wú)需固相萃取凈化，適用于大批量樣品的操作，即可作為篩查手段又可準(zhǔn)確定性定量；所用試劑種類少且用量少，廉價(jià)易得，環(huán)境友好；β-受體激動(dòng)劑類的標(biāo)準(zhǔn)定量限為10 μg/kg，本方法定量限為5 μg/kg；喹噁啉類標(biāo)準(zhǔn)定量限為200 μg/kg 或400 μg/kg，本方法定量限為50 μg/kg，定量限的降低除得益于儀器靈敏度的提高外，也進(jìn)一步說(shuō)明了凈化方法的除雜效果好，背景干擾低。

2.8 實(shí)際樣品的檢測(cè)

從市場(chǎng)上隨機(jī)購(gòu)買了40 份飼料（配合飼料、濃縮飼料、精料補(bǔ)充料、添加劑預(yù)混合飼料各10 份）進(jìn)行檢測(cè)，其中2 份飼料喹烯酮含量分別為4 670、1 880 μg/kg；1 份飼料克倫特羅含量為8.8 μg/kg。檢測(cè)過(guò)程中按2倍定量限進(jìn)行加標(biāo)，作為試驗(yàn)過(guò)程中的質(zhì)控，喹烯酮回收率為90.6%，克倫特羅回收率為96.8%。陽(yáng)性樣品的檢出及較高的回收率，進(jìn)一步證明了方法的可行性和準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

通過(guò)優(yōu)化樣品預(yù)處理?xiàng)l件、基質(zhì)去除材料、色譜和質(zhì)譜條件，建立了飼料中β-受體激動(dòng)劑和喹烯酮類物質(zhì)的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。本方法前處理簡(jiǎn)單、精密度高，Cleanert LipoNo與PSA相結(jié)合可有效去除脂質(zhì)與金屬離子，較低的基質(zhì)效應(yīng)可有效降低檢出限并提高了定性準(zhǔn)確性，是各類飼料中β-受體激動(dòng)劑和喹烯酮類物質(zhì)含量水平檢測(cè)分析的有效方法。無(wú)論對(duì)承檢機(jī)構(gòu)還是企業(yè)內(nèi)部質(zhì)控，本研究方法在試劑耗材的購(gòu)入、預(yù)處理方法及儀器方法的優(yōu)化設(shè)置上都較現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)易于實(shí)行。更低的檢出限將更易檢出陽(yáng)性樣品，更好的凈化效果將延長(zhǎng)色譜柱壽命、減少對(duì)質(zhì)譜儀的污染并保證定性結(jié)果的準(zhǔn)確性。