產(chǎn)黃曲霉毒素生物降解酶枯草芽孢桿菌菌株的篩選及發(fā)酵工藝研究

孫 標(biāo) 白祿宏 韓立虎 母紹林*

（1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058；2.浙江啟潤生物科技有限公司，浙江嘉興314000）

黃曲霉毒素(Aflatoxin)是由黃曲霉、寄生曲霉浸染15%以上的小麥、玉米等農(nóng)作物、飼料、食品等產(chǎn)生的有毒性的代謝產(chǎn)物[1]，是一種強致癌物質(zhì)，其毒性是氰化鉀的10 倍，砒霜的68 倍，苯并芘的4 000 倍。迄今發(fā)現(xiàn)的各種真菌毒素中最穩(wěn)定、毒性最強的一種為黃曲霉毒素B1（AFB1），因而世界衛(wèi)生組織把AFB1定為IA類致癌物質(zhì)[2]。

我國畜禽飼料的霉菌毒素污染現(xiàn)象較為嚴(yán)重，黃曲霉毒素在配合飼料中的檢出率很高，不僅導(dǎo)致飼料原料蛋白、維生素成分發(fā)生改變，破壞飼料原料的適口性，還會導(dǎo)致畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)損失，最終隨食物鏈進(jìn)入人體，嚴(yán)重危害人類健康[3]。目前，黃曲霉毒素的脫毒方法主要有化學(xué)脫毒法、物理脫毒法、硅酸鹽吸附法、甘露聚糖吸附法、活性炭吸附法等[4-8]，生產(chǎn)中應(yīng)用較為廣泛的脫毒方法是通過添加吸附劑的方法對被污染的糧食和飼料作物進(jìn)行脫毒處理，主要利用吸附劑與霉菌毒素的螯合吸附作用[9-10]，但這種簡單的吸附在吸附霉菌毒素的同時吸附劑還會吸附飼料中的某些微量成分影響其利用率[11]。因此采取更為有效和安全的方法對霉菌毒素進(jìn)行脫毒處理便成為解決問題的關(guān)鍵。采用微生物降解霉菌毒素，由于其有效率高、無殘留、成本低廉和操作簡便等優(yōu)點引起了研究人員的廣泛關(guān)注，尤其是利用微生物或者其產(chǎn)生的酶將霉菌毒素降解為無毒產(chǎn)物更成為目前研究的熱點。用生物學(xué)方法降解飼料中黃曲霉毒素的應(yīng)用非常少，因此分離得到具有較高黃曲霉毒素降解效率的菌株是我們未來的研究發(fā)展方向。

本研究旨在篩選高效降解AFB1的枯草芽孢桿菌菌株，優(yōu)化目標(biāo)菌株的生長條件，對發(fā)酵培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分、發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行單因素優(yōu)化，最顯著因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗，確定最優(yōu)發(fā)酵條件，使菌株達(dá)到最佳降解能力。因此，篩選產(chǎn)AFB1 生物降解酶枯草芽孢桿菌菌株，并對其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，對開發(fā)高效、廣譜、保營養(yǎng)的霉菌毒素脫毒劑來提高畜禽飼料質(zhì)量安全、保護(hù)人畜健康具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

酵母提取粉、蛋白陳、酵母浸膏、瓊脂粉(BR，安琪酵母股份有限公司)、牛肉膏(BR，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)、葡萄糖（AR，天津永最精細(xì)化工有限公司）、蔗糖、硫酸錳、氯化鈉(AR，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)、磷酸氫二鈉(AR，北京精求化工有限責(zé)任公司)、磷酸二氫鉀(AR，北京紅星化工廠)、乙酸鈉(AR，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑)、檸檬酸(BR，天津南開允公合成技術(shù)有限公司)、吐溫-80、硫酸鎂(AR，天津博迪化工股份有限公司)、碳酸鈣(AR，天津市科盟化工工貿(mào)有限公司)、香豆素（北京慶盛達(dá)化工技術(shù)有限公司）、AFB1（上海佑隆生物科技有限公司）、甲醇（AR，南京德澤化工有限公司）。

1.2 主要儀器

分析天平(QANN10-2008)、超聲波清洗器(KQSOODE)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9243 85-III)、立式壓力蒸汽滅菌鍋(YXQ-LS-SOA)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4)、渦旋振蕩器(VELPRS CIENTFICA)、蘇潔凈化超凈工作臺(CJ-2D)、恒溫培養(yǎng)箱(SPX-250BF-2)、水浴恒溫振蕩器(SHA-B)、酸度計(PHS-3C)、賽智2200液相色譜儀、50L 發(fā)酵罐（上海廣世生物工程設(shè)備有限公司）、酶標(biāo)儀（RT6000）、超聲波細(xì)胞破碎儀（JY96-IIN）、電熱恒濕水槽（SG-4055，上海碩光電子科技有限公司）、紫外可見分光光度計（5500pc）、定量中速濾紙。

1.3 樣品采集和培養(yǎng)基

樣品主要來源于浙江中科院應(yīng)用技術(shù)研究院土壤樣品、浙江大學(xué)飼料所土壤樣品，動物糞便，發(fā)酵食品，腐爛朽木，霉菌侵染小麥、玉米、麩皮等。種子培養(yǎng)基（1 L）為營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基添加20 g瓊脂粉。

1.3.1 香豆素初篩培養(yǎng)基[2，12]

0.25 g KH2PO4、0.25 g MgSO4、0.5 g KNO3、0.5 g(NH4)2SO4、0.005 g CaCl2、0.003 g FeCl3、20 g 瓊脂、pH值6.8、121 ℃滅菌30 min，滅菌結(jié)束加入除菌的香豆素，終溶液濃度為1 g/l。

1.3.2 復(fù)篩培養(yǎng)基

3 g 牛肉膏、5 g 蛋白胨、8 g 酵母浸粉、10 g 葡萄糖、12 g NaCl、pH值6.8、121 ℃滅菌30 min。

1.3.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

5 g 蛋 白 胨、葡 萄 糖20 g、12 g NaCl、0.25 g KH2PO4、0.25 g MgSO4、0.5 g (NH4)2SO4、0.5 g CaCl2、0.3 g FeCl3、pH值6.8、121 ℃滅菌30 min。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基

75 g 酵母膏、250 g 豆粕、80 g 麩皮、50 g 酵母浸粉、10 g葡萄糖、15 g NaCl、0.5 g MgSO4、0.5 g KH2PO4、pH值6.8、通氣2.5 m3/h、轉(zhuǎn)速150 r/min。

1.4 菌株初步分離

分別稱取樣品10 g，粉碎后稱取1 g，加入裝有100 ml無菌水三角瓶中，置于恒溫?fù)u床，150 r/min，處理30 min，吸取上清液1 ml，梯度稀釋10-3、10-4、10-5、10-6，分別吸取1 ml 各樣品溶液，接種到種子培養(yǎng)基，37 ℃，150 r/min 恒溫震蕩培養(yǎng)32 h，然后在無菌條件下吸取5 ml 發(fā)酵液接種到香豆素初篩培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3 d，變渾濁的培養(yǎng)基，無菌條件下，在新的香豆素初篩培養(yǎng)基上劃線，37 ℃培養(yǎng)，并分別編號保存。

1.5 菌株復(fù)篩

無菌條件下取1 環(huán)初篩菌株分別接種復(fù)篩培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)，待發(fā)酵液渾濁后，無菌條件下，以5%接種量接于100 ml 發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min、培養(yǎng)42 h，取1 ml 菌體發(fā)酵液與50 μl AFB1 標(biāo)準(zhǔn)品，置于滅菌的1.5 ml 離心管中，使其毒素終濃度為50 μg/ml，以無菌的發(fā)酵培養(yǎng)基加AFB1 作為空白對照，25 ℃、150 r/min 于暗處振蕩培養(yǎng)24 h，反應(yīng)結(jié)束后，離心去除菌體，取其上清液利用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長吸光值。

1.6 黃曲霉毒素B1（AFB1）提取及含量測定

1.6.1 樣品處理方法

采用移液槍準(zhǔn)確吸取樣品10 ml，于100 ml 具塞三角瓶中，加入20 μg/kg 黃曲霉毒素B1 20 μl，25 ℃恒溫振蕩2 h，準(zhǔn)確加入50.0 ml 甲醇水（7∶3）溶液，充分振蕩提取15 min，靜置分層，過濾收集樣品濾液用于AFB1的檢測。

1.6.2 樣品檢測

①加入50 μl 標(biāo)品與提取的樣品溶液，50 μl 酶標(biāo)記物工作液，25 ℃反應(yīng)10 min；

②洗板，加入100 μl 顯色劑，25 ℃避光反應(yīng)10 min；

③加入100 μl終止液，酶標(biāo)儀450 nm讀數(shù)。黃曲霉毒素B1含量計算：

X（μg/kg）=C×V×M×D

式中：X——黃曲霉毒素B1含量（μg/kg）；

C——待測樣液中黃曲霉毒素B1含量（μg/kg）；

V——樣品提取液體積（ml）；

M——樣品質(zhì)量（g）；

D——樣品稀釋倍數(shù)。

1.7 黃曲霉毒素B1（AFB1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定[13-15]

利用ELISA法對AFB1繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，AFB1濃度分別為0、1.0、2.5、5、10、20 μg/kg，利用RIDAWIN 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1）。

圖1 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.8 菌體濃度OD600吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線

取穩(wěn)定期菌液，測定發(fā)酵液活菌數(shù)，同時按不同的設(shè)定稀釋倍數(shù)(5、10、20、30、40倍），依次進(jìn)行稀釋，以空白發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行0 位測試，測定OD600吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.9 不同碳源對目標(biāo)菌株QR-015 降解黃曲霉毒素B1（AFB1）發(fā)酵的影響

試驗選用碳源為葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉、麥芽糖、乳糖、糖蜜分別為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，加入20 g，代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，以5%接種量接種到100 ml培養(yǎng)基中，pH值6.5，150 r/min，33 ℃發(fā)酵培養(yǎng)，以目標(biāo)菌株菌體OD600吸光值和AFB1降解率為檢測值。

1.10 不同氮源對目標(biāo)菌株QR-015 降解AFB1 發(fā)酵的影響

試驗所用氮源為牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、豆粕、尿素、硝酸銨、硝酸鈉，按照1%的添加量分別代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨，以5%接種量接種到100 ml培養(yǎng)基中，pH 值6.5，150 r/min，33 ℃發(fā)酵培養(yǎng)，以目標(biāo)菌株菌體OD600吸光值和AFB1降解率為檢測值。

1.11 不同發(fā)酵培養(yǎng)條件對目標(biāo)菌株QR-015 降解AFB1發(fā)酵的影響

1.11.1 發(fā)酵溫度對目標(biāo)菌株QR-015 降解AFB1 發(fā)酵的影響

50 L 發(fā)酵罐中裝入30 L 發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH 值6.5，火焰條件下，接入5%的種子液，分別在25、28、31、34、37、40 ℃下，150 r/min，通氣量2.5 m3/h，培養(yǎng)36 h，測定菌液OD600吸光值，AFB1降解率為檢測值。

1.11.2 通氣量對目標(biāo)菌株QR-015 降解AFB1 發(fā)酵的影響

50 L 發(fā)酵罐中裝入30 L 發(fā)酵培養(yǎng)基，pH 值6.5，火焰條件下，接入5%的種子液，發(fā)酵溫度34 ℃，通氣量分別為1、1.5、2、2.5、3 m3/h，轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)36 h，測定菌液OD600吸光值，AFB1降解率為檢測值。

1.11.3 接種量對目標(biāo)菌株QR-015 降解AFB1 發(fā)酵的影響

50 L 發(fā)酵罐中裝入30 L 發(fā)酵培養(yǎng)基，pH 值6.5，火焰條件下，接種量分別按照3%、4%、5%、6%、7%、8%接種，發(fā)酵溫度34 ℃，通氣量2.5 m3/h，轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)36 h，測定菌液OD600吸光值和AFB1降解率為檢測值。

1.12 菌株QR-015生長曲線的測定

選取AFB1 降解效果顯著的QR-015 進(jìn)行發(fā)酵試驗，將QR-015接種到經(jīng)篩選的培養(yǎng)基中，按照優(yōu)化的發(fā)酵條件進(jìn)行培養(yǎng)，測定其發(fā)酵生產(chǎn)曲線，在火焰條件下，以5%接種量接種到含有30 L 發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，33 ℃、150 r/min、pH 值6.5，通氣2.5 m3/h 培養(yǎng)，按照編號每隔2 h測定菌體OD600吸光值和發(fā)酵液pH值變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 可降解黃曲霉毒素B1（AFB1）目標(biāo)菌株初篩

通過以香豆素為唯一碳源的培養(yǎng)基初篩，從浙江中科院應(yīng)用技術(shù)研究院土壤樣品、浙江大學(xué)飼料所土壤樣品，動物糞便，發(fā)酵食品，腐爛朽木，霉菌浸染小麥、玉米、麩皮這些樣品中分離獲得20 株菌株，并分別編號為QR-001 至QR-020，其生長情況及AFB1 降解情況見表1。

表1 可降解黃曲霉毒素B1目標(biāo)菌株初篩情況

2.2 可降解黃曲霉毒素B1（AFB1）目標(biāo)菌株復(fù)篩

通過初篩獲得QR-001、QR-012、QR-015、QR-016、QR-019五株可降解AFB1的菌株，所以選擇這四株菌進(jìn)行復(fù)篩試驗，研究結(jié)果表明QR-015 AFB1 降解率可以達(dá)到85.96%，具體試驗結(jié)果見表2，在后面的試驗研究中選擇AFB1 降解率最優(yōu)的菌株QR-015進(jìn)行發(fā)酵碳源、氮源、培養(yǎng)條件的優(yōu)化。

表2 降解黃曲霉毒素B1菌株的復(fù)篩結(jié)果

2.3 菌體濃度OD600吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線

取穩(wěn)定期菌液，測定發(fā)酵液活菌數(shù)，設(shè)定稀釋倍數(shù)5、10、20、30、40 倍5 個梯度進(jìn)行稀釋，以空白發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行0 位測試，以O(shè)D600吸光值為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的菌體濃度107cfu/ml 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，QR-015菌體標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，相關(guān)系數(shù)0.999 3。

圖2 QR-015菌體OD600標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 不同碳源對目標(biāo)菌株QR-015 降解黃曲霉毒素B1（AFB1）發(fā)酵的影響（見圖3）

圖3 不同碳源對目標(biāo)菌株QR-015降解黃曲霉毒素B1發(fā)酵的影響

從圖3 可以看出，QR-015 在以糖蜜為碳源時其菌體濃度以及AFB1降解率明顯高于其他碳源，其菌體濃度為1.59×109cfu/ml，AFB1降解率最高，達(dá)到91%，依次為蔗糖、淀粉、麥芽糖、葡萄糖、果糖、乳糖。最終確定糖蜜為QR-015發(fā)酵降解AFB1的最適碳源。

2.5 不同氮源對目標(biāo)菌株QR-015 降解黃曲霉毒素B1（AFB1）發(fā)酵的影響（見圖4）

試驗選取牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、豆粕、尿素、硝酸銨、硝酸鈉進(jìn)行試驗，從圖4 可以看出，QR-015在以豆粕為氮源時其菌體濃度以及AFB1降解率明顯高于其他碳源，其菌體濃度為1.53×109cfu/ml，AFB1降解率達(dá)到93%，依次為酵母浸粉、蛋白胨、牛肉膏、尿素、硝酸銨、硝酸鈉，最終確定豆粕為QR-015 發(fā)酵降解AFB1最適氮源。

2.6 發(fā)酵溫度對目標(biāo)菌株QR-015 降解黃曲霉毒素B1（AFB1）發(fā)酵的影響（見圖5）

圖4 不同氮源對目標(biāo)菌株QR-015降解黃曲霉毒素B1發(fā)酵的影響

圖5 不同發(fā)酵溫度對目標(biāo)菌株QR-015降解黃曲霉毒素B1發(fā)酵的影響

由圖5 可知，發(fā)酵溫度在25～37 ℃時，目標(biāo)菌株QR-015菌體濃度和AFB1降解率和溫度正相關(guān)，發(fā)酵溫度在37 ℃時，菌體濃度和AFB1 降解率達(dá)到最大值，分別為1.69×109cfu/ml、94%，當(dāng)發(fā)酵溫度超過37 ℃時，菌體濃度和AFB1 降解率呈現(xiàn)下降趨勢，由于發(fā)酵溫度已超過其最適發(fā)酵溫度，使菌體增殖以及AFB1降解酶產(chǎn)生受阻。

2.7 通氣量對目標(biāo)菌株QR-015 降解黃曲霉毒素B1（AFB1）發(fā)酵的影響（見圖6）

由圖6 可知，通氣量在1～2.5 m3/h，菌體濃度和AFB1 降解率隨通氣量的增加而增長，但是增長趨勢逐漸變緩，2.5 m3/h 時，菌體濃度和AFB1 降解率達(dá)到最大值，分別為1.59×109cfu/ml、90%，這是由于隨著通氣量的增大發(fā)酵液中的溶氧逐漸達(dá)到飽和，溶氧已經(jīng)不是目標(biāo)菌株增殖的限制因子。

2.8 接種量對目標(biāo)菌株QR-015 降解黃曲霉毒素B1（AFB1）發(fā)酵的影響（見圖7）

由圖7可知，目標(biāo)菌株QR-015在接種量3%～4%時，菌體濃度和AFB1降解率呈現(xiàn)上升趨勢，接種量在4%時達(dá)到最大值，分別為1.62×109cfu/ml、84%，當(dāng)接種量超過4%時，菌體濃度和AFB1降解率呈現(xiàn)下降趨勢，接種量大，菌體發(fā)酵基數(shù)大，在發(fā)酵初期加速了營養(yǎng)物質(zhì)和溶氧的消耗，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，不足以提供菌株發(fā)酵所需的營養(yǎng)需求。

圖6 不同通氣量對目標(biāo)菌株QR-015降解黃曲霉毒素B1發(fā)酵的影響

圖7 不同接種量對目標(biāo)菌株QR-015降解黃曲霉毒素B1發(fā)酵的影響

2.9 響應(yīng)面優(yōu)化目標(biāo)菌株QR-015 降解黃曲霉毒素B1（AFB1）發(fā)酵工藝

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，運用Box-Behnken 設(shè)計原理，以發(fā)酵溫度（A）、通氣量（B）和接種量（C）設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗，并用-1、0、1代表編碼水平，試驗過程中發(fā)現(xiàn)菌體濃度同AFB1降解率在圖表中發(fā)展變化趨勢相近，確定以AFB1降解率（Y）為響應(yīng)值，各因素水平及試驗結(jié)果見表3、表4。

表3 響應(yīng)面設(shè)計的因素與水平

利用Design-Expert8.0 軟件對目標(biāo)菌株QR-015發(fā)酵工藝進(jìn)行最優(yōu)化，結(jié)果見表5。

表4 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

表5 回歸模型方差分析

數(shù)學(xué)模型經(jīng)二次回歸擬合，得回歸方程預(yù)測模型：

Y=93.6-2.87A-1.5B-0.38C-2.25AB+6AC-3.25BC-13.05A2-4.3B2-1.55C2

擬合方程的二次項系數(shù)為負(fù)值，拋物線開口朝下，這說明擬合得到的方程有極大值點。

擬合方程方差分析見表5，模型的決定系數(shù)R2值為98.19%，說明回歸方程可以很好地反映發(fā)酵條件對目標(biāo)菌株QR-015 發(fā)酵產(chǎn)酶降解AFB1 的影響，可以用回歸方程來代替真實試驗點來對液體發(fā)酵進(jìn)行分析和預(yù)測。校正系數(shù)R2Adj值為97.98%，說明模型只有2.02%的概率不能解釋響應(yīng)面值的變化。失擬項P值0.123 1 不顯著，說明所得方程與實際擬合中的非正常誤差所占的比例小，另外模型各項A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2中除B、B2、C2不顯著外，其余項都顯著。說明擬合方程對液體發(fā)酵提供了一個很好分析預(yù)測模型。

利用Design-Expert 8.0 軟件對二次回歸模型進(jìn)行分析，得到發(fā)酵溫度、通氣量、接種量3個因素之間的立體分析圖。圖8～圖10 分別代表發(fā)酵溫度、通氣量、接種量3個因素之間的響應(yīng)面圖。結(jié)合圖8～圖10及Design-Expert 8.0 軟件綜合分析得到目標(biāo)菌株QR-015 液體發(fā)酵降解AFB1 最大值點：發(fā)酵溫度36.5 ℃、通氣量2.16 m3/h、接種量3.58%，此時降解率達(dá)到最大98%（預(yù)測值）。

為了驗證所建立模型預(yù)測值與實際值之間的擬合度，對發(fā)酵溫度36.5 ℃、通氣量2.16 m3/h、接種量3.58%進(jìn)行3組平行發(fā)酵試驗驗證，實測AFB1降解率均值97.5%，與預(yù)測結(jié)果相近，說明預(yù)測值與實際值有著良好的擬合性，優(yōu)化方案符合實際。

3 討論

全價配合飼料、飼料加工原料、田間糧食等普遍存在多種霉菌毒素，多種霉菌毒素的復(fù)合協(xié)同作用給我們?nèi)粘５纳a(chǎn)活動帶來一系列的影響。為了降低霉菌毒素帶來的經(jīng)濟(jì)損失，減少并消除霉菌毒素在動物體內(nèi)的蓄積，本項目建立可降解霉菌毒素的枯草芽孢桿菌篩選方法，通過試驗篩選出5株可降解黃曲霉毒素B1（AFB1）的枯草芽孢桿菌菌株。

隨著科研人員對降解AFB1菌株的廣泛而深入的研究，越來越多的高效降解AFB1菌株被發(fā)現(xiàn)，如枯草芽孢桿菌、乳酸菌、地衣芽孢桿菌、黑曲霉菌等。Peltonen等[16]研究乳酸菌對AFB1的降解作用，結(jié)果表明，二株噬淀粉乳桿菌和1株鼠李糖乳桿菌對AFB1的有效降解率均在一半以上。Moyne[17]從自然界分離篩選出一株對AFB1 降解效果明顯的枯草芽孢桿菌，并將其命名為AU195，通過不斷地試驗分離從該菌發(fā)酵液中獲得一種新的活性物質(zhì)bacillomycin D。朱新貴等[18]研究多種益生菌對AFB1 的去除效果，結(jié)果證實在這些益生菌中以枯草芽孢桿菌去除AFB1的作用最強。孫玲玉等[19]從泰山土壤中分離出高效降解AFB1的泰山枯草芽孢桿菌。動物消化道內(nèi)的微生物具有降低毒素的吸收、降解毒素的能力，因此選取腸道、糞便篩選AFB1降解菌株。雷元培等[20]從動物腸道分離株中篩選出的枯草芽孢桿菌可高效降解黃曲霉毒素B1、G1和M1。

圖8 發(fā)酵溫度和通氣量對QR-015發(fā)酵降解黃曲霉毒素B1響應(yīng)面圖

圖9 接種量和發(fā)酵溫度對QR-015發(fā)酵降解黃曲霉毒素B1響應(yīng)面圖

圖10 接種量和通氣量對QR-015發(fā)酵降解黃曲霉毒素B1響應(yīng)面圖

本研究通過從土壤樣品、動物糞便、發(fā)酵食品、腐爛朽木、霉菌侵染小麥、玉米、麩皮等中純化的枯草芽孢桿菌菌種QR-001 至QR-020，進(jìn)行培養(yǎng)和分離，目的是找到能高效、安全降解AFB1 的菌株。自然界里存在各種各樣的細(xì)菌，有其存在的天然優(yōu)勢，是篩選優(yōu)良菌株的天然來源。

香豆素作為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基，利用其AFB1 的結(jié)構(gòu)相似性，用毒性較小的香豆素替代劇毒的AFB1，作為初篩降解菌的底物，是安全可行的選擇[21]。徐海軍等[22]利用該種方法篩選得到一株對AFB1 降解率達(dá)95.6%的高效菌株。本研究經(jīng)過初篩獲得QR-001、QR-012、QR-015、QR-016、QR-019 五株菌株，在只有香豆素作為碳源的培養(yǎng)基中生長良好，繼續(xù)接種到復(fù)篩培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)QR-015菌株對AFB1 的降解率可以達(dá)到85.96%。試驗選用的ELISA 方法檢測AFB1 的含量，對于樣品的前處理操作簡便，安全性高，可控性強。

在對培養(yǎng)基進(jìn)行篩選時，優(yōu)選糖蜜及豆粕為QR-015 發(fā)酵最適碳氮源，AFB1 降解率可分別達(dá)到91%、93%，較王威等[23]研究采用玉米芯粉和胰蛋白胨為碳氮源時AFB1 降解率79.64%、80.65%有所提高，較關(guān)心等[24]研究的利用香豆素篩選出的降解AFB1 的菌株，降解率83%有所提高。

本項目研究從試驗方案建立、目標(biāo)菌株QR-015培養(yǎng)基組分篩選、培養(yǎng)條件優(yōu)化等方面展開研究，最終優(yōu)化得到QR-015 最佳降解AFB1 發(fā)酵工藝，此時降解率可達(dá)到97.5%，較目前研究報道AFB1 生物降解率有了一個較大的提升，同時本研究篩選得到的QR-015 目前已經(jīng)開展了相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)試驗，本項目研究也為其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

①對篩選得到QR-015 可降解AFB1 菌株，通過對QR-015 碳源及氮源試驗，確定糖蜜為其發(fā)酵最適碳源，菌體濃度為1.59×109cfu/ml，AFB1 降解率達(dá)到91%，確定豆粕為其發(fā)酵最適氮源，菌體濃度為1.53×109cfu/ml，AFB1降解率達(dá)到93%。

②在對QR-015發(fā)酵條件優(yōu)化時，在單因素試驗基礎(chǔ)上對QR-015 發(fā)酵條件進(jìn)行中心復(fù)合試驗設(shè)計，確定了QR-015 發(fā)酵最適發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度36.5 ℃、通氣量2.16 m3/h、接種量3.58%，AFB1降解率達(dá)到97.5%，比優(yōu)化前有所提高。