飼料添加海水螺旋藻對凡納濱對蝦生長、營養(yǎng)和相關免疫因子的影響

楊冰潔 李 濤 吳華蓮 向文洲 段元慧 吳后波*

（1.中國科學院南海海洋研究所 中國科學院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室，廣東廣州510301；2.中國科學院大學，北京100049；3.南方海洋科學與工程廣東省實驗室，廣東廣州510301；4.廣東海大集團股份有限公司 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部微生態(tài)資源養(yǎng)殖利用重點實驗室，廣東廣州511400）

螺旋藻營養(yǎng)豐富且均衡、蛋白質(zhì)含量高（超過干重的50%）、且富含水產(chǎn)動物生長所需的維生素、礦物質(zhì)、多不飽和脂肪酸和必需氨基酸等[1-3]，可作為一種良好的飼料添加劑應用于畜禽養(yǎng)殖和水產(chǎn)養(yǎng)殖中，但目前有關螺旋藻在飼料中的研究大部分都集中在淡水螺旋藻。與淡水螺旋藻相比，海水培養(yǎng)螺旋藻中的有效成分含量顯著提高，如藻藍蛋白、肌醇、可溶性多糖和各種微量元素等[4]，并且利用天然海水養(yǎng)殖螺旋藻能有效避免螺旋藻中重金屬離子富集與超標，同時可以大幅度降低培養(yǎng)成本。而有關海水螺旋藻作為飼料添加劑的研究并不多見，其研究范圍也僅包括有限的幾個種類，如在畜禽養(yǎng)殖中，飼料中添加海水螺旋藻可改善豬的生長性能和肌肉品質(zhì)，并對仔豬的腹瀉有一定的治療作用[5]；不同添加量的海水螺旋藻對烏鬃鵝的生長指標和全凈膛率均有顯著性影響，并能提高肌肉蛋白質(zhì)品質(zhì)[6]，還能降低烏鬃鵝的肝臟毒性和總膽固醇含量，并在一定程度上提高免疫器官指數(shù)和血清總蛋白含量[7]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，適量的海水螺旋藻能明顯促進彭澤鯽和改良鯽的生長并提高其肌肉營養(yǎng)品質(zhì)[8-9]，能改善長臀鮠抗氧化和脂代謝水平[10]。因此，作為一種潛在的優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)與畜禽動物飼料添加劑，海水螺旋藻具有良好的應用前景，擴大其研究范圍，將有助于水產(chǎn)和畜禽動物養(yǎng)殖與海水螺旋藻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

凡納濱對蝦（Penaeus vannamei）（俗稱南美白對蝦）肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，是亞洲最受歡迎的對蝦養(yǎng)殖品種之一，也是我國目前蝦類的主要養(yǎng)殖品種[11]。但近些年隨著集約化養(yǎng)殖量的不斷增加，在養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)了各種問題，如種質(zhì)退化、病害等，給生產(chǎn)帶來了巨大損失[12]，而養(yǎng)殖病害的控制導致抗生素的大量使用，發(fā)展無抗養(yǎng)殖是今后飼料添加劑發(fā)展的重點方向。因此，通過飼料添加來提高凡納濱對蝦的非特異性免疫能力，提高其抗病性，已成為科研工作者的研究重點，已有大量關于凡納濱對蝦飼料添加劑的報道，如微生態(tài)制劑、中草藥等，均能明顯增強凡納濱對蝦的抗氧化和免疫防御能力[13-14]，但有關微藻如海水螺旋藻等作為飼料添加劑對凡納濱對蝦的免疫影響的作用卻鮮有報道。

作為一種優(yōu)質(zhì)的畜禽和水產(chǎn)動物飼料添加劑，海水螺旋藻可以促進動物的生長、提高肌肉品質(zhì)，并能增強動物的機體免疫力，但是目前海水螺旋藻作為飼料添加劑的應用還停留在比較初步的階段，需更多的研究進一步探索。本研究以凡納濱對蝦為研究對象，旨在探究海水螺旋藻對凡納濱對蝦生長、營養(yǎng)成分和主要非特異性免疫能力的影響，為海水螺旋藻作為動物飼料添加劑的開發(fā)和應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 海水螺旋藻藻粉及飼料制作

1.1.1 藻種

本試驗中所用海水螺旋藻藻種為鈍頂螺旋藻SCSIO-45824 藻株，由中國科學院南海海洋研究所經(jīng)濟微藻種質(zhì)庫提供。

1.1.2 培養(yǎng)方法

SCSIO-45824 海水螺旋藻的培養(yǎng)采用修改后的南海-II號培養(yǎng)基[15]，培養(yǎng)基采用100%天然海水配置，在300 m2的跑道池進行，所用海水從試驗基地附近海域抽取，通過覆蓋顆?；钚蕴康纳盀V池過濾。跑道池培養(yǎng)中的葉輪攪拌轉速為13 r/min，藻液流速為0.3 m/s；培養(yǎng)物深度保持在20 cm左右。

1.1.3 戶外螺旋藻的采收與藻粉制作

當螺旋藻培養(yǎng)至光密度（OD700）為1.2～1.5時進行采收，采收時利用300目尼龍篩絹過濾，過濾物利用清水沖洗至少3遍去除各種無機鹽成分，將采收后的藻泥鋪開，曬干后將其碾碎為粉末狀，室溫密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 飼料制作

飼料配方及營養(yǎng)水平見表1，對蝦基礎飼料由豆粕、魚粉、面粉、蝦粉、魚油、花生麩、磷脂油等組成。將上述制作的海水螺旋藻粉按重量百分比0%（對照）、0.7%、2.1%、3.5%和5.0%添加于對蝦基礎飼料中，混勻后，制成粒徑為1.5 mm 的顆粒。自然晾干，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 凡納濱對蝦飼料配方及營養(yǎng)水平(%)

1.2 養(yǎng)殖管理

試驗蝦苗由廣東海大集團提供，平均體重約為1.10 g，選擇體質(zhì)健壯、規(guī)格整齊的1 260尾試驗蝦，隨機分組進行養(yǎng)殖試驗。試驗共設7組（不同海水螺旋藻比例），每組3個重復，每個重復60尾蝦。試驗在室內(nèi)反復循環(huán)流水式玻璃水族箱養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行。水族箱體積300 L，溶氧濃度控制在6 mg/l，溫度為25～28 ℃。試驗開始前，對蝦苗先在水族箱中以基礎飼料培養(yǎng)適應14 d，每天投喂2次（上午9:00和下午15:00），養(yǎng)殖周期為56 d。

1.3 樣本收集與測定

1.3.1 樣本收集

試驗結束時一次性收集每個水族箱的對蝦，稱重并記錄試驗數(shù)據(jù)。每組取20 尾對蝦解剖得到肝胰腺，稱重后迅速放入-20 ℃冷凍保存，用于堿性磷酸酶（APK）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）等指標的測定，另外每組取15尾蝦肌肉用于營養(yǎng)成分的分析。

1.3.2 測定方法

采用GB 5009.3—2010烘干法測定肌肉樣品的水分，采用GB 6432—86微量凱氏定氮法測定肌肉樣品的粗蛋白質(zhì)，粗脂肪含量采用索氏抽提法，二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）含量利用氣相色譜儀測定[16]。凡納濱對蝦肝胰腺中蛋白質(zhì)含量、堿性磷酸酶（APK）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LYZ）和酚氧化酶（PO）的活力測定，均采用南京建成生物技術有限公司的試劑盒進行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

本試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用Graphpad Prism 5.0 軟件，用One-way ANOVA 分析，選用Duncan's 法進行多重比較，進行單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)用“平均值±標準誤差”表示，P＜0.05表示差異性顯著。

2 結果

2.1 海水螺旋藻對凡納濱對蝦生長性能的影響

凡納濱對蝦的生長性能如表2 所示。與對照組相比，5.0%組可以提高對蝦的重量，與對照組相比終重提高12.07%（P＜0.05），然而其余各組凡納濱對蝦的終重和增重無明顯提升效果，各組對飼料系數(shù)并沒有顯著性影響（P＞0.05）。

表2 海水螺旋藻對凡納濱對蝦生長性能的影響

2.2 海水螺旋藻對凡納濱對蝦肌肉營養(yǎng)成分的影響

凡納濱對蝦肌肉的營養(yǎng)成分見表3。與對照組相比，飼料中添加海水螺旋藻對凡納濱對蝦肌肉中的水分含量無明顯影響（P＞0.05）；能夠顯著提高肌肉中粗蛋白的含量，分別提高了10.11%（P＜0.05）、7.40%（P＜0.05）、8.59%（P＜0.05）和10.90%（P＜0.05）；隨著海水螺旋藻添加量比例的增加，肌肉中粗脂肪含量呈下降趨勢，但差異不顯著(P＞0.05)；各試驗組中DHA含量均有所提高，其中，提高最明顯的為5.0%比例添加組，提高了71.43%(P＜0.05)；試驗組EPA含量也均有所提高，其中5.0%比例添加組提高最明顯，提高了60.0%(P＜0.05)。

表3 海水螺旋藻對凡納濱對蝦肌肉營養(yǎng)成分的影響(%)

2.3 海水螺旋藻對凡納濱對蝦免疫因子的影響

2.3.1 海水螺旋藻對凡納濱對蝦堿性磷酸酶（AKP）活力的影響

海水螺旋藻對凡納濱對蝦肝胰臟堿性磷酸酶（AKP）的影響如圖1。與對照組相比，0.7%、2.1%、3.5%和5.0%各組中AKP活力隨海水螺旋藻比例的增加而增加，其中5.0%組中AKP 活力顯著提高，提高31.98%（P＜0.05）。

圖1 不同水平的海水螺旋藻對凡納濱對蝦AKP活力的影響

2.3.2 海水螺旋藻對凡納濱對蝦溶菌酶(LYZ)活力的影響

海水螺旋藻對凡納濱對蝦肝胰臟溶菌酶（LYZ）活力的影響如圖2 所示。與對照組相比，2.1%、3.5%和5.0%組中LYZ活力顯著提高，分別提高了147.47%（P＜0.05）、139.39%（P＜0.05）和137.37%（P＜0.05）。各組中LYZ活力隨海水螺旋藻添加量的增加而增加，至添加量為2.1%時達到最大值2.45 U/mg prot.，之后活力隨海水螺旋藻添加量的增加而略有降低。

2.3.3 海水螺旋藻對凡納濱對蝦酚氧化酶（PO）活力的影響

海水螺旋藻對凡納濱對蝦肝胰臟酚氧化酶（PO）活力的影響如圖3 所示。與對照組相比，0.7%、2.1%和5.0%組中PO 活力顯著提高，分別提高了35.36%（P＜0.05）、21.79%（P＜0.05）和31.78%（P＜0.05）。

圖2 不同水平的海水螺旋藻對凡納濱對蝦LYZ活力的影響

圖3 不同水平的海水螺旋藻對凡納濱對蝦PO活力的影響

2.3.4 海水螺旋藻對凡納濱對蝦超氧化物歧化酶活力（SOD）的影響

海水螺旋藻對凡納濱對蝦肝胰臟超氧化物歧化酶（SOD）活力的影響如圖4 所示。與對照組相比，0.7%和3.5%組中SOD 活力顯著提高，分別提高了27.49%（P＜0.05）和28.57%（P＜0.05）。

2.3.5 海水螺旋藻對凡納濱對蝦谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力的影響

海水螺旋藻對凡納濱對蝦肝胰臟谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力的影響如圖5 所示。與對照組相比，0.7%組和3.5%組中GSH-Px 活力顯著提高，分別提高了10.81%（P＜0.05）和8.04%（P＜0.05），5.0%組中GSH-Px活力顯著降低，降低了10.46%（P＜0.05）。

圖4 不同水平的海水螺旋藻對凡納濱對蝦SOD活力的影響

圖5 不同水平的海水螺旋藻對凡納濱對蝦GSH-Px活力的影響

3 討論

3.1 飼料中添加海水螺旋藻對凡納濱對蝦生長性能的影響

本研究表明，飼料中海水螺旋藻添加量為0.7%～3.5%時對凡納濱對蝦的生長均有一定幅度的提高，但統(tǒng)計學上沒有顯著性差異（P＞0.05），高含量添加海水螺旋藻（0.5%）能顯著性促進凡納濱對蝦的生長（P＜0.05）。鄭獻昌等[17]證明飼料中淡水螺旋藻添加水平對南美白對蝦生長性能無明顯地改善，表明海水螺旋藻具有更高的應用前景。張華等[18]研究表明，飼料中添加適量螺旋藻能提高脊尾白蝦存活率、特定生長率和吸收效率，虞為等[19]試驗表明，飼料中添加螺旋藻可顯著提高花鱸特定生長率和增重率，并顯著降低飼料系數(shù)。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是不同的養(yǎng)殖品種具有不同的營養(yǎng)需求。

3.2 飼料中添加海水螺旋藻對凡納濱對蝦肌肉營養(yǎng)成分的影響

螺旋藻的蛋白質(zhì)水平與肉類和大豆相似，除此之外它含有大量的維生素、礦物質(zhì)、酚類、必需脂肪酸、氨基酸和色素，因此，對水生動物的營養(yǎng)價值極高[20]。在本試驗中，海水螺旋藻的添加對凡納濱對蝦肌肉中的水分含量沒有顯著影響，與對照組相比，各海水螺旋藻添加組中粗蛋白含量有顯著性提高，海水螺旋藻不同百分比添加量各組間沒有顯著性差異。不同海水螺旋藻添加水平投喂凡納濱對蝦，對凡納濱對蝦肌肉中粗脂肪含量沒有顯著性影響。與對照組相比，5.0%組DHA 和EPA 含量顯著性提高（P＜0.05），其他各試驗組DHA和EPA含量也有一定程度的提高。該試驗結果與劉立鶴等[21]的試驗結果大致相似，因此提高凡納濱對蝦蛋白含量僅需添加低比例的海水螺旋藻即可。操玉濤等[22]研究結果說明飼料中適量添加淡水螺旋藻可以顯著提高凡納濱對蝦EPA 和DHA 的含量，最適添加量為1.5%。本試驗中海水螺旋藻各添加組對DHA 和EPA 含量均有提高，添加量在5.0%時DHA 和EPA 的含量達到最高。螺旋藻并不能合成EPA和DHA，而飼料中添加螺旋藻使凡納濱對蝦肌肉中EPA 和DHA 含量提高，說明螺旋藻并不是EPA 和DHA 的直接來源，基礎飼料中的魚粉、魚油、磷脂油等是EPA 和DHA 的直接來源，可能是由于螺旋藻中某些活性因子有助凡納濱對蝦DHA 和EPA 的合成轉化或積累。

3.3 飼料中添加海水螺旋藻對凡納濱對蝦非特異性免疫的影響

凡納濱對蝦為低等的無脊椎甲殼動物，肝胰腺參與體內(nèi)代謝、解毒和排泄等生理過程[23]，是一個非常重要的器官[24]，蝦體內(nèi)沒有特異性免疫系統(tǒng)，主要依靠非特異性免疫抵抗病原體入侵，體內(nèi)抗微生物因子主要是包括各種水解酶，如酚氧化物酶、溶菌酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和超氧化物歧化酶等[25-26]。在本試驗中，飼料中添加海水螺旋藻后，除0.7%組外，其余各組中堿性磷酸酶活力均有不同程度的升高，并呈現(xiàn)上升趨勢；各試驗組中溶菌酶活力隨海水螺旋藻添加量的增加而增加，至添加量為2.1%時達到最大值，之后活力隨海水螺旋藻添加量的增加而略有降低，其中2.1%、3.5%組和5.0%組活力顯著提高（P＜0.05）；除5.0%組中谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著性降低（P＜0.05）之外，各組中酚氧化酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性均有一定程度的提高。幾種抗氧化酶的活力與螺旋藻添加劑量所呈現(xiàn)的規(guī)律性不強，特別是偶有出現(xiàn)海水螺旋藻高劑量添加下的活力降低，其主要原因可能是海水螺旋藻富含藻藍蛋白、SOD、谷胱甘肽、類胡蘿卜素等高活性抗氧化的活性物質(zhì)，可以清除一部分由于環(huán)境應激或病變所產(chǎn)生的氧化脅迫因子，對相關抗氧化酶形成了一定的功能補償機制，導致高添加劑量下不同幅度的下降。但總的來說，飼料中添加海水螺旋藻可以提高凡納濱對蝦包括抗氧化活力在內(nèi)的非特異性免疫。

綜上所述，海水螺旋藻添加對凡納濱對蝦非特異性免疫有提高，可以不同程度提高堿性磷酸酶、谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶和酚氧化酶活力，添加不同濃度的海水螺旋藻對凡納濱對蝦的生長、品質(zhì)均有不同程度的改善，綜合前述各方面的數(shù)據(jù)和分析，建議在凡納濱對蝦的養(yǎng)殖中添加海水螺旋藻2.1%～5.0%更為有益。本研究結果還表明，鑒于海水螺旋藻對凡納濱對蝦較為顯著的免疫增強和潛在的抗病害作用，有望作為無抗飼料候選添加劑，應用前景廣闊，有待進一步深入探討。

4 結論

綜上所述，飼料中添加2.1%～5.0%海水螺旋藻，可促進凡納濱對蝦的生長，提高凡納濱對蝦肌肉中蛋白質(zhì)、DHA和EPA含量，增強凡納濱對蝦的非特異性免疫能力，說明海水螺旋藻可作為凡納濱對蝦飼料添加劑應用于實際養(yǎng)殖中，具有良好的應用前景。