逍遙丸對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)小鼠抑郁樣行為的干預(yù)機(jī)制※

●王雙雙 易立濤▲ 董淑琦 李成付 陳學(xué)勤

抑郁癥是一種情緒障礙，伴隨著悲傷、絕望、情緒低落、失眠、興趣低下等，為目前全球三大疾病負(fù)擔(dān)之一[1]。目前臨床常用抗抑郁藥物（如三環(huán)類(lèi)）均為化學(xué)藥物，只能緩解部分癥狀，且作用位點(diǎn)單一，毒副作用較大，因此，研究開(kāi)發(fā)療效好、毒副作用少的抗抑郁藥物成為近些年來(lái)研究的熱點(diǎn)[2]。

逍遙丸出自宋代《太平惠民和劑局方》，方中的柴胡可以疏肝解郁，以順肝性；當(dāng)歸、白芍能養(yǎng)肝血，柔肝體，幫助柴胡恢復(fù)肝正常的順達(dá)之性；白術(shù)、茯苓可以益氣健脾，促進(jìn)氣血生化；甘草則配合茯苓、白術(shù)以益氣健脾，配白芍以緩急止痛；薄荷辛涼，助柴胡以疏肝氣、解郁熱；煨姜辛溫，助柴胡、薄荷疏肝，助茯苓、白術(shù)以健脾胃[3]。因其具有疏肝解郁、健脾養(yǎng)血的功效，常作為中醫(yī)調(diào)理情志病的經(jīng)典藥方。近年來(lái)研究顯示逍遙丸具有一定的抗抑郁作用[4]，本文則以皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的小鼠抑郁模型進(jìn)一步探討逍遙丸基于改善神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)系統(tǒng)的抗抑郁機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物鹽酸氟西?。ㄙ?gòu)自常州四藥制藥有限公司）；皮質(zhì)酮（購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；逍遙丸（購(gòu)自北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司）。

1.2 動(dòng)物雄性ICR 小鼠，清潔級(jí)，體重（22±2）g，8周齡，購(gòu)自上海斯萊克動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SCXK（滬）2012-002。小鼠10 只/籠，室溫（22±2）°C，光暗周期為12 h/12 h（光照時(shí)間07:00-19:00），自由獲得飼料與飲水，適應(yīng)環(huán)境一周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.3 試劑BDNF ELISA試劑盒（購(gòu)自上海生工生物有限公司）；小鼠皮質(zhì)酮ELISA試劑盒（購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司）。

1.4 儀器電子分析天平（購(gòu)自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；超聲波清洗器（購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司）；酶標(biāo)儀（購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（購(gòu)自德國(guó)KENDRD公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型的建立適應(yīng)環(huán)境7 天后，所有的小鼠隨機(jī)分為5組（每組10只）：正常組、皮質(zhì)酮組、逍遙丸組（低劑量及高劑量組的劑量分別為200mg/kg、600 mg/kg）、陽(yáng)性對(duì)照氟西汀組（劑量為20 mg/kg）。皮質(zhì)酮用0.1%的二甲亞砜和0.1 % 的吐溫-80 混合液溶解；逍遙丸和氟西汀混懸于生理鹽水中。除了正常組，其它組每天皮下注射皮質(zhì)酮（40 mg/kg），持續(xù)35天。逍遙丸和氟西汀于皮質(zhì)酮注射前30 min 灌胃給藥，劑量為10 ml/kg，實(shí)驗(yàn)持續(xù)35天。

2.2 糖水偏好實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)之前，先對(duì)小鼠進(jìn)行糖水適應(yīng)性訓(xùn)練：先給予小鼠兩瓶1%蔗糖水，24 h 后，將其中一瓶換為普通水，再進(jìn)行24 h。糖水適應(yīng)之后，將小鼠進(jìn)行水食剝奪24 h。糖水實(shí)驗(yàn)在上午9點(diǎn)半開(kāi)始，每只小鼠置于單獨(dú)的一個(gè)籠子中，分別給予一瓶1%蔗糖水，一瓶普通水（均已稱(chēng)初重）。經(jīng)過(guò)24 h，稱(chēng)量?jī)蓚€(gè)水瓶的末重，記錄每只小鼠消耗的糖水及普通水的量，計(jì)算糖水偏好百分比[公式：糖水偏好百分比=糖水消耗量/（糖水消耗量+普通水消耗量）]。

2.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)將小鼠置于溫度（25±2）°C、水深10 cm 的圓形玻璃容器（高20 cm，直徑18 cm）中強(qiáng)迫游泳6 分鐘。判定不動(dòng)的標(biāo)準(zhǔn)是小鼠在水中停止掙扎，呈漂浮狀態(tài)，僅有細(xì)小的肢體運(yùn)動(dòng)以保持頭部浮在水面。通過(guò)實(shí)驗(yàn)視頻，記錄小鼠在后4分鐘的總不動(dòng)時(shí)間。

2.4 血液和組織樣本的獲取強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)后，摘小鼠眼球快速收集血液，4℃下4000 rpm 離心10 min，收集血清，-80℃貯存。然后，斷頭處死小鼠，快速取出海馬，立即用液氮凍結(jié)。所有的組織樣本在-80℃下貯存至分析完成。

2.5 血清皮質(zhì)酮水平的測(cè)定根據(jù)皮質(zhì)酮ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清皮質(zhì)酮濃度。

2.6 海馬腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）水平測(cè)定根據(jù)BDNF ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定其濃度。

2.7 數(shù)據(jù)分析所有的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。統(tǒng)計(jì)差異用單因素方差分析結(jié)合事后檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 糖水偏好測(cè)定結(jié)果給藥5 周后，皮質(zhì)酮組小鼠的糖水偏好值顯著低于正常組（P＜0.01），提示皮質(zhì)酮引起小鼠的快感缺失。逍遙丸高、低劑量組及陽(yáng)性對(duì)照氟西汀組均能顯著增加小鼠的糖水偏好值，與皮質(zhì)酮組相比差異顯著（P＜0.05 或P＜0.01），但逍遙丸高、低劑量組與陽(yáng)性對(duì)照氟西汀組相比亦存在顯著差異（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 逍遙丸和皮質(zhì)醇對(duì)小鼠糖水偏好值的影響（n=10，-x±s）

3.2 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果相對(duì)于正常組，皮質(zhì)酮組的不動(dòng)時(shí)間顯著增加（P＜0.05）。與皮質(zhì)酮組相比，低、高劑量逍遙丸和氟西汀均能顯著減少小鼠的不動(dòng)時(shí)間（P＜0.05或P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 逍遙丸和皮質(zhì)酮對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間的影響（n=10，）

表2 逍遙丸和皮質(zhì)酮對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間的影響（n=10，）

注：與正常組比較，#P＜0.05；與皮質(zhì)酮組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

3.3 皮質(zhì)酮測(cè)定結(jié)果皮質(zhì)酮組小鼠血清中的皮質(zhì)酮濃度顯著增高，與正常組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。與皮質(zhì)酮組相比，低、高劑量逍遙丸組及陽(yáng)性對(duì)照氟西汀組均可顯著降低小鼠血清中的皮質(zhì)酮含量（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

3.4 BDNF 測(cè)定結(jié)果與正常組相比，皮質(zhì)酮組海馬BDNF 含量顯著降低（P＜0.01）。與皮質(zhì)酮組相比，低、高劑量逍遙丸組和陽(yáng)性對(duì)照氟西汀組均可增加小鼠海馬中BDNF的含量（P＜0.05或P＜0.01）。見(jiàn)表4。

表3 逍遙丸和皮質(zhì)酮對(duì)小鼠血清皮質(zhì)酮含量的影響（n=10，）

表3 逍遙丸和皮質(zhì)酮對(duì)小鼠血清皮質(zhì)酮含量的影響（n=10，）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與皮質(zhì)酮組比較，**P＜0.01

表4 逍遙丸和皮質(zhì)酮對(duì)小鼠海馬中BDNF含量的影響（n=10，）

表4 逍遙丸和皮質(zhì)酮對(duì)小鼠海馬中BDNF含量的影響（n=10，）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與皮質(zhì)酮組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用糖水偏好實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察皮質(zhì)酮對(duì)小鼠產(chǎn)生的快感缺失和絕望行為，以及逍遙丸是否具有改善的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在糖水偏好實(shí)驗(yàn)中，皮質(zhì)酮顯著降低了小鼠對(duì)糖水的偏好，陽(yáng)性對(duì)照氟西汀組的糖水偏好得到了顯著改善，服用逍遙丸也可以增加抑郁小鼠的糖水偏好值；在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，皮質(zhì)酮顯著增加了小鼠的不動(dòng)時(shí)間，而與皮質(zhì)酮組相比，逍遙丸組和氟西汀組的不動(dòng)時(shí)間均得到了顯著降低。這一點(diǎn)與之前報(bào)道的加味逍遙丸能夠縮短小鼠在強(qiáng)迫游泳中的不動(dòng)時(shí)間不謀而合[5]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，注射皮質(zhì)酮導(dǎo)致小鼠血清皮質(zhì)酮濃度顯著升高，而氟西汀和逍遙丸均可逆轉(zhuǎn)其濃度。長(zhǎng)期或者急性高度應(yīng)激會(huì)使體內(nèi)的糖皮質(zhì)激素達(dá)到一個(gè)極高的水平，導(dǎo)致海馬損傷[6]。而經(jīng)過(guò)氟西汀和逍遙丸治療，可以有效調(diào)節(jié)血清皮質(zhì)酮的含量穩(wěn)定，避免大腦海馬受到過(guò)多的損傷。

BDNF 作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素家族的主要成員，源于神經(jīng)元及其靶細(xì)胞并逆向影響神經(jīng)元。抑郁患者海馬BDNF 含量明顯低于正常人，傳統(tǒng)抗抑郁藥及電休克治療均可增加BDNF 含量，從而改善抑郁癥狀，提示BDNF可作為抗抑郁藥的治療靶點(diǎn)和檢測(cè)指標(biāo)[7-8]。本實(shí)驗(yàn)中，皮質(zhì)酮組的小鼠海馬BDNF 含量明顯低于正常組，說(shuō)明皮質(zhì)酮降低了小鼠海馬中的BDNF 含量。而氟西汀、逍遙丸均可增加小鼠海馬中的BDNF 含量，與皮質(zhì)酮組相比存在明顯差異，表明氟西汀和逍遙丸的抗抑郁作用與改善海馬神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)系統(tǒng)有關(guān)。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為疾病不是單獨(dú)發(fā)生于某個(gè)部位的病變，而是一個(gè)有機(jī)整體的病變。抑郁癥屬于中醫(yī)的情志疾病，從中醫(yī)學(xué)角度來(lái)講，抑郁癥不僅僅是某個(gè)部位的病變，它很大程度上與肝的功能相關(guān)[9]。逍遙丸中的柴胡可以疏肝解郁，在中醫(yī)學(xué)看來(lái)，逍遙丸是通過(guò)補(bǔ)肝體、助肝用、理氣養(yǎng)血、調(diào)和肝脾而起到改善抑郁的作用[10]。本研究結(jié)果表明逍遙丸確實(shí)能提高大腦海馬BDNF 的含量，至于其是否通過(guò)調(diào)理小鼠肝的功能，改善肝對(duì)皮質(zhì)酮水平的調(diào)節(jié)，從而影響了海馬中神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)水平，可作為下一步研究的方向。

綜上所述，長(zhǎng)期注射皮質(zhì)酮能夠降低正常小鼠的糖水偏好值以及增加強(qiáng)迫游泳的不動(dòng)時(shí)間，產(chǎn)生抑郁樣的行為，并可增加血清皮質(zhì)酮含量以及降低海馬BDNF 含量。相反，逍遙丸能夠逆轉(zhuǎn)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為，并且能夠降低血清皮質(zhì)酮的含量以及升高海馬BDNF的含量，產(chǎn)生抗抑郁樣的作用。