腸潤(rùn)方對(duì)功能性便秘大鼠結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞及c-kit/SCF信號(hào)通路的影響※

●肖秋平 洪燕秋 耿學(xué)斯▲ 文 磊

功能性便秘（function constipation，F(xiàn)C）是消化系統(tǒng)常見(jiàn)病、難治病，全球發(fā)病率逐漸上升。FC的發(fā)生與多種因素相關(guān)，但發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。研究顯示，伴有結(jié)腸動(dòng)力障礙的FC患者占相當(dāng)比例[1]。目前普遍認(rèn)為Cajal 間質(zhì)細(xì)胞（interstitial cells of Cajal，ICC）的異常是導(dǎo)致胃腸道動(dòng)力障礙性疾病的一個(gè)重要原因，ICC 特異性表達(dá)的酪氨酸蛋白激酶生長(zhǎng)因子受體（Tyrosine kinase growth factor receptor，c-kit）及其配體干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）結(jié)合所啟動(dòng)的信號(hào)通路對(duì)ICC 生長(zhǎng)發(fā)育及功能的維持至關(guān)重要。中醫(yī)認(rèn)為便秘的反復(fù)發(fā)生主要由于陰血不足，腸道失潤(rùn)，或氣虛氣滯，推動(dòng)無(wú)力，或兩者兼并?；凇斑\(yùn)脾滋陰”治法的腸潤(rùn)方在前期臨床研究中取得確切療效[2-3]。本研究旨在探討腸潤(rùn)方對(duì)FC 大鼠結(jié)腸ICC 及c-kit/SCF信號(hào)系統(tǒng)的影響，揭示滋陰行氣法治療FC、改善結(jié)腸動(dòng)力的可能作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物健康SD大鼠72只，雌雄各半，體重（220±20）g，由廈門(mén)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心采購(gòu)提供，許可證號(hào)：SYXK(閩)2013-0006。飼料、墊料來(lái)源同上，飼養(yǎng)室溫度20℃～25℃，濕度45%～55%。

1.2 藥物與試劑腸潤(rùn)方（炒白術(shù)20g，玄參15g，麥冬15g，火麻仁15g，枳實(shí)15g，檳榔15g），腸潤(rùn)方水煎劑：將95g 生藥飲片浸泡于蒸餾水中（蒸餾水略沒(méi)過(guò)飲片即可）1h后回流煮沸30min，濾出藥液，再加入蒸餾水（蒸餾水略沒(méi)過(guò)飲片即可），同法煮沸30min，過(guò)濾。將兩次得到的濾液混合，在3500rpm 離心濾液10min，藥液旋蒸濃縮至47.5mL，得到200%腸潤(rùn)方水煎液。實(shí)驗(yàn)前配制含生藥量分別為0.5g/ml、1g/ml 和2g/ml的腸潤(rùn)方水煎液。

麻仁丸：福州海王金象中藥制藥有限公司（批號(hào)：1805042）；復(fù)方地芬諾酯：新鄉(xiāng)市常樂(lè)制藥有限公司（批號(hào)：17040952）；PBS 磷酸緩沖液（索萊寶公司，批號(hào)：P1010）；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天公司，批號(hào)：P0010S）；PVDF 膜（邁博瑞公司，批號(hào)：R7EA3809G）；c-kit 抗體（Thermo Fisher 公司，批號(hào)：34-8800）；SCF 抗體（Abcama 公司，批號(hào)：ab64677）；IgG抗體（Abcama公司，批號(hào)：ab150077），RNA提取試劑盒（Promega 公司，批號(hào)：LS1040）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega 公司，批號(hào)：A5001）；RT-PCR 試劑（全式金公司，批號(hào)：AQ101-03）；免疫組化染色試劑盒（索萊寶公司，批號(hào)：SP0041）。

1.3 分組與造模72 只健康SD 大鼠正常喂養(yǎng)和觀察1周，隨機(jī)分為空白組、模型組、麻仁丸組以及腸潤(rùn)方高、中、低劑量組，共6 組，每組12 只。根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)造模方法造模[4]，空白組予蒸餾水2.2 ml/次，2次/天灌胃，模型組、麻仁丸組、腸潤(rùn)方組予復(fù)方地芬諾脂10mg/kg/d 灌胃，連續(xù)灌胃14 天。各組均于末次給藥30min 后以0.2mL/20g 的墨汁灌胃，記錄大鼠首粒黑便排出時(shí)間、6h 內(nèi)的排便粒數(shù)和大便性狀，通過(guò)SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，驗(yàn)證便秘模型成功制備。

1.4 藥物干預(yù)造模成功后，空白組、模型組均予蒸餾水1ml/100g/天，2 次/天灌胃；麻仁丸組予規(guī)格為0.6g/粒的麻仁丸按成人（60kg）日服計(jì)量2.4g 換算成SD大鼠劑量0.3g/kg/d，2次/d灌胃；腸潤(rùn)方高、中、低劑量組根據(jù)《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》計(jì)算出中藥人鼠等效劑量，按成人（60kg）日服劑量95g換算成SD大鼠服用劑量為低劑量組5.5g/kg/d，中劑量組11g/kg/d，高劑量組22g/kg/d，2次/d灌胃，各組連續(xù)灌胃14天后進(jìn)行取材。

1.5 標(biāo)本采集末次給藥結(jié)束后，禁食不禁水12h，頸椎脫臼處死動(dòng)物，打開(kāi)大鼠腹腔取2cm結(jié)腸腸管共2份，1份經(jīng)生理鹽水清洗后用OTC保鮮劑固定，液氮保存待western blot 及RT-PCR 測(cè)定，1 份固定于中性福爾馬林中，以待免疫組化測(cè)定。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)取放于4%多聚甲醛固定的組織，經(jīng)脫水、包埋制成連續(xù)切片。石蠟切片脫蠟后進(jìn)行抗原修復(fù)。用組化筆畫(huà)圈圍住組織，滴加3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源酶活性。加山羊血清封閉液封閉非特異性位點(diǎn)，室溫10min。甩掉封閉液，圈內(nèi)滴加一抗（1:1000稀釋的兔抗鼠c-kit或1:1000稀釋的兔抗鼠SCF）蓋住組織，放入濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜。二抗（1:3000稀釋的羊抗兔IgG）室溫孵育10min。鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液在室溫下孵育10min，DAB 顯色。蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，自來(lái)水沖洗反藍(lán)，1%鹽酸酒精分化3秒，自來(lái)水沖洗三分鐘，脫水，中性樹(shù)膠封片。用Definiens Tissue StudioTM 圖象分析系統(tǒng)，測(cè)定各組ckit、SCF 陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值(average optical den-sity，AOD)。

1.7 Western Blot 檢測(cè)取大鼠結(jié)腸組織樣品，加入蛋白裂解液混勻，冰上靜置10～15min，12000rpm離心10min，取上清液，重復(fù)離心，BCA 蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)得待測(cè)樣品的蛋白濃度。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，PVDF膜取出置于含5%奶粉的TBST中，室溫慢搖封閉1h，一抗（1:1000 稀釋的兔抗鼠c-kit 或1:1000稀釋的兔抗鼠SCF）放置低速搖床上4℃過(guò)夜。TBST漂洗3次，10min/次，室溫孵育辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗（1:3000 稀釋的羊抗兔IgG）低速孵育1h，TBST漂洗3次，10min/次。ECL工作液浸潤(rùn)PVDF膜，避光顯影，Tubulin作為內(nèi)參照。

1.8 RT-PCR 檢測(cè)取液氮凍存新鮮結(jié)腸組織，提取總RNA，測(cè)定RNA 濃度，RNA 電泳測(cè)定其完整性。經(jīng)promega 反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作，所得cDNA 進(jìn)行RTPCR 檢測(cè)。反應(yīng)體系共10μL。經(jīng)ABI Primer Express10 軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR 引物，由大連寶生物工程有限公司合成。各檢測(cè)指標(biāo)引物序列見(jiàn)表1。熱循環(huán)參數(shù)如下：95℃30s 為第一階段，1 個(gè)循環(huán)；95℃5s，60℃30s 為第二階段，45 個(gè)循環(huán)。以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參照。CFX96Manager軟件分析結(jié)果。

表1 c-kit、SCF、β-actin引物序列

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較若滿足正態(tài)性且方差齊時(shí)采用單因素方差分析LSD法和SNK法，若方差不齊，采用DunnettT3法進(jìn)行方差檢驗(yàn)和兩兩比較，若數(shù)據(jù)非正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 便秘模型建立情況實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，無(wú)大鼠死亡，表明復(fù)方地芬諾酯法制備FC 模型具有安全性、穩(wěn)定性。模型組、麻仁丸組及腸潤(rùn)方高中低各劑量組在大鼠首粒黑便排出時(shí)間、6h內(nèi)糞便排出顆粒數(shù)量以及糞便重量與空白組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），表明FC大鼠模型成功復(fù)制。見(jiàn)表2。

表2 6組大鼠排便情況比較（）

表2 6組大鼠排便情況比較（）

注：與空白組比較，*P＜0.05

2.2 免疫組化檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織中c-kit、SCF 的分布與表達(dá)c-kit、SCF均分布于結(jié)腸組織和間隙。從c-kit的表達(dá)情況分析，結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組和腸潤(rùn)方低劑量組的c-kit表達(dá)量均顯著降低（P＜0.01或P＜0.05），腸潤(rùn)方高劑量組和中劑量組與空白組比較無(wú)顯著差異（P＞0.05），而麻仁丸組的c-kit表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，麻仁丸組、腸潤(rùn)方高劑量組和中劑量組的c-kit 表達(dá)量均顯著升高（P＜0.01或P＜0.05），而腸潤(rùn)方低劑量組與模型組比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。其中，腸潤(rùn)方高、中、低劑量組的c-kit表達(dá)量呈逐漸下降的趨勢(shì)。見(jiàn)圖1。

圖1 免疫組化檢測(cè)各組大鼠結(jié)腸中c-kit分布與表達(dá)情況（SP×400）

從SCF 的表達(dá)情況分析，結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組和腸潤(rùn)方中劑量組和低劑量組的SCF表達(dá)量均顯著降低（P＜0.001 或P＜0.01），而麻仁丸組和腸潤(rùn)方高劑量組與空白組比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）；與模型組比較，麻仁丸組、腸潤(rùn)方高劑量組和中劑量組的SCF表達(dá)量均顯著升高（P＜0.01或P＜0.05），而腸潤(rùn)方低劑量組與模型組比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。其中，腸潤(rùn)方高、中、低劑量組的SCF表達(dá)量呈逐漸下降的趨勢(shì)。見(jiàn)圖2。

圖2 免疫組化檢測(cè)各組大鼠結(jié)腸中SCF分布與表達(dá)情況（SP×400）

2.3 Western Blot 檢測(cè)各組大鼠結(jié)腸組織中c-kit、SCF蛋白的表達(dá)與空白組比，模型組、麻仁丸組、腸潤(rùn)方低劑量組c-kit 表達(dá)顯著降低（P＜0.001 或P＜0.01），中、高劑量組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；與模型組比，麻仁丸組及腸潤(rùn)方高、中劑量組c-kit表達(dá)顯著升高（P＜0.001），腸潤(rùn)方低劑量組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖3A、3B。

與空白組比，模型組、麻仁丸組、腸潤(rùn)方中、低劑量組SCF 表達(dá)顯著降低（P＜0.001 或P＜0.01），高劑量組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；與模型組比，麻仁丸組、腸潤(rùn)方高、中劑量組SCF 表達(dá)顯著升高（P＜0.001），低劑量組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖3A、3C。

圖3 western blot檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織c-kit、SCF的蛋白水平

2.4 RT-PCR 檢測(cè)各組大鼠結(jié)腸組織中c-kit、SCF mRNA的表達(dá)與空白組比，模型組、麻仁丸組、腸潤(rùn)方中、低劑量組c-kit mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.001或P＜0.01 或P＜0.05），高劑量組無(wú)明顯差異（P＞0.05）；與模型組相比，麻仁丸組、腸潤(rùn)方高劑量組、中劑量組中c-kit 表達(dá)顯著升高（P＜0.001 或P＜0.05），低劑量組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖4。

與空白組相比，模型組、麻仁丸組、腸潤(rùn)方低劑量組中SCF mRNA 表達(dá)均顯著降低（P＜0.001 或P＜0.01），高、中劑量組無(wú)明顯差異（P＞0.05）；與模型組相比，麻仁丸組、腸潤(rùn)方高、中、低劑量組均顯著升高（P＜0.001或P＜0.01或P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 RT-PCR檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織c-kit、SCF mRNA表達(dá)水平

3 討論

腸道平滑肌與心臟相同，也表現(xiàn)其自主的電節(jié)律性，它起源于肌間神經(jīng)叢周?chē)钠鸩?xì)胞，稱為Cajal間質(zhì)細(xì)胞。ICC通過(guò)自發(fā)產(chǎn)生的節(jié)律性慢波控制腸道收縮的節(jié)點(diǎn)、頻次與方向，慢波由腸神經(jīng)-ICC-平滑肌細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)間的縫隙連接傳播，最終引發(fā)平滑肌的周期收縮[5]。ICC介導(dǎo)胃腸道肌電活動(dòng)的起搏，同時(shí)也是腸內(nèi)神經(jīng)元向胃腸道平滑肌細(xì)胞傳遞信號(hào)的必要條件[6]，因此它被認(rèn)為對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)的調(diào)控至關(guān)重要。ICC的缺失和功能受損直接影響了胃腸道的正常運(yùn)動(dòng)，可引起便秘、糖尿病胃輕癱、功能性消化不良等胃腸動(dòng)力障礙性疾病。在FC患者中相當(dāng)一部分人表現(xiàn)為結(jié)腸排空遲緩，而結(jié)腸動(dòng)力減弱是造成這些患者排空遲緩的原因。充分的證據(jù)顯示[7-9]，F(xiàn)C的發(fā)生與ICC的改變密切相關(guān)。研究表明[10-11]，慢傳輸型便秘（STC）患者結(jié)腸組織中ICC 數(shù)量與體積較正常人明顯降低。一項(xiàng)對(duì)20例重度便秘患者結(jié)腸次全切除術(shù)的病理研究顯示，有60%的患者出現(xiàn)ICC 發(fā)育不全[12]。本研究采用復(fù)方地芬諾脂制備FC 大鼠腸動(dòng)力障礙模型，通過(guò)免疫組化法對(duì)大鼠結(jié)腸組織進(jìn)行觀察，模型組c-kit、SCF 的表達(dá)明顯降低，證實(shí)ICC 參與了FC 的發(fā)病機(jī)制。

在ICC 的發(fā)育、分化及表型的維持中c-kit、SCF及其組成的c-kit/SCF 信號(hào)通路扮演了重要的角色。c-kit 是由人染色體4q11～12 的原癌基因c-kit 編碼的跨膜蛋白，由于其特異性表達(dá)于ICC，ICC可以通過(guò)標(biāo)記c-kit抗體來(lái)識(shí)別。c-kit在胞外配體結(jié)合區(qū)與神經(jīng)元表達(dá)的配體干細(xì)胞因子SCF 結(jié)合，SCF 發(fā)生二聚化后c-kit單體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，產(chǎn)生均聚，導(dǎo)致細(xì)胞膜上氨基殘基的自動(dòng)磷酸化，啟動(dòng)SCF/c-kit 信號(hào)通路，介導(dǎo)各種第二信號(hào)分子調(diào)節(jié)ICC的細(xì)胞功能[13]。研究表明[14]，ICC與平滑肌細(xì)胞都來(lái)源于Kit陽(yáng)性的前體細(xì)胞群，接受Kit 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的Kit 陽(yáng)性前體細(xì)胞保留Kit 的表達(dá)并發(fā)展為功能性ICC，而未經(jīng)該途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)的Kit陽(yáng)性前體細(xì)胞則成為平滑肌細(xì)胞，提示Kit信號(hào)在對(duì)ICC種群的發(fā)育和維持至關(guān)重要。Tong W等[15]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)小鼠注射抗c-kit 單克隆抗體阻斷c-kit 后，小鼠腸內(nèi)ICC 幾乎消失，監(jiān)測(cè)電節(jié)律變化顯示慢波活動(dòng)丟失，局部應(yīng)用SCF后發(fā)現(xiàn)經(jīng)c-kit信號(hào)阻斷的ICC數(shù)量和空腸電節(jié)律恢復(fù)，提示SCF激活的c-kit信號(hào)通路是調(diào)控ICC存活和增殖的關(guān)鍵途徑。在本研究中，與空白組相比，模型組c-kit、SCF 在結(jié)腸組織的表達(dá)明顯降低，c-kit、SCF 蛋白及其基因表達(dá)水平下降。免疫組化結(jié)果顯示c-kit、SCF的表達(dá)與腸潤(rùn)方劑量呈正相關(guān)，經(jīng)腸潤(rùn)方（高、中劑量組）治療，大鼠結(jié)腸組織ckit、SCF 蛋白及c-kit mRNA、SCF mRNA 表達(dá)明顯升高，說(shuō)明FC 的發(fā)生及ICC 的改變與c-kit、SCF 表達(dá)異常、c-kit/SCF 信號(hào)通路受阻相關(guān)，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明腸潤(rùn)方治療FC是通過(guò)介導(dǎo)c-kit、SCF mRNA 的表達(dá)，提高c-kit、SCF 蛋白的表達(dá)，從而修復(fù)c-kit/SCF 信號(hào)通路，提高ICC的數(shù)量和功能，促使ICC恢復(fù)對(duì)胃腸道節(jié)律的正常調(diào)控。

中醫(yī)認(rèn)為正虛邪戀，纏綿不愈，正氣不足是導(dǎo)致慢性便秘的根本原因。FC 病機(jī)在于陰血不足，腸道失潤(rùn)，亦或是氣虛氣滯，推動(dòng)無(wú)力，或兩者兼有。治療便秘時(shí)不應(yīng)局限于通便，而應(yīng)從患者自身整體狀況出發(fā)，發(fā)揮中醫(yī)整體把握、病癥兼顧、平衡陰陽(yáng)及調(diào)和氣血的優(yōu)勢(shì)，改善便秘癥狀的同時(shí)減少其并發(fā)癥，從而提高患者生存質(zhì)量?；谏鲜稣J(rèn)識(shí)，筆者提出“以補(bǔ)通秘”的治療原則，其目的是通便不用瀉藥，通過(guò)健脾行氣、滋陰潤(rùn)腸，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)而達(dá)到標(biāo)本兼治。腸潤(rùn)方是以“滋陰行氣”為基本治法，具有滋陰益氣、行氣潤(rùn)腸的功效。腸潤(rùn)方治療FC 臨床療效顯著，有效提高患者生存質(zhì)量，近期有效率達(dá)90.0%，隨訪3個(gè)月有效率67.5%[2-3]。方中君藥白術(shù)甘溫補(bǔ)虛，歸脾、胃經(jīng)，既可補(bǔ)氣又兼健脾，脾氣健運(yùn)則胃得以行其津液，胃腸分泌旺盛，蠕動(dòng)增強(qiáng)，津行腸潤(rùn)而運(yùn)腸，則腸枯便停之勢(shì)得緩。玄參苦、咸、微寒，壯水之主，啟腎水而能治腸燥舟停之液干；麥冬甘、寒，益陰生津，在《藥品化義》尚有“治虛人元?dú)獠贿\(yùn)，胸腹虛氣痞滿”的補(bǔ)氣之說(shuō)，玄參、麥冬配伍，增液益氣而水流舟行，與方中其他藥物相伍，瀉而不峻，潤(rùn)而不膩，二者共為臣藥。火麻仁甘、平，歸脾、胃、大腸經(jīng)，質(zhì)潤(rùn)多脂，滋陰養(yǎng)血，潤(rùn)腸通便，善于治療津血虧虛之腸燥便秘；枳實(shí)苦、辛、微寒，具有行氣導(dǎo)滯，通導(dǎo)腸腑積滯的功效；檳榔辛溫，行氣布津，歸胃與大腸二經(jīng)，與方中諸味滋陰藥物配伍開(kāi)辛潤(rùn)之用，三者共為臣使之藥。火麻仁配伍白術(shù)可益氣養(yǎng)陰潤(rùn)腸；枳實(shí)配伍白術(shù)，取枳術(shù)丸之意，益氣行津濡潤(rùn)腸道，起到消補(bǔ)兼施的作用；檳榔破氣消積，配伍枳實(shí)，行胃腸之積滯通調(diào)腸道。諸藥相合，共奏健脾行氣、滋陰潤(rùn)腸之功，具有補(bǔ)重于消，寓消于補(bǔ)，以補(bǔ)為通的特點(diǎn)。

本研究表明，腸潤(rùn)方可明顯提高c-kit、SCF 蛋白表達(dá)及c-kit、SCF mRNA 的表達(dá)水平，通過(guò)修復(fù)c-kit/SCF 信號(hào)系統(tǒng)恢復(fù)ICC 對(duì)胃腸道電節(jié)律的正常調(diào)控，達(dá)到促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，恢復(fù)胃腸道動(dòng)力的作用。前期研究表明[4]，腸潤(rùn)方亦可通過(guò)激活P38MAPK信號(hào)通路調(diào)控AQP3、AQP9 的表達(dá)，起到促進(jìn)黏膜分泌黏液潤(rùn)滑腸道作用。腸潤(rùn)方治療便秘具有多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)整體調(diào)控而達(dá)到行氣潤(rùn)腸的效果，進(jìn)一步闡明基于滋陰行氣法的中醫(yī)藥治療FC的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)機(jī)制。