大孔樹脂分離純化迷迭香中齊墩果酸的研究

趙軍

【摘 要】目的：通過研究4種樹脂對齊墩果酸的吸附性能和純化效果，得到分離純化齊墩果酸的最佳工藝。方法：通過4種大孔樹脂的動(dòng)態(tài)吸附，以齊墩果酸的吸附量、解吸率、齊墩果酸含量為指標(biāo)，從中篩選出最佳的分離樹脂為LX-200，再對其純化參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化對比。結(jié)果：LX-200大孔樹脂分離純化的最佳參數(shù)是上柱濃度為732 mg/L，上柱速度為2.0 BV/h，乙醇洗脫量為2.5 BV。結(jié)論：LX-200大孔樹脂可以從迷迭香中很好地分離純化齊墩果酸，所得到干粉的齊墩果酸最高含量為19.98%，為制備工業(yè)大生產(chǎn)提供參考。

【關(guān)鍵詞】齊墩果酸;大孔吸附樹脂;迷迭香;分離純化

0 前言

齊墩果酸（Oleanolic Acid，OA）分子式為C30H48O3，是一種無色、無味、無臭的白色簇狀針晶。分子式如圖1所示。迷迭香具有強(qiáng)化肝臟功能的療效。其中的齊墩果酸可作為廣譜抗菌藥，臨床上用于護(hù)肝降酶，治療支氣管炎、肺炎、急性扁桃體炎、牙周炎、菌痢、急性腸胃炎、泌尿系統(tǒng)感染。此外，臨床上還用于治療急性肝炎。

近年來，齊墩果酸主要是提取來自女貞子，很少有從迷迭香中提取純化報(bào)道，在迷迭香中的含量為0.8～2%。大孔樹脂在植物提取中有著優(yōu)良的使用，目前樹脂分離已經(jīng)是主要的純化方式，具有可重復(fù)使用、無污染等顯著效果。本文采用大孔吸附樹脂法，對迷迭香中的齊墩果酸分離純化工藝進(jìn)行研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀購自安捷倫科技有限公司;FA2204N電子天平購自渡揚(yáng)精密儀器（上海）有限公司自;JA5000C電子天平購自渡揚(yáng)精密儀器（上海）有限公司;R-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自上海耀特儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試劑

大孔樹脂T28購自西安藍(lán)曉公司;大孔樹脂LX-200購自西安藍(lán)曉公司;AB-8購自江蘇蘇青生物技術(shù)有限公司;XAd-8購自杭州爭光樹脂有限公司;齊墩果標(biāo)準(zhǔn)品99%購自中國藥品生物品檢定研究院;甲醇為色譜純，其他試劑為分析純，購自廣州西隴化工產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)原料

迷迭香原料：畢生藥業(yè)公司提供。

2 高效液相色譜檢測分析方法

2.1 色譜條件

色譜柱碳十八柱（ODS/C18）（250 mm×4.6 mm），檢測波長為210 nm，，流動(dòng)相為水（含0.1%H3PO4）：甲醇=（12：88 V/V），流速為0.8 mL/min，柱溫為 28 ℃。

2.2 高效液相HPLC檢測法

取齊墩果標(biāo)準(zhǔn)品99% 12.5mg，用無水乙醇25 mL定溶，溶解完全。采用逐級稀釋法，取定溶的溶液 5 mL加無水乙醇到10 mL，依次取前次10 mL中5 mL加無水乙醇到10 mL，再取此次的2 mL加無水乙醇到10 mL，續(xù)取前次2 mL加無水乙醇到10 mL，混合均勻后，用高效液相檢測。以峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量百分比濃度，就回歸方程：Y=6.330 7X-31.509 R2=0.999 7，表明齊墩果酸濃度在5～100 mg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.3 樣品檢測

取樣品溶液，稀釋到一定體積后，用高效液相色譜測定，通過回歸方程計(jì)算齊墩果酸濃度。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 上樣吸附液制備

取迷迭香原料10 kg，煮沸回流提取2次，每次加入7 L，70%乙醇，2 h提取1次，提取液過濾布200目，合并提取液，減壓濃縮，離心，沉淀干燥，混勻，得提取物干粉1.5 kg。經(jīng)測定，齊墩果酸為10%。實(shí)驗(yàn)前，取上述迷迭香提取物干粉，加70%乙醇，根據(jù)需要含量制成固體含量為5%～10%（質(zhì)量體積百分?jǐn)?shù)）的醇溶液，作為上樣吸附液。

3.2 大孔樹脂的活化預(yù)處理

樹脂先用95%乙醇浸泡溶脹24 h，濕法裝柱，用1 BV的樹脂柱的95%乙醇洗脫樹脂，接著用6倍量樹脂的純水加洗至流出液不變白色渾濁為止。然后依次用4%的氫氧化鈉浸泡，純水洗到pH中性，3倍量樹脂體積的5%鹽酸，沖洗樹脂，最后用大量的純水洗至流出的水中性，備用。

3.3 動(dòng)態(tài)吸附樹脂的篩選

準(zhǔn)確移取4份為2 000 mL 8%吸附原液作為上樣液，分別通過T28、LX-200、AB-8、XDA-8大孔樹脂柱，（量取預(yù)處理的4種樹脂各300 mL，分別裝入直徑為45 mm的玻璃柱，先用50%乙醇500 mL洗脫樹脂）進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，速度為6.0～6.5 mL/min，用500 mL 50%乙醇和用90%乙醇800 mL相同的速度洗脫，分別收集50%乙醇洗脫流出液（包含上樣流出液）和90%乙醇洗脫液，濃縮，干燥。測定各干粉的齊墩果酸含量，計(jì)算其吸附量、解析率。篩選最好的樹脂。結(jié)果 T28、LX-200、AB-8、XDA-8的吸附率分別為95.44、97.52、95.22、94.32，解析率分別為97.40、99.50、98.35、98.42，經(jīng)比較選用LX-200樹脂作為對齊墩果的分離純化工藝進(jìn)行研究（見表1）。

3.4 樹脂對齊墩果的分離效果——吸附

3.4.1 上樣液濃度對吸附效果的影響

準(zhǔn)確稱取齊墩果酸干粉，用70%乙醇稀釋到濃度分別為366 mg/L、732 mg/L、1464 mg/L，每柱進(jìn)樣1.8 L溶液，過濾后按1.0 BV/h上柱吸附，用2.5 BV 90%乙醇洗脫，收集洗脫液，測定齊墩果酸的含量。結(jié)果顯示：洗脫液含量最高為19.98%，樹脂的回收率隨著上樣的濃度的增加而減少。說明樹脂已經(jīng)過飽和狀態(tài)，綜合這兩者的優(yōu)勢考慮，確定上樣量732 mg/L為最好的濃度（見表2）。

3.4.2 上樣液流速對樹脂吸附分離的影響

準(zhǔn)確稱取齊墩果酸干粉，用70%乙醇稀釋到齊墩果濃度分別為732 mg/L，過濾后分別按1.0 BV/h、2.0 V/h、3.0 V/h、4.0 V/h的速度上LX-200樹脂柱吸附，進(jìn)完柱后，關(guān)閉流出閥，待吸附完全后，再用2.5BV 90%乙醇洗脫，收集洗脫液，測定齊墩果酸的含量和計(jì)算回收率。4種流速的含量和回收率分別為19.20%、19.98%、18.35%、16.25%和95.21%、95.66%、96.46%、97.05%。結(jié)果顯示，隨著流速的增加，洗脫液的含量逐漸降低，回收率是逐漸增加。綜合干粉的含量和回收率的考察，選擇2.0 BV/h為最佳流速（見表3）。

3.4.3 洗脫量對樹脂吸附效果的影響

以優(yōu)選的LX-200大孔樹脂柱為載體柱，準(zhǔn)確稱取齊墩果酸干粉，用70%乙醇稀釋到齊墩果酸濃度分別為732 mg/L，過濾后按2.0 V/h的速度上柱吸附，分別用1.5 BV、2.5 BV、3.5 BV、4.5 BV 90%乙醇洗脫，分別收集洗脫液，測定齊墩果酸的含量和計(jì)算回收率。不同的洗脫量的含量和回收率分別是18.55%、19.85%、19.53%、19.65%和89.02%、96.35%、93.54%、94.25%。結(jié)果顯示，齊墩果酸的含量隨著洗脫量的增加而增加，當(dāng)達(dá)到2.5 BV后，穩(wěn)定，沒有很明顯的增加，從工藝簡化、成本生產(chǎn)可以確認(rèn)最佳的洗脫量為2.5 BV洗脫（見表4）。

4 結(jié)論

齊墩果的生物活性功能受到越來越多的關(guān)注，作為肝病藥物有效成分的最主要單體、功能性的成分，它具有潛在的價(jià)值和很大的應(yīng)用前景。

本研究首先通過考察4種大孔樹脂T28、LX-200，AB-8、XDA-8進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，對比其樹脂對有效成分的吸附率和解析性能，確定LX-200大孔樹脂作為迷迭香中齊墩果分離純化的載體。通過對LX-200大孔樹脂的上樣量、上樣流速、洗脫量等因素對齊墩果酸純化效果考察，得到LX-200大孔樹脂分離純化的最佳條件：上柱濃度為732 mg/L，上柱速度為2.0 BV/h，90%乙醇洗脫量為2.5 BV可以得到最佳的純化效果。

結(jié)果表明，LX-200大孔樹脂作為填料，可以很好地分離出迷迭香中的齊墩果酸，工藝簡單，容易操作，全程沒有用到有毒試劑，污染小，為工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)提供很好的工藝參考。純化后，對環(huán)境產(chǎn)品采用HPLC檢查，其含量達(dá)到19.98%，產(chǎn)品淡黃色，可滿足市場對齊墩果的含量要求。

參 考 文 獻(xiàn)

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