大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

徐威　貝朝涌　粟謀　陳寧　蔣林彬

[摘要] 目的 觀察全骨髓貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的效果。 方法 將4周齡健康SD大鼠脫頸處死后，無菌條件下取出股骨和脛骨，收集骨髓腔細(xì)胞懸液，L-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過全骨髓貼壁培養(yǎng)法將細(xì)胞純化傳代，觀察其生長特性，繪制生長曲線。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29、CD45、CD90并作同型對照，細(xì)胞分別向成骨、成脂方向誘導(dǎo)分化，觀察誘導(dǎo)結(jié)果。 結(jié)果 經(jīng)全骨髓貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)的SD大鼠BMSCs呈集落狀貼壁生長，鏡下可見細(xì)胞成簇生長，類似魚群狀、菊花瓣?duì)罨蜾鰷u狀。BMSCs增殖速度快，細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，生長狀態(tài)較好。生長曲線顯示BMSCs符合正常細(xì)胞生長特征且生長活躍。流式細(xì)胞儀鑒定CD29和CD90呈陽性表達(dá)，CD45呈陰性表達(dá)。BMSCs能向成骨、成脂方向誘導(dǎo)分化。 結(jié)論 全骨髓貼壁培養(yǎng)法簡單易行，可獲得純度高，活性好，性狀均一的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。

[關(guān)鍵詞] 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；分離純化；培養(yǎng)；分化；鑒定

[中圖分類號] R414.4 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）32-0030-05

[Abstract] Objective To observe the effect of BMSCs through the method of whole bone marrow adherent culture. Methods After 4-weeks-old healthy SD rats were killed by cervical dislocation， the femur bone and tibia bone were taken out under sterile conditions. Marrow cell suspensions were collected then cultured in L-DMEM medium. The method of the whole bone marrow adherent culture was used to passage purified. The growth characteristic was observed and the growth curve was drawn. CD29， CD45， CD90 of the cell surface markers were detected by flow cytometry and made an isotype control. The cells could be induced to differentiate into osteogenic and adipogenic direction respectively and the results were observed. Results Cultured by the method of the bone marrow adherent， the BMSCs of SD rat showed colony adherent growth and other sharp like cell clusters， similar fish，daisy-like petals or whirlpool under microscope. BMSCs had high rate of proliferation， stabilization of morphology and good growth condition. BMSCs showed the growth characteristics of normal cells and actively growing in the growth curve. The expression of CD29 and CD90 were identified positive by flow cytometry. The expression of CD45 showed negative. BMSCs could be induced to differentiate into osteogenic and adipogenic direction， respectively. Conclusion The method of whole bone marrow adherent culture is simple and can get bone marrow stromal cells of high purity， activity， and homogeneous traits.

[Key words] Bone marrow stromal cells； Isolated and purified； Culture； Differentiation； Identification

1976年Friedenstein等[1-4]從骨髓中分離出骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stromal cells，BMSCs），并發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞能在體外大量增殖，貼壁呈集落樣生長，并且具有定向分化的能力。因其取材簡便，克服了部分倫理道德和免疫排斥等問題[5，6]，因此受到人們的廣泛關(guān)注。由于BMSCs無特異性的表面抗原表型，因此對BMSCs進(jìn)行分離、提純、鑒定存在一定的難度。目前，主要有全骨髓貼壁培養(yǎng)法、流式細(xì)胞儀分選法、密度梯度離心法和免疫磁珠分選法獲得BMSCs。盡管目前有很多種方法能從骨髓中分離獲取BMSCs，但是仍沒有一個(gè)最佳的培養(yǎng)方案[7-9]。本研究嘗試全骨髓貼壁培養(yǎng)法體外培養(yǎng)SD大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，觀察其生物學(xué)特性，鑒定細(xì)胞表型，并定向誘導(dǎo)其分化成骨、成脂，以期獲得一種生長狀態(tài)良好，純度高，生物學(xué)性狀穩(wěn)定的大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材料

4齡SD大鼠10只（SPF級），雌雄不限。體重約120 g/只。購于廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。合格證號：SCXK（桂）2009-0002。DMEM-LG培養(yǎng)基，新生胎牛血清（美國Hyclone公司）。0.25% EDTA-胰酶（上海生工生物工程技術(shù)有限公司）。噻唑藍(lán)（MTT）青-鏈霉素（雙抗），二甲基亞砜（DMSO）（北京賽萊博科技發(fā)展有限公司）。Anti-Mouse/Rat CD29 （Integrin beta 1） FITC，Anti-Rat CD45 PE，Anti-rat CD90 FITC，Armenian Hamster IgG Isotype Control FITC，Mouse IgG1 K Isotype Control PE（ebioscience公司）。成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，茜素紅溶液，油紅O溶液（cyagen公司）。

1.2 方法

1.2.1 研究時(shí)間 2012年9月～2013年4月。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞取材 處死大鼠后，放入75%酒精浸泡約10 min，無菌條件下取出股骨和脛骨，PBS沖洗后，剪開兩側(cè)骨端，DMEM低糖培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞懸液，并置入70 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，加入適量完全培養(yǎng)基，放置于 37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.3 大鼠BMSCs培養(yǎng)及傳代 上述骨髓細(xì)胞懸液培養(yǎng)3 d后首次換液，以后每2天換液一次，以去除未貼壁細(xì)胞。當(dāng)貼壁細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)，去除培養(yǎng)液，胰蛋白酶消化。1000 rpm/min離心5 min，按照1∶2比例傳代，每2天換液一次，直至細(xì)胞融合至80%～90%，再進(jìn)行消化傳代。

1.2.4 大鼠BMSCs細(xì)胞形態(tài)觀察 倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，鏡檢拍照。

1.2.5 大鼠BMSCs生長曲線繪制（MTT法） 以1×104/cm2接種處于對數(shù)生長期的P7代BMSCs于96孔板。每孔加入200 μL完全培養(yǎng)液置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，隔天換液1次。從種板第2天起每天取一板，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)。棄除孔中培養(yǎng)液。每孔加入150 μL DMSO溶液，置于搖床上緩慢搖勻10 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀測定，選擇490 nm波長，測各孔吸光度值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度均值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.6 大鼠BMSCs流式細(xì)胞儀細(xì)胞表型鑒定 胰蛋白酶消化P7代大鼠BMSCs，PBS液終止消化，短時(shí)低速離心2～3次，以去除細(xì)胞懸液中的細(xì)胞碎片。計(jì)數(shù)細(xì)胞：以106個(gè)/管的細(xì)胞數(shù)分別加入A、B、C、D、E共5個(gè)EP管。A管加入2 μL CD29-FITC，B管加入1.25 μL CD45-PE，C管加入1.25 μL CD90-PE，D管加入2 μL CD29同型-FITC，E管加入1.25 μL同型-PE。4℃冰箱避光孵育30 min。PBS液洗滌1～3次，以200 μL PBS液重懸細(xì)胞后，細(xì)胞篩過濾，移入上樣管，流式細(xì)胞儀檢測表面標(biāo)記CD29、CD45、CD90表達(dá)情況。

1.2.7 成骨誘導(dǎo) 選擇P5代SD大鼠BMSCs，待細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)，消化。將干細(xì)胞接種于干燥的明膠溶液六孔板中，每孔約3×103個(gè)細(xì)胞，加入2 mL/孔干細(xì)胞完全培養(yǎng)液。放入37°C，5% CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后，移除培養(yǎng)液，加入2 mL/孔成骨誘導(dǎo)液。每3天換液，誘導(dǎo)3周后進(jìn)行茜素紅染色。對照組加入等量完全培養(yǎng)基，相同條件下培養(yǎng)進(jìn)行茜素紅染色。倒置相差顯微鏡下觀察兩組結(jié)果并拍照。

1.2.8 大鼠BMSCs成脂誘導(dǎo) 選擇P5代SD大鼠BMSCs，0.25%胰酶消化接種于六孔板中，每孔約2.0×104個(gè)，加入2 mL完全培養(yǎng)液置于37°C，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。每3天更換細(xì)胞完全培養(yǎng)液，直至細(xì)胞生長達(dá)到100%融合。移除培養(yǎng)液，每孔加入2 mL成脂誘導(dǎo)液A，3 d后更換成成脂誘導(dǎo)液B進(jìn)行維持培養(yǎng)，24 h后更換成成脂誘導(dǎo)液A再次誘導(dǎo)，重復(fù)3～5個(gè)循環(huán)。當(dāng)脂滴出現(xiàn)較多，但形態(tài)較小時(shí)，改用成脂誘導(dǎo)液B進(jìn)行維持7 d，脂滴增大時(shí)，行油紅O染色。對照組加入等量的完全培養(yǎng)基，相同條件下培養(yǎng)進(jìn)行油紅O染色。倒置相差顯微鏡下觀察兩組結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSCs生長及形態(tài)觀察

經(jīng)體外培養(yǎng)的大鼠P0代BMSCs 24 h后部分細(xì)胞開始貼壁，48～72 h貼壁細(xì)胞在皿底伸展開，呈短梭形；1～2 d后細(xì)胞形態(tài)呈多邊形，細(xì)胞呈集落狀生長。P0代細(xì)胞增殖速度較慢，約5～7 d后細(xì)胞集落匯合達(dá)80%以上，并快速開始增值，細(xì)胞形態(tài)以梭形為主，較一致。倒置相差顯微鏡下觀察可見細(xì)胞成簇生長，類似魚群狀、菊花瓣?duì)罨蜾鰷u狀。全骨髓貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)的SD大鼠BMSCs能穩(wěn)定增殖10代以上。P1～P5代BMSCs增殖速度較快，細(xì)胞生長狀態(tài)好，形態(tài)穩(wěn)定。其后逐漸減慢，P10代之后細(xì)胞形態(tài)明顯老化，細(xì)胞包體變大，邊緣粗糙，形狀不規(guī)則。見封三圖9。

2.2 MTT法繪制大鼠BMSCs生長曲線

SD大鼠BMSCs在接種于6孔板后1～ 2 d，細(xì)胞生長曲線低平，吸光值變化不大，為細(xì)胞潛伏適應(yīng)期。隨后的第3～8天見細(xì)胞生長曲線呈“J”型，說明該時(shí)間段細(xì)胞處于對數(shù)生長期。第8天后細(xì)胞增殖減慢明顯，曲線變得平緩，進(jìn)入平臺期。見圖1。

2.3 大鼠BMSCs流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞CD29、CD45、CD90表型鑒定結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)取CD29、CD45、CD90及其同型抗體，流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定，結(jié)果表明，全骨髓貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)的第7代SD大鼠BMSCs表達(dá)CD29，CD90，陽性率為90.4%，81.2%；而不表達(dá)CD45，陽性率為0.6%。同型-FITC表達(dá)率為0.4%，同型-PE表達(dá)率為0.4%，說明本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的細(xì)胞符合大鼠BMSCs的表型特征。見圖2。

2.4 大鼠BMSCs成骨誘導(dǎo)結(jié)果

將成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)誘導(dǎo)21 d的SD大鼠BMSCs和普通完全培養(yǎng)液培養(yǎng)誘導(dǎo)21 d的SD大鼠BMSCs同時(shí)行茜素紅染色后，放置于倒置相差顯微鏡下觀察。倒置相差顯微鏡下可見誘導(dǎo)培養(yǎng)組出現(xiàn)明顯染色的鈣結(jié)節(jié)，而對照組未見鈣結(jié)節(jié)。說明本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)培養(yǎng)的SD大鼠BMSCs具有成骨能力。見封三圖10。

2.5 大鼠BMSCs成脂誘導(dǎo)結(jié)果

將成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)5個(gè)周期的SD大鼠BMSCs和普通完全培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)的SD大鼠BMSCs同時(shí)進(jìn)行油紅O染色后，放置于倒置相差顯微鏡下觀察結(jié)果。倒置相差顯微鏡下可見誘導(dǎo)培養(yǎng)組出現(xiàn)染色明顯的脂滴，而對照組未見明顯的脂滴。說明本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)培養(yǎng)的SD大鼠BMSCs具有成脂能力。見封三圖11。

3 討論

3.1 BMSCs的體外分離與培養(yǎng)

全骨髓貼壁培養(yǎng)法是應(yīng)用最早的純化、分離BMSCs的方法。由Luria 等[10]首先發(fā)現(xiàn)BMSCs貼壁生長的特性，并發(fā)明了這種純化、分離BMSCs的培養(yǎng)方法。全骨髓貼壁培養(yǎng)法根據(jù)BMSCs在培養(yǎng)皿中貼壁生長，而造血系細(xì)胞在培養(yǎng)皿中懸浮生長的特性區(qū)別，通過定期更換培養(yǎng)液，去除懸浮細(xì)胞和細(xì)胞碎片，收集貼壁生長的BMSCs的方法。

該培養(yǎng)法所抽取的骨髓不經(jīng)過過濾也不離心，骨髓中豐富的生長因子得以保存，這些生長因子能促進(jìn)BMSCs的增殖。其操作簡單，既降低了離心對細(xì)胞的損害，又減少了污染機(jī)會(huì)，節(jié)省實(shí)驗(yàn)費(fèi)用，且分離的BMSCs貼壁時(shí)間短，增殖周期短，細(xì)胞數(shù)量較多，經(jīng)多次傳代后能夠逐步純化，是獲取分離BMSCs的成本低廉的簡單有效方法[11-13]。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用全骨髓貼壁培養(yǎng)法純化和分離SD大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)的大鼠P0代BMSCs 24～48 h左右部分細(xì)胞開始貼壁，48～72 h貼壁細(xì)胞在皿底伸展開，呈短梭形；1～2 d后細(xì)胞呈集落狀生長，部分細(xì)胞呈多邊形，細(xì)胞形態(tài)主要為成纖維樣細(xì)胞。傳代細(xì)胞12 h左右能穩(wěn)定貼壁，并快速開始增值，細(xì)胞形態(tài)以梭形為主，較一致，倒置相差顯微鏡下觀察可見細(xì)胞成簇生長，類似魚群狀、菊花瓣?duì)罨蜾鰷u狀。約2～5 d長滿瓶底。全骨髓貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)的SD大鼠BMSCs能穩(wěn)定增殖10代以上。細(xì)胞增殖速度快，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞形態(tài)均一穩(wěn)定。SD大鼠BMSCs在接種于6孔板后1～2 d為細(xì)胞潛伏適應(yīng)期，隨后的第3～8天見細(xì)胞生長曲線呈“J”型，說明該時(shí)間段細(xì)胞處于對數(shù)生長期。第8天后細(xì)胞增殖減慢明顯，曲線變得平緩，進(jìn)入平臺期。從細(xì)胞增殖傳代能力和形態(tài)學(xué)上觀察該法可獲得生長狀態(tài)良好，高純度的SD大鼠BMSCs。

3.2 BMSCs的表型鑒定

迄今為止BMSCs表面抗原具有非專一性，BMSCs表面未發(fā)現(xiàn)特異性抗原表型。BMSCs表達(dá)CD105、CD73、CD90、CD29等。BMSCs不表達(dá)HLA-DR，即主要組織相容性復(fù)合物分子，不表達(dá)HLA-Ⅱ抗原、MHC-Ⅱ分子、B7-1、B7-2、CD11a、CD40和Fas L，不表達(dá)或極低水平表達(dá)HLA-Ⅰ抗原、MHC-Ⅰ分子。BMSCs也不表達(dá)造血細(xì)胞表面陽性標(biāo)志，例如CD14、CD34、CD45等[14]，BMSCs具有低免疫原性、誘導(dǎo)免疫耐受和免疫抑制的作用。目前，對BMSCs的研究仍處于探索階段，還沒有理想的、用于鑒定的標(biāo)志性分子或方法[15-17]。2006年，國際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)確定BMSCs的鑒定標(biāo)準(zhǔn)為：①從骨髓中提取，在塑料培養(yǎng)皿內(nèi)貼壁生長，在含血清的培養(yǎng)基內(nèi)高度增殖。②表達(dá)CD105、CD73、CD90，不表達(dá)CD34、CD45、CD14或CD11b、CD79a或CD19；③在體外可以分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等。并非某個(gè)或某幾個(gè)表面標(biāo)記符合干細(xì)胞的特性就能證明該細(xì)胞是BMSCs。一般是通過BMSCs的細(xì)胞形態(tài)、表型及功能來綜合鑒定。

本實(shí)驗(yàn)取CD29、CD45、CD90及其同型抗體，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定，結(jié)果顯示，該法培養(yǎng)的P7代SD大鼠BMSCs表達(dá)CD29，CD90，陽性率分別為90.4%，81.2%；而不表達(dá)CD45，陽性率為0.6%。同型-FITC表達(dá)率為0.4%，同型-PE表達(dá)率為0.4%，說明本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞符合大鼠BMSCs的表型特征。

3.3 BMSCs的多向分化潛能鑒定

BMSCs具有很強(qiáng)的多向分化以及自我更新潛能，且經(jīng)多次傳代后，這些細(xì)胞還能保持多向分化潛能。最近的研究表明BMSCs可在體內(nèi)、體外誘導(dǎo)分化成為各族中胚層組織來源的細(xì)胞[18-22]。

本實(shí)驗(yàn)將成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)誘導(dǎo)的SD大鼠BMSCs行茜素紅染色后，放置于倒置相差顯微鏡下觀察結(jié)果，倒置相差顯微鏡下可見染色明顯的鈣結(jié)節(jié)，而對照組未見鈣結(jié)節(jié)。說明本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)誘導(dǎo)的SD大鼠BMSCs具有成骨能力。將成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)誘導(dǎo)的SD大鼠BMSCs行油紅O染色后，放置于倒置相差顯微鏡下觀察結(jié)果。倒置相差顯微鏡下可見明顯染色的脂滴，而對照組未見明顯的脂滴。說明本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的SD大鼠BMSCs具有成脂能力。

綜上所述，全骨髓貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)出的BMSCs為生長狀態(tài)良好，純度高，且分化及增殖能力強(qiáng)的BMSCs。

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（收稿日期：2015-08-27）