大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)鑒定及復(fù)方扶芳藤合劑含藥血清對(duì)細(xì)胞增殖的影響

周倍伊，吳亞姍，周 圍，謝金玲，鐘衛(wèi)干，楊力強(qiáng)，黃正團(tuán)，黃鎧琴

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200）

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是存在于骨髓中的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞［1］，是理想的組織工程種子細(xì)胞［2］。BMSCs來(lái)源于骨髓組織，其在所有的骨髓細(xì)胞中僅占0.01?～0.1?，數(shù)量極少［3］。而且BMSCs的數(shù)量隨機(jī)體年齡增加而逐漸減少，所以僅從骨髓組織中提取收集的間充質(zhì)干細(xì)胞難以滿足組織工程實(shí)驗(yàn)的需要［4］。因此，尋找穩(wěn)定有效的擴(kuò)增BMSCs及促進(jìn)BMSCs增殖的方法是臨床亟待解決的重要問(wèn)題。

復(fù)方扶芳藤合劑是廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠的產(chǎn)品，由扶芳藤、黃芪、人參等組成，臨床用于治療心脾兩虛，氣血不足［5］。有研究表明，人參中的有效成分人參皂苷Rg1和黃芪的有效成分黃芪甲苷均可促進(jìn)BMSCs的體外增殖［6-7］。本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)BMSCs，用不同濃度的復(fù)方扶芳藤合劑含藥血清干預(yù)BMSCs，觀察不同濃度的復(fù)方扶芳藤合劑含藥血清對(duì)BMSCs增殖的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 健康雄性4周齡SD大鼠120只，SPF級(jí)，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK桂2010-0001。試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》標(biāo)準(zhǔn)［7］。

1.2 主要試劑 eBioscience?CD45 APC抗體（賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司，lot：4322388）；Invitrogen CD29 PE-Cyanine7（賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司，lot：1989069）；Invitrogen CD44 PE抗體（賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司，lot：TG2605458）；Novus CD34 Alexa Fluor?488抗體（美國(guó)Novus Biologicals公司，lot：E-3-07231-AF）；Flow Cytometry Staining Buffer（賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司，lot：1945430）；Cell cycle staining KIT（中國(guó)聯(lián)科生物有限公司，lot：LK811）；Gibco低糖液體培養(yǎng)基（L-DMEM）、PBS、胎牛血清、胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司）；Cyagen SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒、SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒均購(gòu)自蘇州賽業(yè)生物科技有限公司。

1.3 儀器 Attune Nxt流式細(xì)胞儀（賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司）；CKX53倒置相差顯微鏡（奧林巴斯中國(guó)有限公司）；EnVision高通量酶標(biāo)儀篩選系統(tǒng)（美國(guó)鉑金埃爾默有限公司）；Bio-Rad TC20全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）。

2 方法

2.1 BMSCs的原代分離培養(yǎng) 取4周齡雄性SPF級(jí)健康SD大鼠，頸椎脫臼處死，75%乙醇全身浸泡1 min，無(wú)菌條件下快速去除肌肉等軟組織，取出股骨及脛骨，75%乙醇浸泡清洗1次，胎牛血清（FBS）浸泡清洗2次。無(wú)菌條件下剪去長(zhǎng)骨的骨骺端，露出骨髓腔［8］，用含有10%FBS的低糖液體培養(yǎng)基（L-DMEM）沖洗骨髓腔，直至骨質(zhì)發(fā)白；將沖出的骨髓內(nèi)容物制成單細(xì)胞懸液，靜置后，移取上清液至新離心管中，沉淀物用完全培養(yǎng)基重懸后種瓶，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 BMSCs的培養(yǎng)、純化及傳代 在原代細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，24 h后換液更換半數(shù)培養(yǎng)基，48 h后換液更換全量培養(yǎng)基。此后每2～3 d全量更換1次完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底約90%時(shí)，使用胰酶-EDTA（乙二胺四乙酸）溶液消化，按1∶2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)［9］。每日用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長(zhǎng)狀況［10］。

2.3 BMSCs生長(zhǎng)曲線測(cè)定（包含標(biāo)準(zhǔn)曲線制作） 將生長(zhǎng)狀況良好的BMSCs傳至第3代，消化重懸后制成細(xì)胞懸液，用全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)其中細(xì)胞數(shù)量。接種細(xì)胞，選擇3 000/孔細(xì)胞濃度種板，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后每孔加入CCK-8試劑10μl，繼續(xù)培養(yǎng)1 h、2 h、3 h、4 h后進(jìn)行檢測(cè)，選擇450 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光度值，記錄結(jié)果。以孵育時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。接種細(xì)胞，設(shè)置5 個(gè)濃度梯度，分別為 10 000/孔、7 500/孔、5 000/孔、2 500/孔和1 250/孔，使用96孔板，每組6個(gè)復(fù)孔，每組加入完全培養(yǎng)基100μl。將培養(yǎng)板移入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)［11］，定時(shí)進(jìn)行CCK-8檢測(cè)。在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光度值，以細(xì)胞數(shù)量為橫軸，吸光度為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。選擇3 000/孔細(xì)胞濃度種板，連續(xù)7 d，每日取1板進(jìn)行CCK-8檢測(cè)，記錄結(jié)果。以接種時(shí)間為橫軸，吸光度為縱軸，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2.4 成骨誘導(dǎo)分化及茜素紅染色 按試劑盒說(shuō)明書(shū)配置成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基，將P3代BMSCs按2×104cells/cm2細(xì)胞密度接種在事先包被0.1%明膠的6孔板中，每孔加入2 ml L-DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后更換成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基［12］，之后每3 d更換1次，各自誘導(dǎo)7 d，14 d，21 d后，吸走培養(yǎng)基，用PBS沖洗2次，每孔加入2 ml 4%中性甲醛溶液，固定30 min。吸走中性甲醛溶液，PBS沖洗2次，每孔加入1 ml茜素紅染液染5 min。吸走茜素紅染液，PBS沖洗3次［13］。置于顯微鏡下觀察拍照。

2.5 成脂誘導(dǎo)分化及油紅O染色 按試劑盒說(shuō)明書(shū)配置成脂誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基A液與B液，將P3代BMSCs按2×104cells/cm2細(xì)胞密度接種6孔板中，每孔加入2ml L-DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后更換成脂誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基A液，誘導(dǎo)3 d后，吸走A液，加入2 ml B液，1 d后，吸走B液，換回A液進(jìn)行誘導(dǎo)。A液和B液交替作用15 d后，繼續(xù)用B液維持培養(yǎng)7 d直到脂滴變得足夠大、圓［14］。誘導(dǎo)結(jié)束后，吸走培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，每孔加入2 ml 4%中性甲醛溶液，固定30 min。吸走中性甲醛溶液，PBS沖洗2次，每孔加入1 ml油紅O工作液染色30 min。吸走油紅O染液，PBS沖洗3次。置于顯微鏡下觀察拍照。

2.6 BMSCs細(xì)胞周期的檢測(cè) 收集P3代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度1×106cells/ml，離心棄上清液，PBS洗滌1次，離心棄上清液。加入1ml DNA染色液和10μl Permeabilization溶液，旋渦振蕩10 s混勻，室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.7 BMSCs表面標(biāo)記物的表達(dá)鑒定 收集P3代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，0.25%胰酶消化，4℃離心，1 000 r/min，3 min，PBS清洗細(xì)胞3次，細(xì)胞計(jì)數(shù)［15］，調(diào)整濃度為1×106cells/ml，各管加入100μl細(xì)胞懸液，各管依次加入單克隆抗體CD29、CD34、CD44、CD45和四染管，同時(shí)每管單染管設(shè)立陰性對(duì)照組，避光孵育15 min，每管加入2 ml流式緩沖液清洗3次，除去未結(jié)合抗體，300 g/min，5 min，離心棄上清液，500 μl流式緩沖液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。

2.8 不同濃度含藥血清干預(yù)與生長(zhǎng)曲線測(cè)定 收集P3代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，按3×104cells/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μl。總共分為3個(gè)大組，7個(gè)小組，即空白對(duì)照組，空白血清組，含藥血清組。空白對(duì)照組使用L-DMEM培養(yǎng)基；空白血清組使用空白大鼠血清+L-DMEM培養(yǎng)基，空白大鼠血清分3個(gè)濃度組，即分別為5%、10%、20%組；含藥血清組使用含藥大鼠血清+L-DMEM培養(yǎng)基，含藥大鼠血清分3個(gè)濃度組，分別為5%、10%、20%組。空白血清與含藥血清均用0.22μm濾膜過(guò)濾滅菌。各組干預(yù)培養(yǎng)后，每組每天取細(xì)胞6孔，連續(xù)7 d采用CCK-8比色法檢測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)處吸光度（A）值，繪制生長(zhǎng)曲線。

3 結(jié)果

3.1 BMSCs形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 使用全骨髓貼壁培養(yǎng)法接種骨髓細(xì)胞于培養(yǎng)瓶后觀察發(fā)現(xiàn)，鏡下檢查細(xì)胞數(shù)量多，種類(lèi)雜，圓形透亮的為紅細(xì)胞且占大多數(shù)。24 h后觀察發(fā)現(xiàn)存在部分細(xì)胞已經(jīng)貼壁分散生長(zhǎng)，通過(guò)半換液去除未貼壁的細(xì)胞。48 h后觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)瓶底出現(xiàn)多個(gè)細(xì)胞集落，呈放射狀，伸出長(zhǎng)短不一、粗細(xì)不均的突起，未出現(xiàn)融合生長(zhǎng)，單個(gè)細(xì)胞形態(tài)呈梭形（圖1A）。繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞集落面積不斷增大，且與周邊集落逐漸融合生長(zhǎng)，培養(yǎng)7 d后長(zhǎng)梭形細(xì)胞集落呈漩渦狀或放射狀，同向排列（圖1B）。傳代前記錄發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞排列緊密，均勻鋪滿培養(yǎng)瓶底，約占據(jù)90%瓶底空間，部分細(xì)胞沒(méi)有生長(zhǎng)空間，出現(xiàn)重疊或漂浮情況（圖1C）。傳代培養(yǎng)：1∶2消化傳代后，傳代細(xì)胞24 h即完全貼壁生長(zhǎng)。細(xì)胞形態(tài)均一，呈典型梭形，旋渦狀或放射狀排列生長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，每5 d即可傳代1次。

3.2 BMSCs生長(zhǎng)曲線 BMSCs細(xì)胞數(shù)量與吸光度的關(guān)系基本呈線性關(guān)系，R2=0.9914（圖2A）。CCK-8的最佳孵育時(shí)間為2 h（圖2B）。BMSCs在接種第1～2 d細(xì)胞緩慢生長(zhǎng)，為細(xì)胞潛伏適應(yīng)期；第3～5 d細(xì)胞迅速增殖，生長(zhǎng)曲線基本為線性曲線，表明這段時(shí)間是細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；第6～7 d后生長(zhǎng)速度逐漸減慢至平穩(wěn)，曲線變得平緩，表明進(jìn)入平臺(tái)期（圖2C）。

圖1 BMSCs形態(tài)學(xué)特征

圖2 BMSCs生長(zhǎng)曲線

3.3 BMSCs成骨分化及茜素紅染色結(jié)果 BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)14 d后，顯微鏡下觀察到細(xì)胞由梭形變?yōu)槎嘟切渭?xì)胞，細(xì)胞之間界限模糊，重疊生長(zhǎng)且逐漸聚集成多個(gè)分散致密的島狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)，堆積排列形成散在的細(xì)胞結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)中含大量礦鹽沉積的鈣化結(jié)節(jié)，茜素紅染色表現(xiàn)為黑色的致密結(jié)節(jié)（圖3）。

圖3 BMSCs成骨分化及茜素紅染色（×400）

3.4 BMSCs成脂分化及油紅O染色結(jié)果 成脂誘導(dǎo)22 d后，誘導(dǎo)而成的脂肪細(xì)胞累積脂質(zhì)，脂滴變大變圓，部分聯(lián)結(jié)后呈魚(yú)籽狀，經(jīng)油紅O染色呈鮮紅色（圖4）。

3.5 BMSCs細(xì)胞周期 流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，85.14%BMSCs細(xì)胞處于G0/G1期，6.48%處于G2/M期，8.38%處于S期（圖5），表明BMSCs具有較強(qiáng)的分裂增殖能力，符合干細(xì)胞的一般特征。

圖4 BMSCs成脂分化及油紅O染色（×400）

圖5 BMSCs細(xì)胞周期

3.6 BMSCs表面標(biāo)記物的表達(dá)結(jié)果 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)的第3代大鼠BMSCs均一表達(dá)CD29、CD44，陽(yáng)性率分別為99.952%，99.677%；而CD34、CD45呈陰性，陽(yáng)性率分別為0.016%，0.113%（圖6）。

3.7 各組BMSCs細(xì)胞生長(zhǎng)OD值測(cè)定 見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，不同濃度的含藥血清及空白血清均能促進(jìn)BMSCs細(xì)胞的生長(zhǎng)（P＜0.05）；與同濃度的空白血清作用比較，20%含藥血清組明顯優(yōu)于20%空白血清組，1～7 d的吸光度數(shù)值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；自第3 d起，10%含藥血清組干預(yù)效果也明顯優(yōu)于10%空白血清組，兩組3～7 d的吸光度數(shù)值差異均有明顯差異（P＜0.05）；5%含藥血清組與5%空白血清組比較，差異不明顯（P＞0.05）。表明使用不同濃度血清干預(yù)后，20%含藥血清組細(xì)胞增殖數(shù)量最多，效果最佳。

圖6 BMSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)

表1 各組BMSCs細(xì)胞生長(zhǎng)OD值測(cè)定 （x±s）

4 討 論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種理想的組織工程種子細(xì)胞，在特定條件下可以分化為不同胚層的組織細(xì)胞［16］。用于分離培養(yǎng)BMSCs的常用方法有流式細(xì)胞儀分離法、免疫磁珠分離法、密度梯度離心法和全骨髓貼壁法。與前三種方法比較，全骨髓貼壁法具有操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，很好地保護(hù)了BMSCs生長(zhǎng)的微環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓貼壁法，分離、純化和擴(kuò)增了BMSCs，使用10%L-DMEM培養(yǎng)，經(jīng)換液傳代等方法除去雜細(xì)胞。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞形態(tài)均一呈梭形，生長(zhǎng)曲線呈S形，細(xì)胞周期檢測(cè)證明了其具有較強(qiáng)的分裂增殖能力，符合干細(xì)胞的一般特征。雖然目前對(duì)于大鼠BMSCs缺乏特異性表面標(biāo)記［17-18］，但可參考國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)間充質(zhì)及組織干細(xì)胞委員會(huì)提出的標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)塑料底物的貼附特性；CD29、CD44等陽(yáng)性表達(dá)率≥95%，CD34、CD45等陽(yáng)性表達(dá)率≤2%；具有多向分化潛能。本實(shí)驗(yàn)使用流式細(xì)胞儀對(duì)獲得的P3代大鼠BMSCs的CD29、CD34、CD44、CD45共4個(gè)表面抗原標(biāo)志進(jìn)行了鑒定，并進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化及成脂誘導(dǎo)分化試驗(yàn)，結(jié)果證明采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法獲得的BMSCs顯示出間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，CD29、CD44間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志抗原表達(dá)陽(yáng)性，CD34、CD45造血干細(xì)胞表面標(biāo)志抗原表達(dá)陰性，成骨成脂誘導(dǎo)結(jié)果均為陽(yáng)性。通過(guò)各項(xiàng)試驗(yàn)驗(yàn)證了全骨髓貼壁培養(yǎng)法獲得的大鼠BMSCs具有BMSCs生物特征，其活性好、增殖速度快、細(xì)胞純度高等優(yōu)點(diǎn)，可以為后續(xù)的BMSCs研究提供實(shí)驗(yàn)保障。

研究證實(shí)復(fù)方扶芳藤合劑具有抗氧化、延緩衰老的作用［19-21］，本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度（20%、10%和5%）的復(fù)方扶芳藤合劑含藥血清對(duì)大鼠BMSCs進(jìn)行體外干預(yù)，實(shí)驗(yàn)證明三種濃度均能提升BMSCs的細(xì)胞活性和增殖速率，其中20%濃度的含藥血清作用最為明顯。