加味五虎追風(fēng)散對帕金森病模型大鼠多巴胺能神經(jīng)元氧化應(yīng)激水平的影響

張興博，梁健芬，徐柳炎

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530021）

帕金森?。╬arkinson’s disease，PD）是以黑質(zhì)多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元缺失，胞內(nèi)出現(xiàn)路易小體（lewy bodies，LBs）為主要病理特征的老年常見運(yùn)動障礙疾病。PD的發(fā)生與線粒體功能缺陷、氧化應(yīng)激、免疫異常、細(xì)胞凋亡等多種因素有關(guān)［1-4］，其中氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)是導(dǎo)致DA能神經(jīng)元死亡的主要因素之一。迄今為止，PD的西醫(yī)治療仍以改善癥狀為主，不能阻止疾病進(jìn)展，其治療包括藥物、外科手術(shù)以及處于研究階段的神經(jīng)干細(xì)胞移植、基因治療等，但由于臨床上各種療法均存在不同程度的并發(fā)癥和副作用，嚴(yán)重影響了PD患者的生存質(zhì)量。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)加味五虎追風(fēng)散治療PD具有良好療效，可顯著改善患者的運(yùn)動癥狀，而且與西藥合用還可降低西藥的副作用，從而提高患者生活質(zhì)量。本研究以魚藤酮葵花油乳化液誘導(dǎo)建立PD大鼠模型，觀察加味五虎追風(fēng)散對PD模型大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，以探討其治療PD的作用機(jī)制，為化痰息風(fēng)療法治療PD提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗材料

1.1 動物 健康Wistar大鼠45只，雄性，體質(zhì)量200～230 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK桂2009-0002。

1.2 試藥與試劑 加味五虎追風(fēng)散：由蟬蛻6 g、天南星6 g、天麻12 g、全蝎3 g、僵蠶10 g、大地棕根15 g組成，以上中藥使用江蘇省江陰天江藥業(yè)有限公司的配方顆粒進(jìn)行調(diào)劑，制成湯藥濃度為0.38 g/ml，備用。魚藤酮（Rotenone），貨號R8875，購自Sigma公司，使用時配制濃度為2 mg/ml，每天劑量為2 mg/kg。谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒，貨號：A005-1；谷胱甘肽（glutataione，GSH）試劑盒，貨號：A006-1-1；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒，貨號：A001-1；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒，貨號：A003-1-2；以上試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，編號：ZLI-9045；TH免疫組化試劑一抗、二抗購自武漢博士德生物工程有限公司，貨號：A14419。

2 實(shí)驗方法

2.1 動物分組與給藥 45只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、加味五虎追風(fēng)散組，每組15只。模型組及加味五虎追風(fēng)散組按文獻(xiàn)［5］方法造模，均以2 mg/kg給藥劑量在大鼠頸背部皮下注射2 mg/ml的魚藤酮葵花油乳化液進(jìn)行造模，每日1次，連續(xù)給藥4周。正常組同法注射予相同體積的葵花油乳液，造模結(jié)束后給予藥物干預(yù)，加味五虎追風(fēng)散組每日灌胃給予10 ml/kg加味五虎追風(fēng)散溶液，正常組、模型組每日給予等量的蒸餾水灌胃。參照CHEN等［6］行為學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)，1分：大鼠出現(xiàn)拒捕行為減弱、豎毛、毛色變黃變臟、弓背、主動活動減少；2分：有1分的表現(xiàn)，且主動活動減少明顯、動作遲緩，并有震顫或步態(tài)不穩(wěn)；4分：有2分的表現(xiàn)，且步態(tài)不穩(wěn)，或不能直線行走或步行時間向一側(cè)旋轉(zhuǎn)；6分：向單向斜臥，單側(cè)前肢和/或后肢癱瘓，行走困難、進(jìn)食困難；8分：單側(cè)、前肢和/或后肢完全癱瘓，四肢拘攣，體重大幅度減輕，不能進(jìn)食；10分：瀕臨死亡或死亡。2～6分大鼠為PD造模成功。

2.2 黑質(zhì)區(qū)酪氨酸羥化酶（TH）免疫組化染色 以3.6%水合氯醛10 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，開胸經(jīng)心臟以預(yù)冷生理鹽水常規(guī)灌注后立即斷頭取腦，分離中腦黑質(zhì)組織，4℃下以4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，連續(xù)做冠狀切片，片厚5μm，冰凍切片用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗去聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物（optimal cutting temperature compound，OCT），檸檬酸鈉溶液煮沸抗原修復(fù)，抗體封閉液（1%牛血清白蛋白+0.3%Tritox-100）封閉30min，一抗用小鼠抗TH抗體（1∶10 000）4℃下孵育過夜；二抗分別用生物素化羊抗小鼠及兔抗羊（1∶400）抗體室溫孵育2 h；熒光標(biāo)記卵白素（1∶400）室溫孵育40 min；hoechst染核10 min（1∶5 000）。以上步驟每步后均需PBS清洗3次，每次5 min，75%甘油封片。使用熒光顯微鏡在低倍鏡下計數(shù)TH免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)細(xì)胞的個數(shù)。

2.3 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 大鼠斷頭取腦后分離中腦組織，制備腦組織勻漿液：取腦組織塊0.3～0.5 g在冰生理鹽水溶液中漂洗，除去血液，濾紙拭干，放入小燒杯內(nèi)；燒杯中加入冷的0.86%NaCl溶液0.65 ml，用眼科剪剪碎腦組織塊；剪碎的腦組織混懸液倒入勻漿管中，并加入冰的0.86%NaCl溶液0.3 ml進(jìn)行勻漿，將勻漿液以4 000 r/min離心15 min；將上清液置-20℃冰箱中貯存，備用。氧化應(yīng)激指標(biāo)（GSH、GSH-Px、SOD、MDA）按試劑盒說明書步驟進(jìn)行檢測。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理 統(tǒng)計分析采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行。實(shí)驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，方差齊則組間比較采用單因素方差分析，方差不齊則先將其轉(zhuǎn)換為滿足方差齊性檢驗，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 加味五虎追風(fēng)散對PD模型大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平的影響 見表1。

表1 加味五虎追風(fēng)散對PD模型大鼠腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響 （x±s）

表1結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠中腦黑質(zhì)MDA含量顯著增加（P＜0.01），GSH含量、GSH-Px和SOD活性顯著減少（P＜0.01）；與模型組比較，加味五虎追風(fēng)散組MDA含量顯著減少（P＜0.05），GSH含量、GSH-Px和SOD活性明顯增加（P＜0.05）。

3.2 各組大鼠中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目的變化 見表2。

表2 各組大鼠中腦黑質(zhì)部位TH免疫陽性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目比較 （個，x±s）

表2結(jié)果顯示，正常組大鼠中腦黑質(zhì)致密區(qū)TH免疫陽性細(xì)胞表達(dá)較多，模型組大鼠中腦黑質(zhì)致密區(qū)TH免疫陽性細(xì)胞表達(dá)較正常組明顯降低（P＜0.01）；經(jīng)治療，加味五虎追風(fēng)散組大鼠黑質(zhì)致密區(qū)TH免疫陽性細(xì)胞數(shù)目顯著高于模型組（P＜0.01）。

4 討論

PD以肢體震顫、肌強(qiáng)直、隨意運(yùn)動障礙為主要臨床表現(xiàn)，屬中醫(yī)學(xué)“顫癥”范疇，本病病位主要在腦，著于筋脈，關(guān)乎五臟，證屬本虛標(biāo)實(shí)，腎虛為本病發(fā)病之根本，又涉及到肝、脾等臟腑；標(biāo)實(shí)為“內(nèi)風(fēng)”“瘀血”“痰濁”而致經(jīng)脈肢體失控，其中虛以肝腎陰虛為主；實(shí)以痰濁血瘀為要［7］。其中瘀既是病理產(chǎn)物，更是致病因素，而且在PD的不同階段均伴隨有不同程度的血瘀阻絡(luò)癥狀［8］。加味五虎追風(fēng)散治療PD具有良好療效，方中壯藥大地棕根補(bǔ)腎活血、生髓榮腦，恰對病機(jī)，故為君藥；全蝎長于活血，僵蠶功在化痰，天麻善于息風(fēng)，三者相配共起活血通絡(luò)、化痰息風(fēng)之功，共為臣藥；蟬蛻祛風(fēng)止痙，天南星解痙止顫，二者共為佐藥；諸藥相配，共奏補(bǔ)腎填精、化瘀通絡(luò)、祛痰息風(fēng)之功。

魚藤酮是豆科藤本植物魚藤根部的一種活性成分，其作為廣譜殺蟲劑和魚毒已被長時間使用。大量流行病學(xué)及動物實(shí)驗表明魚藤酮有選擇性的多巴胺神經(jīng)元毒性，可以使鼠科動物產(chǎn)生與PD相似的癥狀，還因其脂溶性強(qiáng)，能很好地穿透血腦屏障［9］，故可用于PD模型大鼠制作。且魚藤酮誘導(dǎo)PD大鼠的成模率較高，在病理、生化、致病機(jī)制、行為學(xué)等方面均能較好地模擬PD相關(guān)特征［10］，氧化應(yīng)激損傷是魚藤酮導(dǎo)致大鼠腦內(nèi)DA能神經(jīng)元損害的主要機(jī)制［11］。魚藤酮可與線粒體復(fù)合物1結(jié)合并抑制其活性，阻斷細(xì)胞呼吸鏈的遞氫功能和氧化磷酸化過程，產(chǎn)生自由基和凋亡誘發(fā)因子，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒作用。

PD是以黑質(zhì)紋狀體DA能神經(jīng)元缺失為主要特征的疾病，其發(fā)病與氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙及α-突觸核蛋白異常聚集有關(guān)［12］，其中氧化應(yīng)激被認(rèn)為是PD黑質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞死亡病理機(jī)制的主要因素［13］，在PD發(fā)病過程中，當(dāng)體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生與清除失平衡后可導(dǎo)致活性氧及氧自由基在體內(nèi)堆積，清除自由基是減少黑質(zhì)DA能神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要方式，而體內(nèi)清除自由基的酶系統(tǒng)主要包括SOD、GSH-Px及過氧化氫酶等抗氧化酶［14］。GSH為一種低分子自由基清除劑，可清除H2O2、O2-，并維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，使暴露于氧化環(huán)境的組織免受自由基損害［15-16］，其含量的多少是衡量機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化H2O2分解的酶，可特異催化GSH對H2O2的還原反應(yīng)，對細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整具有重要保護(hù)作用。而SOD與MDA是反映氧化應(yīng)激的兩個指標(biāo)，SOD通過歧化反映清除自由基，對氧化損傷起保護(hù)作用，其活力的高低反映了機(jī)體清除自由基的能力［17］，被看作是氧化應(yīng)激的直接指示劑；MDA是受到氧自由基攻擊后形成的一種最終代謝產(chǎn)物，可間接反映組織受自由基攻擊的嚴(yán)重程度［18］。本實(shí)驗結(jié)果提示加味五虎追風(fēng)散能夠明顯增加PD大鼠DA神經(jīng)元GSH的含量，增加GSH-Px和SOD活性，降低丙二醛的含量，減少自由基的生成，增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力，從而減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)對機(jī)體的損害，以達(dá)到治療效果。

本實(shí)驗研究表明，魚藤酮誘導(dǎo)的PD模型大鼠中腦黑質(zhì)MDA含量顯著增加，GSH含量、GSH-Px和SOD活性顯著減少，黑質(zhì)TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，表明PD動物模型造模成功。經(jīng)加味五虎追風(fēng)散組干預(yù)后，PD模型大鼠腦組織中GSH-Px、SOD活性和GSH的含量明顯增加，MDA的含量明顯減少，黑質(zhì)TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯增加，表明加味五虎追風(fēng)散對PD模型大鼠DA能神經(jīng)元具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與加味五虎追風(fēng)散減輕魚藤酮所致的氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。隨著對氧化應(yīng)激介導(dǎo)的PD發(fā)病機(jī)制的深入研究，對PD抗氧化應(yīng)激的治療必將得到更多的認(rèn)識和發(fā)展，也為臨床治療和預(yù)防帕金森病提供新的實(shí)驗依據(jù)。