蛭龍活血通瘀膠囊對(duì)腦出血大鼠血清炎性因子的影響

王 蔚，杜 淵，王洪連，孫長(zhǎng)偵，王 麗，白 雪，楊思進(jìn)

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000）

腦出血是內(nèi)科臨床常見的危急重癥，發(fā)病急，轉(zhuǎn)變快，急性期嚴(yán)重威脅患者生命安全，患病后又往往留有不同程度的后遺癥，給患者的生活質(zhì)量造成不良影響，由此帶來(lái)巨大的社會(huì)和家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。研究表明，諸多炎性因子參與了腦出血的發(fā)病過(guò)程，且與疾病的預(yù)后密切相關(guān)［1-2］。腦出血屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)病”范疇，蛭龍活血通瘀膠囊是我院研制的院內(nèi)中成藥復(fù)方制劑，該藥廣泛用于中風(fēng)患者的防治，取得了滿意療效［3］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察蛭龍活血通瘀膠囊對(duì)腦出血大鼠腦組織病理形態(tài)和血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1（IL-1）及白細(xì)胞介素6（IL-6）的影響，探討該藥防治腦出血的有效作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量260～300 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SCXK（川）2015-030。飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，環(huán)境溫度22±2℃，濕度30%～40%，普通大鼠飼料喂養(yǎng)，自由攝食及飲水。

1.2 藥物 蛭龍活血通瘀膠囊由黃芪、水蛭、地龍、大血藤、桂枝等藥物組成，規(guī)格為每粒0.4 g（相當(dāng)于含生藥2.625 g），由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)20180216；鹽酸法舒地爾注射液（規(guī)格為每支2 ml∶30 mg，批號(hào)180101，成都菀東藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）；TNF-α、IL-1及IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒均為上海優(yōu)選生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 儀器 大鼠腦立體定位儀（北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司）；ATPB457A小動(dòng)物電子稱（深圳安普特電子科技有限公司）；BSA224S精密電子天平；cx21FS1光學(xué)顯微照相系統(tǒng)（日本Olympus公司）；國(guó)產(chǎn)BMZ-3型自動(dòng)組織包埋機(jī)（湖北安立信醫(yī)療實(shí)業(yè)有限公司）；德國(guó)Leica石蠟切片機(jī)（北京科譽(yù)興業(yè)科技發(fā)展有限公司）；infinite F50酶標(biāo)儀（奧地利Tecan）；TDZ5-WS醫(yī)用離心機(jī)（長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

2 方 法

2.1 分組與造模 將40只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、腦出血模型組、蛭龍活血通瘀組、鹽酸法舒地爾組，每組10只。實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)前稱重，按照0.4 g/kg給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，剪斷鼠尾取自體血50μl。將大鼠以俯臥位固定于立體定位儀上，頭部進(jìn)行備皮消毒以暴露手術(shù)區(qū)域，縱行切開頭皮正中約10 mm，用30%雙氧水腐蝕骨膜，暴露前囟和冠狀縫，參照ROSENBER［4］的方法，根據(jù)《腦立體定位圖譜》［5］定位尾殼核區(qū)域，調(diào)整微量進(jìn)樣器使針尖垂直于矢狀縫右側(cè)旁開3.0 mm，前囟前0.2 mm處，用三棱針在針尖下方鉆孔，深度達(dá)硬腦膜表面，以顱骨外板為零點(diǎn)進(jìn)針6.0 mm，以5μl/min緩慢勻速將血注入腦內(nèi)，留針約15 min后緩慢退針，骨蠟封閉鉆孔，縫合頭皮并常規(guī)消毒。假手術(shù)組術(shù)中只進(jìn)針，不注血。采用ZEA LONGA 的“5分制法”［6］進(jìn)行術(shù)后大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分，造模成功的大鼠（評(píng)分為1～3分）納入實(shí)驗(yàn)。

2.2 給藥 蛭龍活血通瘀組采用灌胃給藥，每日1.2 g/kg（按成人60 kg用量為3.6 g/d計(jì)算，大鼠為人體用量20倍），灌胃體積為3 ml；鹽酸法舒地爾組采用腹腔注射給藥，每日12 mg/kg（按成人60 kg用量為90 mg/d計(jì)算）［7］；假手術(shù)組和腦出血模型組均給予等體積的生理鹽水灌胃。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 腦組織病理形態(tài) 各組大鼠術(shù)后3 d給予深度麻醉，用0.9%生理鹽水、4%多聚甲醛依次行心臟灌注，快速剪斷鼠頭，剝?nèi)〈竽X，冠狀位切取針孔處含血腫的腦組織，浸泡于4%多聚甲醛中，固定24 h后給予由低到高梯度的乙醇脫水，二甲苯透明，用石蠟包埋制成蠟塊，用切片機(jī)切片，約為5μm厚度，展片、撈片、烤片，經(jīng)二甲苯脫蠟，依次由高到低梯度乙醇浸泡，蒸餾水洗，蘇木青染色后水洗，鹽酸乙醇浸泡后水洗，弱氨水返藍(lán)，伊紅染色后水洗，再由低到高梯度乙醇脫水，二甲苯透明，干燥后用中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察血腫周圍腦組織病理學(xué)改變。

2.3.2 血清中TNF-α、IL-1及IL-6的含量 各組大鼠術(shù)后3 d給予深度麻醉，仰臥位放在操作臺(tái)上，剪開胸腔暴露心臟，用采血針經(jīng)心臟采血3～5 ml于采血管中，靜置2 h后，放入離心機(jī)，以3 000 r/min離心10 min，然后分離血清置于-20℃冰箱存放備檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）對(duì)大鼠血清TNF-α、IL-1及IL-6進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照各試劑盒使用說(shuō)明書的要求完成。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析（One-way ANOVA），LSD及Dunnett法作多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組血腫周圍腦組織HE染色比較 假手術(shù)組：血腫周圍腦組織結(jié)構(gòu)清晰、完整，神經(jīng)細(xì)胞胞體規(guī)律排列，胞漿染色均勻，無(wú)明顯腫脹；腦出血模型組：血腫周圍腦組織呈明顯水腫，細(xì)胞核固縮，廣泛液化，細(xì)胞間隙結(jié)構(gòu)紊亂，血管周圍的空隙增大，組織結(jié)構(gòu)疏松，局部有出血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及膠質(zhì)細(xì)胞增生；與腦出血模型組比較，蛭龍活血通瘀組和鹽酸法舒地爾組的血腫周圍腦組織水腫程度明顯減輕，細(xì)胞層次也較清楚，神經(jīng)細(xì)胞液化、壞死等均有所減輕，病理形態(tài)得到明顯改善。見圖1。

圖1 各組血腫周圍腦組織HE染色比較（×400）

3.2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1及IL-6的含量比較 見表1。與假手術(shù)組比較，腦出血模型組大鼠血清TNF-α、IL-1及IL-6的含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與腦出血模型組比較，蛭龍活血通瘀組、鹽酸法舒地爾組大鼠血清TNF-α、IL-1及IL-6的含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；蛭龍活血通瘀組和鹽酸法舒地爾組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1及IL-6的含量比較 （pg/ml，x±s）

4 討 論

腦出血后造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷和功能障礙的機(jī)制尚未完全明確，但血腫周圍腦水腫形成是影響腦出血后病情轉(zhuǎn)歸和預(yù)后的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而炎性反應(yīng)在其中產(chǎn)生了重要作用。喻明等［8］研究表明，腦出血后機(jī)體的適度炎性反應(yīng)對(duì)血腫吸收和壞死組織清除具有一定的作用，而一旦炎性反應(yīng)過(guò)度則會(huì)導(dǎo)致并加重腦水腫，影響出血區(qū)的腦血流量，增加血-腦脊液屏障通透性，使其結(jié)構(gòu)破壞進(jìn)而導(dǎo)致腦組織一系列繼發(fā)性損傷。白細(xì)胞在病區(qū)局部聚集和黏附是炎性反應(yīng)的重要標(biāo)志，其中包括中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，由此釋放多種炎性因子，如TNF-α、IL-6等。這些由免疫細(xì)胞產(chǎn)生的小分子多肽具有很高的免疫活性，能介導(dǎo)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、機(jī)體代謝和炎性反應(yīng)。研究證實(shí)，炎性因子在腦出血病理生理機(jī)制中具有重要作用［9］，在急性腦出血中能夠激活、介導(dǎo)腦組織的繼發(fā)性損傷。

炎性因子中TNF-α屬于前炎性因子，是機(jī)體炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中由小膠質(zhì)細(xì)胞及星形細(xì)胞分泌，通過(guò)激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管收縮，影響血-腦脊液屏障通透性，并可使小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞變形腫脹，釋放大量氧自由基及興奮性氨基酸，與其他炎性因子如IL-1、IL-6協(xié)同作用，加重腦出血后腦水腫的發(fā)生［10］。IL-1是一類具有廣泛作用的多肽，其與細(xì)胞膜上IL-1受體相結(jié)合，通過(guò)G蛋白發(fā)揮作用。在腦組織中，IL-1主要參與T和B淋巴細(xì)胞的增殖和分化，刺激造血干細(xì)胞分化，參與炎性反應(yīng),亦是多形核白細(xì)胞的直接及間接趨化因子，引起血腫周圍聚集多形核細(xì)胞，炎癥介質(zhì)激活，誘導(dǎo)黏附分子合成及釋放，使腦組織損傷加重。IL-6是一種分子量約為26 KD的細(xì)胞因子，在腦組織受到損傷時(shí)，可由小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生，同時(shí)周圍血中分泌IL-6的白細(xì)胞數(shù)量也增多，從而使血清中IL-6含量升高，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成神經(jīng)毒性作用［11］。研究報(bào)道，腦出血患者在起病后3～4 d血腫周圍腦水腫的程度與起病24 h內(nèi)TNF-α的含量相關(guān)，腦出血患者血漿中TNF-α與IL-6水平于發(fā)病后3 d達(dá)到高峰,這與腦組織水腫及炎性反應(yīng)最嚴(yán)重的時(shí)期相吻合,并且隨著病程的延長(zhǎng)，腦水腫得到改善后TNF-α和IL-6的水平也有所下降［12-13］。

Ras同源基因/Rho相關(guān)螺旋卷曲蛋白激酶（Ras homolog gene/a Rho-associated coiled coil-forming protein kinase，Rho/ROCK）作為機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種信號(hào)傳遞通路，能夠介導(dǎo)腦出血后炎癥反應(yīng)，影響血腦屏障通透性，與腦水腫密切相關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致腦組織損傷。Rho激酶抑制劑通過(guò)抑制Rho激酶活性，可抑制炎性反應(yīng)，抗血管痙攣及促進(jìn)神經(jīng)損傷后修復(fù)，具有神經(jīng)保護(hù)作用，通過(guò)抑制該通路的激活，可抑制血管收縮和炎性因子的釋放［14］。鹽酸法舒地爾是一種新型的Rho激酶抑制劑，也是目前唯一一種應(yīng)用于臨床的Rho激酶抑制劑，研究顯示，它可通過(guò)抑制磷酸化過(guò)程起到抑制炎性細(xì)胞遷移、浸潤(rùn)，減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)損傷，并可保護(hù)血-腦脊液屏障，減輕腦出血后腦水腫，促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)功能修復(fù)［15-17］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，鹽酸法舒地爾可降低大鼠血清TNF-α、IL-6水平，減輕腦出血后的腦血管痙攣［18］。

蛭龍活血通瘀膠囊是我院常用的院內(nèi)制劑，被廣泛應(yīng)用臨床心腦血管疾病的治療中，該藥全方具有益氣祛痰、活血化瘀、溫經(jīng)通絡(luò)、養(yǎng)血祛風(fēng)之效［19］。前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明［20-21］，該藥能改善腦出血大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分，降低腦含水量，能明顯抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）活化，促進(jìn)蛋白酶激活受體-1（PAR-1）的表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對(duì)腦出血大鼠具有腦保護(hù)作用。為進(jìn)一步探索蛭龍活血通瘀膠囊防治腦出血的作用機(jī)制，本研究以自體血制備腦出血實(shí)驗(yàn)大鼠模型，以ROCK抑制劑鹽酸法舒地爾為陽(yáng)性對(duì)照藥，觀察蛭龍活血通瘀膠囊對(duì)大鼠腦出血后血清炎性因子TNF-α、IL-1及IL-6水平的影響。結(jié)果表明，蛭龍活血通瘀膠囊能明顯改善腦出血大鼠腦組織病血腫周圍病理形態(tài)，可能與顯著降低腦出血大鼠血清TNF-α、IL-1及IL-6炎性因子的水平有關(guān)，但其機(jī)制是否與鹽酸法舒地爾通過(guò)抑制ROCK通路調(diào)節(jié)炎性因子的釋放相似，尚待進(jìn)一步探索。