多種分子檢測方法在精確診斷2例罕見α-珠蛋白生成障礙性貧血中的應用*

姚翠澤，王繼成，秦丹卿，杜 麗，劉 玲，袁騰龍，梁 杰，黃華潔

(廣東省婦幼保健院醫(yī)學遺傳中心，廣東廣州 511442)

珠蛋白生成障礙性貧血常見于我國南方地區(qū)，是一類因珠蛋白合成障礙所致的遺傳性溶血性疾病，主要分為α-珠蛋白生成障礙性貧血和β-珠蛋白生成障礙性貧血兩類。α-珠蛋白生成障礙性貧血的分子基礎是α2或α1珠蛋白基因發(fā)生缺失或點突變致使α-珠蛋白產量下降，其中缺失型約占80%～90%[1-2]。其缺失范圍從幾kb到整個α-珠蛋白基因簇及上游調控區(qū)域的缺失。中國人群中的缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血主要為--SEA、-α3.7、-α4.2三種常見類型[3]。目前，常見的珠蛋白生成障礙性貧血缺失類型出生缺陷防控工作效果顯著，但值得注意的是，近年來，我國陸續(xù)有多種罕見缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血的研究報道[4-5]。這些罕見缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血如果合并其他常見的α-珠蛋白基因突變可導致中重型α-珠蛋白生成障礙性貧血，所以在珠蛋白生成障礙性貧血高危地區(qū)人群中，重視此類罕見珠蛋白生成障礙性貧血的篩查和檢測對更全面地預防珠蛋白生成障礙性貧血出生缺陷工作尤為重要。目前國內臨床實驗室使用跨越斷裂點PCR技術的商業(yè)化試劑盒只能檢測上述中國人3種常見缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血，對于罕見缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血的基因檢測還需要多種分子檢測方法的應用。本研究通過對2例不同類型的罕見缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血病例的基因檢測，為多種分子檢測方法在精確診斷罕見α-珠蛋白生成障礙性貧血中的應用提供新的思路，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 2例均就診于本院產前診斷科。病例1：男，24歲，血液學表現(xiàn)異常，常規(guī)珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測未見異常。其配偶孕21+1周，常規(guī)珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測為--SEA/αα，胎兒超聲診斷為胎兒水腫綜合征。病例2：女，28歲，孕29+1周，孕期順利，無輸血史。常規(guī)珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測為--SEA純合突變，與血液學表現(xiàn)不一致。

1.2方法

1.2.1血液學表型分析 乙二胺四乙酸抗凝管采集所有病例外周血2 mL，使用邁瑞2000全自動血液分析儀進行紅細胞參數(shù)分析，包括血紅蛋白(Hb)、平均紅細胞容積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白量(MCH)、紅細胞體積分布變異系數(shù)(RDW)等，采用快速電泳分析系統(tǒng)Sebia capillary進行各種Hb組分分析，主要包括HbA和HbA2。

1.2.2常規(guī)珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測 采用磁珠法提取患者外周血基因組DNA(試劑盒購自中國廈門致善生物公司)；應用跨越斷裂點PCR法檢測常見的3種α-珠蛋白生成障礙性貧血大片段缺失(-α3.7/、-α4.2/、--SEA/)，以及反向斑點雜交法檢測3種α-珠蛋白生成障礙性貧血點突變(αQSα/、αCSα/、αWSα/)及17種β-珠蛋白生成障礙性貧血點突變(CD41-42、IVS-Ⅱ-654、-29、-28、CD71-72、CD17、CD43、CD26、CD27-28、CD31、-32、-30、CD14-15、IVS-Ⅰ-1、IVS-Ⅰ-5、Int、Cap)，根據電泳條帶大小和膜條檢測位點出現(xiàn)信號有無來確定缺失類型或點突變類型(試劑盒購自中國深圳亞能生物技術有限公司)。

1.2.3罕見α-珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測 將提取好的患者DNA使用試劑盒提供的引物進行擴增，擴增產物經過瓊脂糖凝膠電泳，檢測--THAI、-α27.6、-α21.93種缺失型突變；多重連接依賴性探針擴增(MLPA)用于檢測患者珠蛋白生成障礙性貧血α基因簇的拷貝數(shù)變化，并應用Coffalyser軟件進行數(shù)據分析；將患者DNA進行酶切、連接、擴增、純化、片段化、標記及芯片雜交，使用染色體微陣列(CMA)Affymetrix CytoScan 750K技術分析α基因簇所在的16號染色體短臂區(qū)域的DNA拷貝數(shù)目的變化；α-珠蛋白基因測序用于檢測α-珠蛋白基因上其他的點突變，設計引物分別擴增α1和α2珠蛋白基因，PCR產物送中國上海生工生物有限公司進行雙向測序。引物序列如下：HBA1 5′-TGG AGG GTG GAG ACG TCC TG-3′和5′-TCC ATC CCC TCC TCC CGC CCT GCC TTT TC-3′；HBA2 5′-GAT GGG CGG GAG TGG AGT-3′和5′-GGA CAG GGG ATG GTT CAG C-3′，擴增產物大小分別為1 181 bp和1 241 bp。

2 結 果

2.1血液學結果 2例病例均為小細胞低色素性貧血，Hb電泳提示HbA2的比例均不同程度的降低，符合α-珠蛋白生成障礙性貧血的血液學表現(xiàn)，見表1。

表1 2例血液學參數(shù)和常規(guī)α-珠蛋白生成障礙性貧血基因結果

注:參數(shù)參考值MCV 82～100 fL；MCH 27～34 pg；Hb 130～175 g/L(男)，115～150 g/L(女)；RDW 11.5%～14.5%；HbA2 2.7%～3.5%；HbA 94.50%～97.35%。

2.2常規(guī)珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測結果 病例1常規(guī)珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測未檢出異常突變。病例2常規(guī)α-珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測的瓊脂糖電泳只見一條--SEA條帶，無正常對照條帶且未檢測到αQSα/、αCSα/、αWSα/這3種突變點及其正常對照點。2例病例均未檢測到17種β-珠蛋白生成障礙性貧血點突變。見圖1A。

2.3罕見α-珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測結果 使用--THAI、-α27.6、-α21.9試劑盒檢測罕見缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血，病例1結果為陰性；病例2為-α27.6/缺失，再結合常規(guī)基因檢測顯示的--SEA/，其初步確認其基因型應為--SEA/-α27.6。基因的測序顯示病例1的HBA1結果正常；而病例2的HBA1基因測序結果正常，但無法擴增出HBA2基因目的片段，提示HBA2缺失或引物區(qū)域存在突變。MLPA結果顯示病例1在探針POLR3K exon3、HBA-HS40 178、HBA-HS40 382、HBZ region up 364、HBZ region up信號均降低約50%，即拷貝數(shù)為1，提示區(qū)域從HBZ上游3.5 kb至α-珠蛋白基因簇上游的POLR3K基因至少有102.3 kb的雜合缺失。而病例2的MLPA結果顯示為HBM區(qū)域上游至HBA1 up337拷貝數(shù)為零，即純合缺失，而HBZ上游至HBZP1下游及HBA1up 226至HBQ1基因處拷貝數(shù)為1，即雜合缺失。由于(--SEA/)的缺失區(qū)域為HBM區(qū)域上游至HBQ1基因處，因此推測另一染色體缺失區(qū)域為26.4～32.4 kb。見圖1B。

注:圖A表示病例2常規(guī)缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血電泳圖；圖B表示罕見缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血電泳圖；αα/αα表示正常對照；M表示DNA標準帶。

圖1 跨越斷裂點PCR法電泳圖

因探針數(shù)量的限制，MLPA不能確定病例1的缺失范圍，故進行CMA的檢測。結果顯示病例1為16p13.3(85880-197064)×1，即長度約為111 kb的雜合缺失，缺失區(qū)域包含的基因包括POLR3K、SNRNP25、RHBDF1、MPG、NPRL3，與MLPA結果大體一致，同樣包含了α-珠蛋白基因簇的調控區(qū)域HS40等。見圖2。

注:A表示病例1MLPA結果分析圖；B表示病例2MLPA結果分析圖；C表示病例1CMA結果分析圖。

圖2 兩病例MLPA結果和病例1CMA結果分析圖

3 討 論

本研究2病例珠蛋白生成障礙性貧血篩查Hb電泳結果均提示為α-珠蛋白生成障礙性貧血，病例1常規(guī)珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測未檢出異常，病例2則檢測到基因型與血液學表型不符，均懷疑存在其他罕見缺失，因此在常規(guī)基因檢測的基礎上采用多種分子檢測方法進一步精確診斷。應用實驗室已有的罕見缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血試劑盒(檢測--THAI、-α27.6、-α21.9)和基因測序的方法檢測病例1，檢測結果均未發(fā)現(xiàn)異常，于是采用MLPA檢測整個α-珠蛋白基因簇及其上下游調控序列的拷貝數(shù)的變化，結果顯示α-珠蛋白基因簇上游的POLR3K基因至ζ基因上游區(qū)域雜合缺失，缺失片段至少為102.3 kb。因MLPA探針數(shù)量較少，為了明確具體缺失范圍，同時結合CMA技術進一步驗證，結果與MLPA相符，同樣為包含HS-40的POLR3K基因至ζ基因的上游區(qū)域缺失。目前已有研究證明，調控區(qū)域HS-40的缺失會使α-珠蛋白基因表達水平低于正常表達水平的3%，導致α0-珠蛋白生成障礙性貧血，與東南亞型缺失(--SEA/)的血液學表型相同[6-9]。病例2常規(guī)跨越斷裂點PCR法顯示僅有1條SEA條帶而沒有正常條帶(α2)，同時基因測序結果顯示HBA1測序無異常，而HBA2片段無法擴增獲得，考慮到常規(guī)珠蛋白生成障礙性貧血顯示患者攜有(--SEA/)缺失采用MLPA確定缺失的大致范圍時，MLPA結果在計算(--SEA/)缺失的信號后推測出另一染色體缺失大小為26.4～32.4 kb，該結果與后續(xù)使用罕見缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血試劑盒驗證檢出的(-27.6/)基因型一致，結合常規(guī)和罕見α-珠蛋白生成障礙性貧血的檢測結果，可診斷病例2的基因型為(--SEA/-α27.6)。罕見缺失(-α27.6/)的主要缺失范圍包括ζ-Ψζ-Ψα2-Ψα1-α2(NG_000006.1:g.9079_36718del27640)，僅有1個α1基因發(fā)揮功能，為α+-珠蛋白生成障礙性貧血，其雜合子表現(xiàn)正常的Hb水平，MCV、MCH等參數(shù)也多接近正常范圍的最低值[10-11]，其人群攜帶率仍未有相關報道，但基于其雜合子無臨床癥狀，有理由懷疑這種缺失的攜帶率比筆者認為的要高。

目前已報道的α-珠蛋白基因簇(NG_000006.1)缺失大約有50種(http://globin.bx.psu.edu/)，在中國南方，攜帶率最高為(--SEA/)，占人群4.1%～8.7%[12-13]。本研究中的2例罕見缺失為包含HS-40的POLR3K基因至ζ基因的上游區(qū)域缺失和(-α27.6/)缺失，這些罕見型珠蛋白生成障礙性貧血如果使用珠蛋白生成障礙性貧血基因的常規(guī)方法檢測必然導致其漏診，且HS-40區(qū)域缺失若合并中國南方攜帶率最高的(--SEA/)缺失時，其后代有25%的概率成為Hb Bart′s水腫胎，同時也可發(fā)生孕婦早產、羊水過多、子癇等嚴重并發(fā)癥[14]。而罕見缺失(-α27.6/)如果合并(--SEA/)則可導致中間型α-珠蛋白生成障礙性貧血患兒的出生，同時筆者也注意到這種基因型的Hb電泳未見H帶，容易造成漏檢。對此LING等[15]推測是過剩的β-珠蛋白鏈發(fā)生了不同程度的降解導致。因此，采用多種方法精確診斷罕見α-珠蛋白生成障礙性貧血非常重要。

由于臨床上對中重型珠蛋白生成障礙性貧血的治療主要依靠終身輸血和除鐵治療及造血干細胞的移植，其治療費用昂貴，家庭經濟負擔沉重，對兒童生長發(fā)育影響巨大，珠蛋白生成障礙性貧血患兒出生缺陷“重在預防”。因此，在臨床產前遺傳咨詢中，對于常規(guī)珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測的基因型與血液學表型結果不相符的患者，強烈建議進一步采用多種方法進行精確診斷突變類型，避免夫婦罕見珠蛋白生成障礙性貧血引起中重型珠蛋白生成障礙性貧血患兒的出生。

罕見珠蛋白生成障礙性貧血基因型的精確診斷有助于更加全面、有效地預防中重型珠蛋白生成障礙性貧血患兒的出生，對遺傳咨詢和產前診斷具有重要指導作用。本研究將為罕見α-珠蛋白生成障礙性貧血的精確診斷提供新思路，為預防出生缺陷工作提供有效的臨床診斷基礎。