磷酸甘油酸激酶1與乳腺浸潤癌患者預(yù)后的相關(guān)性及潛在機制探索

郭 然，侯世科，陳孝儲

乳腺癌是近年來女性中發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，在我國每年新發(fā)的病例約有27.9萬，并以2%的速度逐年增長[1]。盡管當(dāng)前的一系列綜合治療措施使早期乳腺癌患者的生存率大幅度提高，但仍有約30%的患者會在遠(yuǎn)期出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[2]。因此進一步尋找能夠提示乳腺癌患者預(yù)后指標(biāo)并完善其治療策略，對于提高該類患者的治療效果尤為重要。磷酸甘油酸激酶1 (phosphoglycerate kinase 1, PGK1) 是糖酵解過程中一種重要的催化酶，有研究表明，其在肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、腎細(xì)胞癌等多種癌癥中均會異常表達，并調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[3-6]。但PGK1在乳腺癌患者中能否作為一種提示患者預(yù)后的指標(biāo)仍有待進一步探索，其作用機制也有待更為深入的挖掘，故本研究擬通過公開的癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫和生物信息學(xué)方法分析PGK1對乳腺浸潤癌患者腫瘤分期及生存率的影響，以及潛在的相關(guān)機制，從而為乳腺浸潤癌的預(yù)后判斷和治療指導(dǎo)方面提供一定的參考。

1 資料和方法

1.1生存曲線分析 從包含TCGA數(shù)據(jù)網(wǎng)站(http://www.linkedomics.org)下載乳腺浸潤癌患者數(shù)據(jù)集TCGA_BRCA RNASeq和TCGA_BRCA Clinical，篩選出同時包含基因表達數(shù)據(jù)和生存時間數(shù)據(jù)信息的患者共1051例。按照PGK1基因的表達水平由高到低進行排序，將排在前50%的患者設(shè)為高表達組(n=526)，其余患者設(shè)為低表達組(n=525)，并應(yīng)用GraphPad Prism 軟件繪制2組患者的生存曲線。

1.2PGK1在不同腫瘤分期中的比較 篩選出同時包含腫瘤分期信息和基因表達水平的患者數(shù)據(jù)，根據(jù)腫瘤的TNM分期，將患者分別歸入相應(yīng)的各組，比較不同分期乳腺浸潤癌患者的PGK1基因相對表達水平。

1.3PGK1相關(guān)基因篩選 利用Omisc軟件，將患者檢測的所有基因表達水平逐一與PGK1表達水平進行相關(guān)性檢驗，根據(jù)相關(guān)系數(shù)選取與PGK1表達相關(guān)性最高的50個基因，并繪制基因熱圖[7]。

1.4富集分析 將篩選出的50個相關(guān)基因?qū)隨tring在線數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)進行基因本體(gene ontology, GO)富集分析(生物學(xué)過程、 細(xì)胞組成、分子功能)和京都基因與基因組百科全書通路(the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Pathway, KEGG 通路)富集分析。

2 結(jié)果

2.1PGK1表達差異對生存時間的影響 PGK1高表達組乳腺浸潤癌患者的中位生存時間低于PGK1低表達組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 2組乳腺浸潤癌患者生存曲線比較

PGK1為磷酸甘油酸激酶1

2.2不同分期乳腺浸潤癌患者PGK1表達水平比較 ①根據(jù)臨床分期將乳腺浸潤癌患者分組，則4組間PGK1表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.079，P<0.01)。Ⅰ期患者PGK1表達水平顯著低于Ⅱ～Ⅳ期的患者，IV期患者PGK1表達水平顯著高于Ⅰ～Ⅲ期的患者(P<0.05)。②根據(jù)病理學(xué)T分期，4組間PGK1表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.373，P<0.01)，T2期患者PGK1表達水平顯著高于T1期和T3期患者，T4期患者PGK1的表達水平均高于其他3期的患者(P<0.05)。根據(jù)N分期4組間PGK1表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.860，P=0.461)。根據(jù)M分期，M1期患者PGK1表達水平高于M0期患者(t=-2.77，P=0.006)。見圖2。

圖2 不同分期乳腺浸潤癌患者PGK1表達水平比較

PGK1為磷酸甘油酸激酶1

2.3PGK1相關(guān)基因的篩選 在檢測的20 154個基因中，有11 872個基因與PGK1存在相關(guān)性(P<0.05)，見圖3A。選取與PGK1表達相關(guān)系數(shù)最高的前50個基因，并繪制基因熱圖，見圖3B。其中細(xì)胞死亡誘導(dǎo)DFFA樣效應(yīng)因子c(Cell death-inducing DFFA-like effector c， CIDEC)和水通道蛋白7(Aquaporin-7， AQP7)與PGK1表達水平的相關(guān)系數(shù)最高(分別為r=0.8220，P<0.05；r=0.8216，P<0.05)。見圖3C和3D。

2.4GO富集分析和KEGG通路富集分析 對篩選的50個基因進行GO富集分析可見，主要涉及的生物學(xué)過程包括代謝過程、對刺激的反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)、多細(xì)胞組織過程和細(xì)胞通訊；主要涉及的細(xì)胞組分為膜、細(xì)胞外空間、囊、細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)膜系統(tǒng)；主要涉及的分子功能為蛋白質(zhì)結(jié)合、離子結(jié)合、轉(zhuǎn)運活動、水解酶活性和脂質(zhì)結(jié)合。見圖4。KEGG通路富集分析可見主要涉及的信號通路為PPAR信號通路、調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞中的脂肪分解、AMPK信號通路、脂肪細(xì)胞因子信號通路和酪氨酸代謝通路。

3 討論

PGK1由417個氨基酸組成，是糖酵解途徑中的一種重要催化酶，可催化 1，3-二磷酸甘油酸和ADP 生成3-磷酸甘油酸和1分子ATP，為生理過程提供所需能量[8]。近年來研究發(fā)現(xiàn),PGK1還在多種腫瘤中高表達并發(fā)揮調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移的作用。Wang等[9]在前列腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，PGK1高表達可通過抑制黏附相關(guān)蛋白E-鈣黏素的表達，從而降低細(xì)胞之間的黏附，增加腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。Xie等[10]發(fā)現(xiàn)PGK1在肝細(xì)胞癌組織中存在顯著過表達，且PGK1的過表達與肝細(xì)胞癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。抑制PGK1表達后可顯著降低癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，但是在乳腺浸潤癌中PGK1是否同樣發(fā)揮重要作用卻鮮有報道。本研究通過對公開數(shù)據(jù)庫的挖掘發(fā)現(xiàn)，PGK1高表達的乳腺浸潤癌患者遠(yuǎn)期生存率更低，且病理分期越高的患者，PGK1表達水平越高，這表明PGK1可提示乳腺浸潤癌患者預(yù)后不良。與Fu等[11]研究結(jié)果類似，該研究發(fā)現(xiàn)敲低PGK1表達可通過影響缺氧誘導(dǎo)因子1α的功能，逆轉(zhuǎn)乳腺浸潤癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，并顯著抑制腫瘤細(xì)胞侵襲。這可能與腫瘤細(xì)胞代謝特點有關(guān)，正常細(xì)胞在向惡性腫瘤轉(zhuǎn)化的過程中往往伴隨著代謝途徑的重塑，即無論氧供是否充足，都主要依靠糖酵解途徑供能，也稱為warburg效應(yīng)，這也是腫瘤細(xì)胞為了適應(yīng)自身過快增殖而造成的低氧低糖微環(huán)境所發(fā)生的一種改變[12]。

圖3 PGK1相關(guān)基因篩選結(jié)果

A.PGK1與各基因的相關(guān)性分析結(jié)果；B.與PGK1表達相關(guān)系數(shù)最高的前50個基因；C.CIDEC基因與PGK1表達的相關(guān)系數(shù)基因；D.AQP7基因與PGK1表達的相關(guān)系數(shù)；CIDEC為細(xì)胞死亡誘導(dǎo)DFFA樣效應(yīng)因子c，AQP7為道蛋白7

圖4 GO富集分析

PGK1是糖酵解途徑中重要的催化酶之一，其高表達可提高腫瘤細(xì)胞的代謝水平，增強腫瘤對無氧環(huán)境的適應(yīng)能力[13]。但除了在糖酵解發(fā)揮重要作用外，PGK1是否還參與到了其他的信號通路從而影響乳腺腫瘤患者預(yù)后仍有待深入探索，為此本研究進一步探索了與PGK1表達相關(guān)系數(shù)較高的基因及其相關(guān)機制。本研究結(jié)果顯示，CIDEC基因和AQP7與PGK1表達水平的相關(guān)系數(shù)最高，CIDEC基因又被稱為脂肪特異性蛋白27，該基因位于 3 號染色體 3p25，編碼一個細(xì)胞死亡誘導(dǎo)DNA碎片因子樣效應(yīng)子家族的成員，蛋白分子量為 27.3 kDa，其在脂肪組織中的表達水平最高，可促進脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成，并可能介導(dǎo)脂肪細(xì)胞的凋亡[14]。Grahn等[15]報道，CIDEC在人脂肪細(xì)胞中過表達，其可增加細(xì)胞中甘油三酯含量并降低脂肪分解作用，而敲除將小鼠的 CIDEC基因可見機體對儲存脂肪酸的消耗增加[16]，這提示CIDEC或許可通過促進脂肪蓄積，從而提高腫瘤組織能量供應(yīng)，促進腫瘤生長。

AQP7是水通道蛋白家族13個成員之一，其編碼的蛋白質(zhì)定位在質(zhì)膜上，允許水、甘油和尿素在細(xì)胞膜上運動，該基因同樣在脂肪組織中呈高表達，在脂肪組織中編碼的蛋白有利于甘油的流出[17]。既往研究發(fā)現(xiàn)AQP7與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)，其過表達可促進腫瘤細(xì)胞的遷移與增殖，并參與腫瘤的血管生成、局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，有研究表明AQP7在乳腺中分布較為廣泛，其高表達可能一方面通過增加微血管的水滲透性參與細(xì)胞生長，另一方面通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜對甘油的通透性而提高腫瘤組織的能量供應(yīng)[18]。富集分析結(jié)果可見，PGK1可以預(yù)測乳腺浸潤癌患者預(yù)后不良的潛在機制主要涉及其對物質(zhì)代謝的影響，特別是脂質(zhì)的代謝，這也與腫瘤組織無限增殖需要大量能量供應(yīng)相一致。

綜上所述，本實驗通過數(shù)據(jù)挖掘證實PGK1在提示乳腺浸潤癌患者預(yù)后中發(fā)揮重要作用，這可能與其通過調(diào)控物質(zhì)代謝水平，從而為腫瘤細(xì)胞提供更多能量，促進腫瘤細(xì)胞生長有關(guān)，這為乳腺浸潤癌的機制和藥物治療研究提供了一定參考；但同時PGK1可能涉及多條信號通路，這仍有待于進一步研究。