烏司他丁對膿毒癥大鼠心肌損傷及肺功能的保護作用及機制研究

明 丹，李曉榮，安立娟，王 嵐，王維展

膿毒癥是一類感染、嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克等引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，已成為危重患者死亡的主要因素[1]。膿毒癥患者病情進展過程中，會對其心、肺、肝、腸道等器官產(chǎn)生不同程度損傷，導(dǎo)致患者臟器功能障礙、病情惡化甚至死亡[2]。目前，對于膿毒癥性臟器損傷的發(fā)生機制尚未完全明確，但普遍認(rèn)為炎癥反應(yīng)與上述過程密切相關(guān)[3]。MAPK是哺乳動物體內(nèi)廣泛存在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可促進炎性因子的合成和釋放，參與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展，包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)、JNK、p38等亞族[4]。烏司他丁是一種尿胰蛋白酶抑制劑，臨床上常用于治療急性組織損傷，減輕炎癥損害[5]。研究發(fā)現(xiàn)，烏司他丁可通過干預(yù)p38 MAPK通路減輕膿毒癥性心肌損傷和肺損傷[6-7]。烏司他丁對其他MAPK通路在膿毒癥中的研究較少，本研究觀察了烏司他丁對膿毒癥大鼠心肌損傷和肺功能的保護作用，并從ERK/JNK/p38 MAPK方面探討了其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗藥物、試劑與儀器 烏司他丁注射液(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字：H19990134，規(guī)格：10萬U)。腫瘤壞死因子-α(TNF-α， KL-E683R)、白介素-6(IL-6， LS-F3364)、高遷移率族蛋白B1(HMGB1，LS-F23582)、ERK( ab53277)、JNK(ab199380)、p38(ab170099)、p-ERK(ab201015)、p-JNK(ab47337)、p-p38(ab4822)兔抗蛋白及β-actin(ab8226)鼠抗蛋白均購自美國Abcam公司，稀釋比均為1∶1000。ELISA試劑盒購自上海康朗生物科技有限公司。小動物超聲血流儀、全自動血氣分析儀購自上海玉研科學(xué)儀器有限公司；X光片暗盒購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.2膿毒癥動物模型的建立 采用盲腸結(jié)扎穿孔法構(gòu)建膿毒癥動物模型，具體方法：術(shù)前禁食12 h，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，于腹部正中作切口(約1 cm)，小心分離盲腸，距盲腸根部1/3處放置絲線并結(jié)扎，用注射針刺穿盲腸末端腸壁(對穿3處)，歸納腸管后逐層縫合。假手術(shù)組行開腹分離盲腸處理，但不結(jié)扎、不穿孔。術(shù)后皮下注射適量生理鹽水，補充血容量；注意保溫，自由進食飲水。術(shù)后6～12 h，若大鼠出現(xiàn)呼吸急促、寒戰(zhàn)、高熱、少尿、動作遲緩等表現(xiàn)時，表明膿毒癥模型復(fù)制成功[8]。

1.3實驗動物與分組 選取40只SD大鼠，雄性，6～8周齡，體重180～220 g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號：SCXK(京)2019-0002。隨機分為假手術(shù)組、模型組、烏司他丁低、高劑量組，每組10只，各組大鼠分籠飼養(yǎng)。烏司他丁低、高劑量組分別皮下注射烏司他丁10×104、20×104U/kg；假手術(shù)組和模型組以等量生理鹽水替代，1/d，連續(xù)給藥3 d。本實驗中動物操作均符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.4觀察指標(biāo)及方法

1.4.1心肌血流動力學(xué)指標(biāo)：烏司他丁干預(yù)結(jié)束后，應(yīng)用小動物超聲血流儀，檢測各組大鼠左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室收縮末壓(LVESP)、平均動脈壓(MAP)、左心室最大舒張速率(-dp/dtmax)和左心室最大收縮速率(+dp/dtmax)。

1.4.2血氣指標(biāo)：烏司他丁干預(yù)結(jié)束后，取各組大鼠股動脈血1 ml，以全自動血氣分析儀檢測pH值、動脈血氧分壓(PaO2)和二氧化碳分壓(PaCO2)。

1.4.3心肌和肺組織病理變化：烏司他丁干預(yù)結(jié)束后，采用頸椎脫臼法處死大鼠，迅速取出其心肌和肺組織，凍存于液氮罐；部分組織固定于中性甲醛溶液中，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，再行蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察組織病理變化并拍照。

1.4.4血清炎性因子水平：烏司他丁干預(yù)結(jié)束后，取大鼠尾靜脈血1 ml，室溫下靜置20 min，以2000 r/min離心10 min，取上層血清，凍存于-80℃冰箱備用；采用ELISA試劑盒檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6和HMGB1的含量。

1.4.5心肌和肺組織中ERK、IκB、JNK、p38磷酸化水平：液氮罐中取出大鼠組織，加入裂解液冰上勻漿，12 000 r/min離心10 min，分離上層蛋白液，測定其蛋白濃度；配制SDS-PAGE凝膠，電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜；浸于含5%脫脂奶粉的Tris-HCl 緩沖液中，室溫下封閉2 h；加入相應(yīng)兔抗、鼠抗蛋白，4℃孵育過夜；加入相應(yīng)山羊抗兔/鼠多克隆熒光二抗，室溫下孵育1 h；滴加ECL試劑，應(yīng)用X線片暗盒顯影、定影。以β-actin表達為內(nèi)參，計算p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38/p38的相對表達量。

2 結(jié)果

2.14組大鼠心肌和肺組織病理學(xué)變化 假手術(shù)組大鼠心肌細胞排列整齊，肺泡結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)正常，無明顯的病理改變。模型組大鼠心肌細胞出現(xiàn)水腫，細胞間質(zhì)增寬且伴有大量炎性細胞浸潤，肺泡內(nèi)有大量出血和炎性浸潤。與模型組大鼠相比，烏司他丁高、低劑量組大鼠的心肌細胞病變及水腫減輕，肺泡內(nèi)有少量炎性浸潤，且烏司他丁高劑量組心肌細胞和肺泡病變的改善效果較烏司他丁低劑量組更顯著。見圖1。

圖1 4組大鼠光鏡下心肌和肺組織病理學(xué)變化(HE×200)

烏司他丁低、高劑量組分別給予烏司他丁10×104、20×104U/kg

2.24組大鼠心肌血流動力學(xué)參數(shù)比較 4組大鼠心肌血流動力學(xué)參數(shù)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。模型組大鼠的LVEDP、LVESP、MAP、-dp/dtmax和+dp/dtmax均出現(xiàn)不同程度降低(P<0.01)。與模型組比較，烏司他丁低、高劑量組大鼠的LVEDP、LVESP、MAP、-dp/dtmax和+dp/dtmax均顯著上升，且烏司他丁高劑量組上述指標(biāo)高于烏司他丁低劑量組(P<0.01)。見表1。

表1 4組大鼠心肌血流動力學(xué)參數(shù)的比較

注：烏司他丁低、高劑量組分別給予烏司他丁10×104、20×104U/kg；LVEDP為左心室舒張末壓，LVESP為左心室收縮末壓，MAP為平均動脈壓，-dp/dtmax為左心室最大舒張速率，+dp/dtmax為左心室最大收縮速率；與假手術(shù)組比較，bP<0.01,與模型組比較，dP<0.01；與烏司他丁低劑量組比較，fP<0.01

2.34組大鼠動脈血氣分析指標(biāo)比較 4組大鼠血氣指標(biāo)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠PaO2和pH值顯著降低，PaCO2顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，烏司他丁低、高劑量組大鼠PaO2和pH值顯著升高，PaCO2顯著降低；且烏司他丁高劑量組上述指標(biāo)變化更顯著(P<0.01)。見表2。

2.44組大鼠血清炎性因子水平比較 4組大鼠血清炎性因子比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、HMGB1水平均顯著上升(P<0.01)。與模型組相比，烏司他丁低、高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6、HMGB1水平均顯著下降，且烏司他丁高劑量組上述指標(biāo)低于烏司他丁低劑量組(P<0.01)。見表3。

2.54組大鼠相關(guān)信號通路水平比較 與假手術(shù)組相比，模型組心肌和肺組織中ERK、JNK、p38磷酸化水平均顯著上調(diào)(P<0.01)。與模型組比較，烏司他丁低、高劑量組大鼠ERK、JNK、p38磷酸化水平顯著下調(diào)，且烏司他丁高劑量組低于烏司他丁低劑量組(P<0.01)。見圖2。

表2 4組大鼠動脈血氣分析指標(biāo)比較

注：烏司他丁低、高劑量組分別給予烏司他丁10×104、20×104U/kg；PaO2為氧分壓，PaCO2為二氧化碳分壓；與假手術(shù)組比較，bP<0.01,與模型組比較，dP<0.01；與烏司他丁低劑量組比較，fP<0.01

3 討論

目前認(rèn)為，炎癥反應(yīng)是膿毒癥的主要病理基礎(chǔ)之一。近年來，雖然圍繞著炎癥反應(yīng)不斷優(yōu)化膿毒癥的治療方案，但危重膿毒癥患者的病死率仍居高不下，而多器官功能障礙是死亡的常見原因之一[9]。體外研究膿毒癥的動物模型最常用方法有內(nèi)毒素/脂多糖誘導(dǎo)、盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)造模等[10]。內(nèi)毒素/脂多糖模型僅僅模擬了革蘭陰性菌感染性膿毒癥，無法體現(xiàn)混合感染的特點；而盲腸結(jié)扎穿孔模型可造成混合性的革蘭陰性菌及陽性菌的感染，更符合臨床膿毒癥特點[11]。本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)建立膿毒癥模型，術(shù)后6 h大鼠逐漸出現(xiàn)動作遲緩、呼吸急促、寒戰(zhàn)、少尿、精神萎靡的癥狀，提示膿毒癥大鼠模型復(fù)制成功。膿毒癥發(fā)展過程中，常累及其他器官；本研究病理檢測結(jié)果顯示，膿毒癥大鼠心肌細胞出現(xiàn)水腫，細胞間質(zhì)增寬且伴有大量炎癥細胞浸潤，肺泡內(nèi)有大量出血和炎性浸潤，其病理學(xué)特征符合膿毒癥多器官損傷。

表3 4組大鼠血清炎性因子水平比較

注：烏司他丁低、高劑量組分別給予烏司他丁10×104、20×104U/kg；TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-6為白介素-6，HMGB1為高遷移率族蛋白B1；與假手術(shù)組比較，bP<0.01,與模型組比較，dP<0.01；與烏司他丁低劑量組比較，fP<0.01

圖2 4組大鼠心肌和肺組織中ERK、IκB、JNK、p38磷酸化水平比較

A.假手術(shù)組；B.模型組；C.烏司他丁低劑量組；D.烏司他丁高劑量組；烏司他丁低、高劑量組分別給予烏司他丁10×104、20×104U/kg；ERK為細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶

烏司他丁屬于人類內(nèi)源性抗炎物質(zhì)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)上具有兩個活性功能區(qū)，除了蛋白酶抑制作用，還具有穩(wěn)定溶酶體膜、抑制心肌活性氧及多種炎性因子生成的作用；其可明顯改善膿毒癥大鼠的心肌損傷和肺功能[12-13]，為本研究提供了理論基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示，烏司他丁高、劑量組大鼠心肌和肺組織損傷明顯減輕，心肌血流動力學(xué)參數(shù)和血氣指標(biāo)得到明顯改善，提示烏司他丁具有改善膿毒癥大鼠心肌損傷和肺功能的作用，與文獻報道結(jié)果相符[14-15]。膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中涉及多種炎性因子的釋放，TNF-α為膿毒癥的啟動炎性因子，可介導(dǎo)其他炎性介質(zhì)放大炎癥信號，產(chǎn)生“瀑布”級聯(lián)反應(yīng)，刺激單核細胞、巨噬細胞等分泌促炎因子(IL-6、IL-1β等)；還可參與體內(nèi)代謝及免疫，啟動凝血過程[16]。HMGB1是由單核細胞、巨噬細胞釋放的炎性介質(zhì)；研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1是膿毒癥致死效應(yīng)中的關(guān)鍵因子，其水平可直接影響膿毒癥的病情及預(yù)后[17]。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，烏司他丁高、低劑量組血清TNF-α、IL-6、HMGB1水平均顯著下降；表明烏司他丁可顯著抑制炎性因子的釋放，與劉赟和吳星恒等[18]研究結(jié)果相似。

為進一步闡明烏司他丁抗炎的作用機制，本研究觀察了烏司他丁干預(yù)膿毒癥大鼠后MAPK信號通路活性的變化。ERK、JNK、p38信號通路均可被TNF-α激活，誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，從而產(chǎn)生更多炎性細胞因子[19]。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，烏司他丁低、高劑量組大鼠心肌和肺組織中ERK、JNK、p38蛋白磷酸化水平顯著降低，提示烏司他丁可通過下調(diào)TNF-α的分泌，從而阻礙ERK、JNK、p38信號通路異常激活，最終對膿毒癥大鼠心肌和肺組織起到保護作用。

綜上所述，烏司他丁可改善膿毒癥大鼠心肌損傷和肺功能，可能通過抑制炎癥信號通路(ERK、JNK、p38 MAPK)起到抗炎作用；但臨床上是否有同樣效用，還需多中心、大樣本、前瞻性隨機對照研究作進一步驗證，為烏司他丁應(yīng)用于膿毒癥治療提供科學(xué)指導(dǎo)。