利舒康膠囊對模擬高原缺氧大鼠肺組織損傷的保護作用

孟盼盼，郭建魁，王 榮，崔冰冰，景臨林，馬慧萍

高原低壓性缺氧環(huán)境除了對人體的各組織器官系統(tǒng)功能、代謝等產(chǎn)生影響外，還會引起以缺氧為突出表現(xiàn)的特殊類型疾病即急性高原病[1]。當(dāng)人們急進高原時，隨著海拔的上升，呼吸系統(tǒng)首先受到缺氧的影響，肺泡上皮和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的各種直接和間接損傷引起機體肺損傷，最嚴(yán)重的急性肺損傷形式是呼吸窘迫綜合征，這是急性肺損傷危重患者發(fā)病率和病死率高的主要原因，也是引起高原肺水腫的直接原因[2-4]。但現(xiàn)有藥物還不能滿足有效預(yù)防和治療高原缺氧的需求，尋找有效的高原抗缺氧藥物具有重要意義。

藏藥利舒康膠囊是國家最早批準(zhǔn)臨床使用的傳統(tǒng)中藥復(fù)方制劑，具有明顯的緩解高原反應(yīng)、高原紅細(xì)胞增多癥、高原腦水腫、高原心臟病等作用[5]。課題組前期研究表明，利舒康膠囊對高原缺氧大鼠心、腦組織具有明顯的保護作用[6-7]，但在對肺組織保護作用方面的研究還尚未見報道。本研究擬通過模擬高原海拔8000 m缺氧12 h觀察利舒康膠囊對缺氧大鼠肺損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠(體重180～220 g)，購自蘭州大學(xué)，實驗動物合格證號SCXK(甘)2013-0002，飼養(yǎng)于中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院動物實驗科。

1.2實驗儀器 FLYDWC50-ⅡA型低壓低氧動物實驗艙(中航工業(yè)貴州風(fēng)雷航空軍械有限責(zé)任公司)；BP210S電子天平(荷蘭賽多利斯有限公司)。

1.3藥品與試劑 利舒康膠囊(青海益欣藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：20161207)；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒(批號：20161220)、谷胱甘肽(GSH)試劑盒(批號:20161209)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號：20161220)、乳酸(LD)試劑盒(批號：20170106)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(批號：20161219)、一氧化氮合酶(NOS)試劑盒(批號：20161219)、過氧化氫(H2O2)試劑盒(批號：20161219)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒(批號：20161220)、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶試劑盒(批號：20170106)均購于南京建成生物工程研究所。

1.4模擬海拔8000 m高原急性缺氧實驗 取SPF級健康雄性Wistar大鼠72只，適應(yīng)飼養(yǎng)3 d后隨機分為常氧對照組、缺氧模型組、紅景天膠囊組、利舒康膠囊低、中、高劑量組，每組12只。常氧對照組和缺氧模型組灌服等體積注射用水，紅景天膠囊組灌服紅景天膠囊280 mg/kg，利舒康膠囊低、中、高劑量組分別灌服280、420、560 mg/kg利舒康膠囊，灌胃給藥7 d。第7天給藥50 min后將動物放入低壓低氧動物實驗艙模擬海拔8000 m缺氧環(huán)境，以10 m/s的速度減壓上升至8000 m海拔，維持缺氧12 h，完成減壓缺氧后在海拔3500 m處將大鼠處死，并對肺組織進行相應(yīng)處理。常氧對照組大鼠不缺氧。

1.5觀察指標(biāo)

1.5.1病理組織檢測：各組隨機取2只大鼠肺組織標(biāo)本，置10%甲醛中固定，樣品送往中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院病理科，進行石蠟包埋、組織切片、HE染色以及光鏡觀察。

1.5.2生化指標(biāo)檢測：各組取10只大鼠的肺組織標(biāo)本，稱重后加入9倍體積的生理鹽水，使用組織勻漿器在冰水浴中勻漿，部分勻漿在4℃離心機內(nèi)1500 r/min離心10 min，吸取上清液-80℃凍存，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶測定備用；其余勻漿在4℃離心機內(nèi)3500 r/min離心10 min，吸取上清液-80℃凍存，用于GSH-PX、GSH、NOS、MDA、LD、LDH、H2O2指標(biāo)測定。測定方法嚴(yán)格按照說明書進行。

2 結(jié)果

2.1肺組織顯微結(jié)構(gòu) 常氧對照組肺內(nèi)支氣管為單層纖毛柱狀上皮結(jié)構(gòu)、肺泡腔呈空泡狀薄壁結(jié)構(gòu)；缺氧模型組炎性細(xì)胞浸潤支氣管平滑肌層，肺泡壁增厚，肺泡腔縮小；紅景天膠囊組肺泡壁可見明顯水腫，肺泡腔縮??；利舒康膠囊低劑量組炎性細(xì)胞浸潤支氣管平滑肌層，部分肺泡壁增厚，肺泡腔縮?。焕婵的z囊中劑量組部分肺泡壁可見水腫；利舒康膠囊高劑量組大部分肺泡形態(tài)較好，少部分肺泡壁增厚。見圖1。

2.2肺組織氧化應(yīng)激相關(guān)生化指標(biāo) 與常氧對照組比較，缺氧模型組大鼠肺組織MDA、H2O2含量和NOS活力均顯著升高，GSH含量和GSH-PX、CAT活力顯著降低(P<0.05，P<0.01)。紅景天膠囊組MDA、H2O2含量、GSH-PX、CAT活力與缺氧模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，NOS活力低于缺氧模型組，GSH含量高于缺氧模型組(P<0.05，P<0.01)。利舒康膠囊中劑量組CAT活力高于缺氧模型組，利舒康膠囊高劑量組MDA、H2O2含量和NOS活力低于缺氧模型組，GSH含量和GSH-PX、CAT活力高于缺氧模型組(P<0.05，P<0.01)。見表1。

圖1 模擬高原缺氧大鼠肺組織顯微結(jié)構(gòu)的變化(HE×400)

A.常氧對照組;B.缺氧模型組;C.紅景天膠囊組;D.利舒康膠囊低劑量組;E.利舒康膠囊中劑量組;F.利舒康膠囊高劑量組

表1 6組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較

注：紅景天膠囊組給予紅景天膠囊280 mg/kg灌胃，利舒康低、中、高劑量組分別給予利舒康膠囊280、420、560 mg/kg灌胃；MDA為丙二醛，H2O2為過氧化氫，GSH為谷胱甘肽，CAT為過氧化氫酶，NOS為一氧化氮合酶，GSH-PX為谷胱甘肽過氧化物酶；與常氧對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與缺氧模型組比較，cP<0.05，dP<0.01

2.3肺組織能量代謝相關(guān)生化指標(biāo) 與常氧對照組相比，缺氧模型組大鼠肺組織LD、LDH含量顯著增加，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力顯著降低(P<0.05，P<0.01)。紅景天膠囊組LD含量與缺氧模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，LDH活力低于缺氧模型組，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力高于缺氧模型組(P<0.05，P<0.01)。利舒康膠囊高劑量組LD、LDH含量低于缺氧模型組，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力高于缺氧模型組(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 6組大鼠肺組織LD、LDH、Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶比較

注：紅景天膠囊組給予紅景天膠囊280 mg/kg灌胃，利舒康膠囊低、中、高劑量組分別給予利舒康膠囊280、420、560 mg/kg灌胃； LD為乳酸，LDH為乳酸脫氫酶；與常氧對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與缺氧模型組比較，cP<0.05，dP<0.01

3 討論

近年來，隨著高原經(jīng)濟的發(fā)展和旅游業(yè)的日益興旺，越來越多的人需要進入高海拔地區(qū)，從而引發(fā)急性高原病，如果救治不及時病死率很高[8-10]。肺組織對缺氧環(huán)境的感知較為敏感，機體在缺氧環(huán)境中氧自由基代謝失衡，導(dǎo)致肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，肺血管通透性增加，加重肺組織損傷，從而引發(fā)高原肺水腫[11-13]。組織病理學(xué)結(jié)果顯示，模擬海拔8000 m高原缺氧環(huán)境12 h后，缺氧模型組大鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤支氣管平滑肌層，肺泡壁增厚，肺泡腔縮?。患t景天膠囊組肺泡壁可見明顯水腫，肺泡腔縮小；利舒康膠囊高劑量組大部分肺泡形態(tài)較好，少部分肺泡壁增厚。提示利舒康膠囊可明顯改善模擬高原缺氧大鼠肺組織的損傷。

在模擬海拔8000 m高原缺氧環(huán)境12 h后，機體會發(fā)生一定的氧自由基代謝紊亂，MDA含量顯著升高，MDA可反映機體自由基的代謝情況，間接地反映出機體器官的損傷程度[14]。NOS可誘導(dǎo)NO的生成，而NO 的過量增多導(dǎo)致了機體的脂質(zhì)過氧化，并誘導(dǎo)DNA損傷[15]。本研究結(jié)果顯示，缺氧模型組大鼠肺組織MDA含量和NOS活力升高，提示大鼠在模擬低壓低氧條件下，機體的氧自由基代謝確實會出現(xiàn)紊亂，抗氧化系統(tǒng)被破壞，活性氧自由基在機體內(nèi)大量堆積，導(dǎo)致機體肺組織損傷，而高劑量利舒康膠囊給藥后，MDA含量和NOS活力均出現(xiàn)顯著降低。

H2O2主要是在機體新陳代謝中物質(zhì)氧化分解過程中產(chǎn)生的，檢測這一指標(biāo)，可以反映出缺氧條件下機體受損傷的程度。而機體內(nèi)過量的H2O2主要靠CAT清除，CAT是機體主要的活性氧清除酶[16]。GSH-PX是機體內(nèi)廣泛存在的一種過氧化物分解酶，GSH是GSH-PX的底物，是GSH-PX完成其功能的基礎(chǔ)。GSH和GSH-PX的作用都是減少自由基的產(chǎn)生，防止脂質(zhì)過氧化及其代謝產(chǎn)物對機體造成的損傷[17]。本研究結(jié)果顯示，缺氧模型組大鼠肺組織H2O2含量較常氧對照組顯著升高，而高劑量利舒康膠囊給藥后明顯降低；缺氧模型組CAT活力較常氧對照組顯著降低，利舒康膠囊給藥后隨劑量的增大逐漸升高，中、高劑量組與缺氧模型組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；缺氧模型組GSH含量和GSH-PX活性較常氧對照組顯著降低，經(jīng)高劑量利舒康膠囊給藥后顯著升高。提示利舒康膠囊可抑制缺氧大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕缺氧對大鼠肺組織造成的損傷。

LD和LDH是反映機體糖無氧酵解的兩個重要指標(biāo)，LD既是糖無氧酵解的產(chǎn)物，又是糖異生的原料之一；LDH主要使乳酸脫氫生成丙酮酸，便于利用乳酸氧化功能，檢測這一指標(biāo)可反映機體能量代謝的情況[18]。本研究結(jié)果顯示，缺氧模型組大鼠肺組織LD含量和LDH活性均較常氧對照組顯著升高，而利舒康膠囊給藥后，LD含量和LDH活性均明顯降低，提示利舒康膠囊能維持缺氧條件下機體對能量的消耗，延長大鼠的存活時間。

ATP是機體內(nèi)主要的能量功能物質(zhì)，而Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶是參與主動運轉(zhuǎn)的離子泵的重要成分，在維持細(xì)胞內(nèi)外離子交換的過程中起著重要的作用，可作為代謝紊亂和組織損傷恢復(fù)能力的重要指標(biāo)[2,19]。本研究結(jié)果顯示，缺氧模型組肺組織Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶與常氧對照組相比顯著下降，而高劑量利舒康膠囊給藥后，肺組織Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活力高于缺氧模型組，提示利舒康膠囊能在一定程度上緩解缺氧所致的能量代謝障礙。

綜上所述，利舒康膠囊可通過調(diào)節(jié)缺氧大鼠自由基代謝和能量代謝水平提高大鼠抗缺氧能力，其主要機制可能是減輕由H2O2和MDA等“毒性”物質(zhì)對機體的損傷，加強糖酵解產(chǎn)能作用，維持機體生存所需的能量，減輕機體因能量不足而發(fā)生組織衰竭，從而進一步提高機體抗缺氧能力。