酶預(yù)處理提取茴香揮發(fā)油的研究

孟文俊，蘇藝華

(1.滄州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 基礎(chǔ)部，河北 滄州 061000；2.滄州師范學(xué)院 繼續(xù)教育學(xué)院，河北 滄州 061000)

茴香為傘形科茴香屬多年生草本植物，具有強(qiáng)烈的香氣，原產(chǎn)于地中海沿岸及西亞，現(xiàn)主要集中產(chǎn)于歐亞大陸。在我國，茴香已有上千年的栽培歷史，廣泛分布于東北、華北和西北地區(qū)[1,2]。茴香種子及其揮發(fā)油是重要的調(diào)味品，在全世界范圍內(nèi)廣泛使用。此外，茴香揮發(fā)油也能藥用，具有抗菌消炎及鎮(zhèn)痛的功效[3,4]。茴香揮發(fā)油是無色或淡黃色液體，具有獨(dú)特的香味，主要成分是茴香腦和葑酮，以及少量的檸檬烯、蒎烯、γ-松油烯等萜烯類成分[5,6]?，F(xiàn)有的茴香揮發(fā)油的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、蒸餾萃取法、微波輔助法和亞臨界流體萃取法等[7-10]。近年來，酶預(yù)處理成為揮發(fā)油提取過程中的常用輔助方法，酶預(yù)處理可以破壞植物細(xì)胞壁，促進(jìn)細(xì)胞活性成分溶出，提高得油率[11]。本文利用纖維素酶預(yù)處理后蒸餾提取茴香揮發(fā)油，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)選最佳工藝，并分析了酶預(yù)處理后提取的茴香揮發(fā)油的成分。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

茴香：試驗(yàn)用茴香產(chǎn)自河北；纖維素酶：產(chǎn)于河北拓海生物科技有限公司，活力單位10000 U/g；檸檬酸、石油醚、無水硫酸鈉：均為分析純。

1.1.2 儀器

HH-S型恒溫水浴鍋 鞏義市英峪予華儀器有限公司；QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 Shmadzu公司；AB135-S分析天平 Mettler-Toledo公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 揮發(fā)油的提取

將茴香籽粉末50 g置于100 mL燒瓶中，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的需要，加入適量纖維素酶溶液，在一定的溫度和pH條件下預(yù)處理一定時(shí)間。隨后，利用水蒸氣蒸餾法提取茴香揮發(fā)油，蒸餾液以石油醚萃取，加入無水硫酸鈉，靜置，干燥脫水，再使用減壓旋蒸法去除石油醚，得到茴香揮發(fā)油。為了對比，不經(jīng)過酶預(yù)處理，利用相同方法提取茴香揮發(fā)油。稱重，計(jì)算茴香揮發(fā)油的得油率。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

設(shè)定纖維素酶的添加量為0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，預(yù)處理溫度為50 ℃，調(diào)節(jié)pH值為5，預(yù)處理時(shí)間為4 h，隨后參照1.2.1中的蒸餾法提取茴香揮發(fā)油，并計(jì)算得油率；設(shè)定纖維素酶的添加量為1.5%，分別設(shè)定預(yù)處理溫度為40，45，50，55，60，65 ℃，調(diào)節(jié)pH值為5，預(yù)處理時(shí)間為4 h，隨后參照1.2.1中的蒸餾法提取茴香揮發(fā)油，并計(jì)算得油率；設(shè)定纖維素酶的添加量為1.5%，預(yù)處理溫度為50 ℃，分別調(diào)節(jié)pH值為3.5，4，4.5，5，5.5，6，預(yù)處理時(shí)間為4 h，隨后參照1.2.1中的蒸餾法提取茴香揮發(fā)油，并計(jì)算得油率；設(shè)定纖維素酶添加量為1.5%，預(yù)處理溫度50 ℃，調(diào)節(jié)pH值為5，分別預(yù)處理1，2，3，4，5，6 h，隨后參照1.2.1中的蒸餾法提取茴香揮發(fā)油，并計(jì)算得油率。

1.2.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以茴香揮發(fā)油的得油率為考察指標(biāo)，選取纖維素酶添加量(1%、1.5%、2%)、預(yù)處理溫度(45，50，55 ℃)、預(yù)處理pH值(4.5，5，5.5)、預(yù)處理時(shí)間(3，4，5 h)4個(gè)因素設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 纖維素酶添加量對揮發(fā)油得油率的影響

茴香揮發(fā)油得油率與纖維素酶添加量的關(guān)系見圖1。

圖1 茴香揮發(fā)油得油率與纖維素酶添加量的關(guān)系Fig.1 The relation between the yield of fennel volatile oils and the additive amount of cellulase

由圖1可知，未添加纖維素酶時(shí)，揮發(fā)油的得油率最低，隨著纖維素酶添加量的增加，揮發(fā)油得油率快速增加，但當(dāng)纖維素酶的添加量超過1.5%時(shí)，進(jìn)一步增加纖維素酶添加量，揮發(fā)油得油率增加緩慢，甚至不再變化。這是由于茴香籽與纖維素酶已經(jīng)結(jié)合，繼續(xù)增加纖維素酶的添加量，已經(jīng)沒有多余的底物能夠與其結(jié)合，揮發(fā)油提取率幾乎不再改變[12]。

2.1.2 纖維素酶預(yù)處理溫度對揮發(fā)油得油率的影響

茴香揮發(fā)油得油率與預(yù)處理溫度的關(guān)系見圖2。

圖2 茴香揮發(fā)油得油率與酶預(yù)處理溫度的關(guān)系Fig.2 The relation between the yield of fennel volatile oils and the enzyme pretreatment temperature

由圖2可知，隨著酶預(yù)處理溫度的升高，茴香揮發(fā)油的得油率明顯增加，但當(dāng)溫度超過50 ℃時(shí)，繼續(xù)升高酶預(yù)處理溫度，揮發(fā)油的得油率反而下降，這是由于溫度過高時(shí)，纖維素酶的活性降低，從而導(dǎo)致茴香揮發(fā)油的得油率降低。

2.1.3 纖維素酶預(yù)處理pH值對揮發(fā)油得油率的影響

茴香揮發(fā)油得油率與酶預(yù)處理pH值的關(guān)系見圖3。

圖3 茴香揮發(fā)油得油率與酶預(yù)處理pH值的關(guān)系Fig.3 The relation between the yield of fennel volatile oils and the enzyme pretreatment pH value

由圖3可知，隨著pH值的增加，茴香揮發(fā)油的得油率明顯上升，當(dāng)酶預(yù)處理pH值達(dá)到5時(shí)，茴香揮發(fā)油的得油率最高，進(jìn)一步增加pH值，得油率明顯下降，這種變化趨勢可能與纖維素酶的最佳pH值有關(guān)，pH值過高或過低都會影響纖維素酶的活性[13]。

2.1.4 纖維素酶預(yù)處理時(shí)間對揮發(fā)油得油率的影響

茴香揮發(fā)油得油率與酶預(yù)處理時(shí)間的關(guān)系見圖4。

圖4 茴香揮發(fā)油得油率與酶預(yù)處理時(shí)間的關(guān)系Fig.4 The relation between the yield of fennel volatile oils and the enzyme pretreatment time

由圖4可知，隨著酶預(yù)處理時(shí)間的增加，茴香揮發(fā)油的得油率明顯增加，當(dāng)預(yù)處理時(shí)間超過4 h時(shí)，進(jìn)一步增加預(yù)處理時(shí)間，揮發(fā)油的得油率幾乎不再變化[14]。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，對影響茴香揮發(fā)油得油率的主要影響因素：纖維素酶添加量、酶預(yù)處理溫度、酶預(yù)處理pH值和酶預(yù)處理時(shí)間，采用正交試驗(yàn)對酶預(yù)處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化。因素水平設(shè)計(jì)見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental scheme and results

由表2可知，各因素對茴香揮發(fā)油得油率的影響大小依次為A>B>C>D，即纖維素酶添加量對茴香揮發(fā)油得油率的影響最大，其次為酶預(yù)處理溫度、酶預(yù)處理pH值，酶預(yù)處理時(shí)間對得油率的影響最小。在選定的水平中，各因素的最優(yōu)水平為A2B2C2D3，即纖維素酶添加量為1.5%，酶預(yù)處理溫度為50 ℃，酶預(yù)處理pH值為5，酶預(yù)處理時(shí)間為5 h。試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果表明，在最優(yōu)提取條件下，茴香揮發(fā)油的得油率可達(dá)1.69%，高于正交試驗(yàn)的所有結(jié)果。

2.3 不同預(yù)處理方法對茴香揮發(fā)油得油率的比較

不同預(yù)處理方法對茴香揮發(fā)油得油率的比較見表3。

表3 茴香揮發(fā)油得油率與預(yù)處理方法的關(guān)系Table 3 The relation between the yield of fennel volatile oils and the pretreatment methods

由表3可知，對纖維素酶預(yù)處理最佳提取工藝組合進(jìn)行預(yù)處理，茴香揮發(fā)油得油率最高，達(dá)到1.68%，高于不添加纖維素酶和不做預(yù)處理的提取方式。

2.4 不同預(yù)處理方法對茴香揮發(fā)油成分的影響

不同預(yù)處理方法的茴香揮發(fā)油主要成分見表4。

表4 茴香揮發(fā)油的主要成分表Table 4 The main components of volatile oils of fennel %

纖維素酶預(yù)處理對茴香揮發(fā)油成分的影響較大，反式-茴香腦和含氧化合物的比例均高于未做預(yù)處理的茴香揮發(fā)油，香味更加明顯。總的來說，經(jīng)過酶預(yù)處理后的茴香揮發(fā)油具有更好的品質(zhì)[15]。

2.5 不同預(yù)處理方式下細(xì)胞壁的形貌表征

不同預(yù)處理方式后細(xì)胞壁的SEM圖片見圖5。

圖5 不同預(yù)處理方式后細(xì)胞壁的SEM圖片F(xiàn)ig.5 The SEM figures of cell walls with different pretreatment methods

注：a表示未經(jīng)預(yù)處理；b表示溫水浸泡預(yù)處理；c表示纖維素酶預(yù)處理。

由圖5a和圖5b可知，不經(jīng)過任何預(yù)處理或溫水浸泡預(yù)處理后的茴香籽的細(xì)胞壁表面由多層保護(hù)結(jié)構(gòu)覆蓋，細(xì)胞壁難以被破壞或僅只有物理上的破壞，在較長的蒸餾時(shí)間下，體內(nèi)的精油無法被順利提取，揮發(fā)油得油率仍然較低。由圖5c可知，纖維素酶預(yù)處理后，由于酶解的作用，細(xì)胞壁被破壞，體內(nèi)精油更容易被提取，揮發(fā)油得油率增加。

3 結(jié)論

利用纖維素酶預(yù)處理結(jié)合蒸餾法提取茴香揮發(fā)油，并利用正交試驗(yàn)探討了最佳提取工藝。結(jié)果表明：纖維素酶添加量1.5%，預(yù)處理溫度50 ℃，預(yù)處理pH值5，預(yù)處理時(shí)間5 h時(shí)，茴香揮發(fā)油的得油率最高，達(dá)到1.68%，明顯高于溫水浸泡處理后蒸餾和直接蒸餾法。纖維素酶預(yù)處理后提取的揮發(fā)油的反式-茴香腦和含氧化合物比例更高，具有更好的品質(zhì)。纖維素酶預(yù)處理能夠破壞茴香籽的細(xì)胞壁，使茴香揮發(fā)油更容易被提取。