QuEChERS萃取-UPLC-MS/MS測(cè)定花生醬中黃曲霉毒素B1方法的研究

梁劍鋒，李亞，梁燕妮，楊韶平

(梧州學(xué)院 化學(xué)工程與資源再利用學(xué)院，廣西 梧州 543002)

黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉等真菌毒素，在高溫高濕環(huán)境下產(chǎn)生的一種次生代謝物[1,2]。目前發(fā)現(xiàn)有20種黃曲霉毒素及其衍生物 ,其中以黃曲霉毒素B1毒性最強(qiáng)[3]，在1993年被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為Ⅰ類致癌物，對(duì)廣大人民群眾的健康產(chǎn)生巨大危害[4]?；ㄉ俏覈?guó)廣泛種植的經(jīng)濟(jì)作物，以花生為原料加工的食品除了花生油外，還有調(diào)味品花生醬，由于其風(fēng)味、香氣獨(dú)特而深受廣大群眾喜愛，但是花生在種植、運(yùn)輸、儲(chǔ)存過程中容易受到黃曲霉和寄生曲霉污染，從而產(chǎn)生強(qiáng)致癌代謝物黃曲霉毒素B1[5]。所以，有必要開展花生醬中黃曲霉毒素B1的快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)檢測(cè)方法，以利于對(duì)其食品安全性進(jìn)行有效控制。

目前，國(guó)內(nèi)食品中的黃曲霉毒素B1常用的檢測(cè)方法有：酶聯(lián)免疫(ELISA)法、薄層色譜(TLC)法、氣相色譜(GC)法、高效液相色譜(HPLC)法、液質(zhì)聯(lián)用儀法、免疫傳感法[6-12]。這些檢測(cè)方法是通過免疫親和柱凈化后，采用保留時(shí)間方法對(duì)黃曲霉毒素B1定性的，具有操作步驟繁瑣、檢測(cè)成本高、干擾物對(duì)結(jié)果影響大等缺點(diǎn)。QuEChERS是一種在蔬菜、糧食中農(nóng)殘檢測(cè)的快速提取方法，可以有效去除提取液中蛋白、脂肪酸、磷脂、糖、色素等雜質(zhì)，能夠有效提高檢測(cè)回收率[13]。將高效、經(jīng)濟(jì)、快速的QuEChERS前處理方法，與高靈敏性、高選擇性的超高速液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀聯(lián)合起來，建立適用于花生醬復(fù)雜基質(zhì)樣品中黃曲霉毒素B1的快速檢測(cè)方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

LC1290-QQQ6490超高速液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(配電噴霧離子源 ) 美國(guó)安捷倫公司；XS105DU天平 瑞士梅特勒公司；ST16R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)熱電公司；Multi Reax渦旋混合器 德國(guó)Heidolph公司；Million Q超純水器 美國(guó)Millipore公司。

黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品：濃度2.000 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所；甲酸：色譜純，美國(guó)MREDA公司；乙腈、甲醇：色譜純，德國(guó)MERCK公司；無水硫酸鎂：分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷吸附劑：PSA，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；HC-C18填料：40～63 μm，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；花生醬：市購(gòu)。

1.2 樣品前處理

稱取5.0000 g攪拌均勻的花生醬置于50 mL聚乙烯離心管中，加入20.00 mL 1%甲酸-乙腈溶液搖勻，將離心管置于渦旋混合器上混合5 min，然后在冷凍離心機(jī)中5 min(轉(zhuǎn)速4000 r/min，溫度4 ℃)，取出后放置至室溫，準(zhǔn)確吸取1.00 mL離心上清液，置于2.0 mL離心管中(預(yù)裝有無水硫酸鎂、HC-C18、PSA凈化試劑)，將離心管置于渦旋混合器上混合5 min后，在4 ℃下以15000 r/min冷凍離心8 min，取上清液過0.22 μm濾膜(初濾液棄去)，將濾液置于液相進(jìn)樣瓶中，供上機(jī)測(cè)定。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：吸取黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品0.50 mL到10.00 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成100.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，密封存儲(chǔ)于-20 ℃冰箱中(不超過1個(gè)月)。

黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別吸取100，200，300，400，500 μL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液到10.00 mL棕色容量瓶中，乙腈定容至刻度，分別得到濃度為1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 ng/mL溶液。

1.4 色譜條件

流動(dòng)相：A相0.1%甲酸溶液，B相乙腈，流動(dòng)相梯度洗脫程序見表1；色譜柱：C18超高惰性硅膠柱(75 mm×2.1 mm×2.5 μm，ACE UltraCore C18)；柱溫：35 ℃；流速：0.35 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient elution procedure

1.5 質(zhì)譜條件

離子源：ESI+；檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；霧化器壓力：40 psi；毛細(xì)管電壓：3500 V；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：9 L/min；監(jiān)測(cè)離子對(duì)和其他參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜儀檢測(cè)參數(shù)Table 2 Detection parameters of mass spectrometer

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

花生醬的主要配料是花生仁、白砂糖、氫化油脂、食用鹽等，樣品中對(duì)檢測(cè)有影響的成分主要是高油(樣品中脂肪含量在40%～50%之間)、膠溶性雜質(zhì)(主要是磷脂、蛋白、糖、食鹽成分)、脂溶性雜質(zhì)(主要是游離脂肪酸、色素)等，因此選擇合適的提取溶液，可以降低基體帶來的干擾，提高試驗(yàn)的回收率，綜合考慮樣品基體的特點(diǎn)和分析目標(biāo)物特性后，試驗(yàn)考察甲醇、酸化甲醇(1%甲酸)、乙腈、酸化乙腈(1%甲酸)、甲醇-乙腈(80∶20，V/V)等不同提取溶劑對(duì)試驗(yàn)回收率的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 不同提取溶液對(duì)花生醬樣品回收率的影響Fig.1 Effect of different extracting solutions on the recovery rate of peanut butter samples

由圖1可知，花生醬樣品采用1%甲酸-乙腈溶液提取回收率最好?？赡苁怯捎诨ㄉu樣品含有大量脂肪，根據(jù)“相似相溶”的原理，乙腈能夠高效提取脂肪中黃曲霉毒素B1，同時(shí)1%甲酸-乙腈中甲酸能夠使花生醬中大量磷脂、蛋白等膠體干擾物質(zhì)在提取過程中通過形成絮凝沉淀物離心去除，減少這些物質(zhì)對(duì)目標(biāo)分析物的吸附，從而達(dá)到進(jìn)一步提高試驗(yàn)回收率的作用。

2.2 凈化鹽包配比確定

2.2.1 鹽析劑無水硫酸鎂使用量

由于花生醬樣品在經(jīng)過1%甲酸-乙腈溶液提取離心后，其上清液中還存在著大量共萃雜質(zhì)，還會(huì)影響對(duì)目標(biāo)分析，所以需要進(jìn)一步采用鹽析的方法去除雜質(zhì)。本試驗(yàn)通過在凈化鹽包中添加無水硫酸鎂，去除提取液中水溶性雜質(zhì)，考察無水硫酸鎂不同添加量對(duì)目標(biāo)分析物回收率的影響，其結(jié)果見圖2。

圖2 鹽析劑無水硫酸鎂使用量對(duì)回收率的影響Fig.2 Effect of the usage amount of salting-out agent anhydrous magnesium sulfate on recovery rate

由圖2可知，隨著無水硫酸鎂使用量增加，目標(biāo)分析物黃曲霉毒素B1回收率也在增加，但在無水硫酸鎂使用量達(dá)到250 mg后，目標(biāo)物回收率出現(xiàn)了下降，此現(xiàn)象原因分析：由于無水硫酸鎂有強(qiáng)結(jié)合水的能力，其可以大量吸附提取液中水溶性雜質(zhì)，同時(shí)可以飽和水溶液而使提取液分層，從而提高試驗(yàn)萃取效率，但是大量無水硫酸鎂使用后，提取液中無水硫酸鎂會(huì)出現(xiàn)結(jié)塊現(xiàn)象，從而導(dǎo)致其與提取液接觸的面積減少，同時(shí)其吸水過程中產(chǎn)生大量熱量使提取液局部迅速升溫，從而導(dǎo)致目標(biāo)分析物的回收率下降，所以凈化包中采用250 mg無水硫酸鎂比較合適。

2.2.2 凈化劑配方考核

圖3 凈化劑HC-C18使用量對(duì)黃曲霉毒素B1回收率的影響Fig.3 Effect of the usage amount of HC-C18 on recovery rate of aflatoxin B1

圖4 凈化劑PSA使用量對(duì)黃曲霉毒素B1回收率的影響Fig.4 Effect of the usage amount of PSA on recovery rate of aflatoxin B1

提取液中除了水溶性雜質(zhì)外，還有一定量的磷脂、蛋白等非極性雜質(zhì)，和糖類、脂肪酸等極性雜質(zhì)影響分析結(jié)果，所以凈化包中通過采用一定量的HC-C18、PSA凈化物質(zhì)，分別除去提取液中非極性、極性雜質(zhì)，從而進(jìn)一步提高試驗(yàn)方法的回收率。本試驗(yàn)考察HC-C18、PSA不同的添加量對(duì)花生醬基質(zhì)提取液的凈化效果，以黃曲霉毒素B1回收率為考核的指標(biāo)，結(jié)果見圖3和圖4。

由圖3和圖4可知，花生醬樣品采用100 mg HC-C18、50 mg PSA凈化配方，試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)分析物黃曲霉毒素B1回收率最高。

2.3 色譜/質(zhì)譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)考察純水、0.1%甲酸溶液分別與乙腈、甲醇組成的流動(dòng)相，對(duì)花生醬樣品目標(biāo)分析物黃曲霉毒素B1保留時(shí)間與峰形的影響。

圖5 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM質(zhì)譜圖Fig.5 MRM mass spectrogram of aflatoxin B1 standard solution

試驗(yàn)結(jié)果表明：流動(dòng)相采用乙腈洗脫效果明顯比甲醇好，同時(shí)在ESI+模式時(shí)，流動(dòng)相加入0.1%甲酸溶液時(shí)，更容易誘導(dǎo)黃曲霉毒素B1產(chǎn)生[M+H]+，所以試驗(yàn)采用0.1%甲酸-乙腈溶液為色譜的流動(dòng)相。黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM質(zhì)譜圖見圖5。

3 試驗(yàn)方法評(píng)價(jià)

3.1 方法線性考察

以黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)值為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明黃曲霉毒素B1在1.00～5.00 ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程Y=2110.2X+467.9，擬合度r2為0.9993。

3.2 方法檢出限

準(zhǔn)確稱取樣品5.00 g(精確到0.0001 g)，加入150 μL的濃度為1.00 ng/mL的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照1.2的前處理方法處理提取樣品，S/N=16.2，圖譜見圖6。

圖6 方法的檢出限色譜圖Fig.6 Detection limit chromatogram of the method

由于檢出限為各化合物的3倍信噪比即S/N=3就被定為最低檢出限(LOD)。測(cè)得數(shù)據(jù)顯示，檢出限目標(biāo)分析物黃曲霉毒素B1信噪比S/N>3，可以確定方法的檢出限在0.03 μg/kg。

3.3 方法的回收率及精密度

在空白的花生醬樣品中，分別添加0.50，1.00，5.00，10.0 μg/kg 4個(gè)不同水平的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平測(cè)定6次，按照1.2的前處理方法處理樣品，結(jié)果見表3。

表3 試驗(yàn)方法的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recovery rates and relative standard deviations of test methods (n=6)

由表3可知，本試驗(yàn)方法的回收率在81.7%～93.5%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.4%～5.6%。表明該方法適用于樣品花生醬中黃曲霉毒素B1分析，試驗(yàn)方法具有良好的回收率與精密度，符合GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》中回收率和精密度的要求[14]。

3.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

稱取市場(chǎng)上購(gòu)買的3款花生醬(編號(hào)T1、T2、T3)，采用1.2的前處理方法處理，同時(shí)采用食品中黃曲霉毒素B1檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.22-2016第一法(液質(zhì))、第二法(柱前衍生)、第三法(柱后光化學(xué)衍生)進(jìn)行檢測(cè)[15]，不同方法檢測(cè)結(jié)果見表4。

表4 本試驗(yàn)方法與國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果的比較Table 4 Comparison of testing results between this method and international standard testing methods

由表4可知，本文的試驗(yàn)方法檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)3種方法結(jié)果相比相對(duì)偏低，但是相對(duì)偏差都在5%以下，符合國(guó)標(biāo)GB 5009.22-2016中方法精密度小于20%的要求。本試驗(yàn)方法與目前的國(guó)標(biāo)方法相比：在經(jīng)濟(jì)成本上，由于前處理無需價(jià)格昂貴的免疫親和柱凈化，減少了檢測(cè)成本；在檢驗(yàn)效率上，QuEChERS前處理過程簡(jiǎn)單、快捷，易于大批量的花生醬樣品檢測(cè)，具有極高的檢測(cè)效率。

4 結(jié)論

本文建立了QuEChERS萃取-液質(zhì)聯(lián)用儀快速檢測(cè)花生醬中黃曲霉毒素B1的方法，試驗(yàn)采用250 mg無水硫酸鎂、100 mg HC-C18、50 mg PSA凈化提取包配方后進(jìn)入液質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)，方法回收率在81.7%～93.5%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.4%～5.6%，檢出限為0.03 μg/kg。該方法具有方便、快捷、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確、回收率高等特點(diǎn)，適用于花生醬等容易受到黃曲霉毒素污染的樣品檢測(cè)與質(zhì)量控制。