基于高通量測序分析鮮檳榔水提液對(duì)于小鼠腸道菌群及免疫指標(biāo)的影響

劉爾卓，吳忠坤，趙紫薇，李宗軍，2，3，王遠(yuǎn)亮，2，3，*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410128；3.國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南長沙410128）

檳榔原產(chǎn)于馬來西亞，是生長在亞洲熱帶地區(qū)的檳榔屬常綠喬木，我國臺(tái)灣、云南與海南等地廣泛種植。作為人類除煙草、酒與咖啡因類飲品之后的第四大類嗜好物，食用人群高達(dá)6億之多。檳榔食用的歷史亦在數(shù)千年之上，因其具有驅(qū)蛔、提神、消食的功效而躋身我國四大南藥。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展和流行病學(xué)研究的深入，檳榔食用對(duì)于人體健康的危害漸漸被人們所認(rèn)識(shí)。這其中長期咀嚼檳榔造成的口腔組織損傷與檳榔堿的生理毒性作用引起了人們的特別注意，因而目前大量的工作主要集中于檳榔咀嚼物（betel quid）和檳榔堿對(duì)于口腔組織細(xì)胞、肝臟等臟器細(xì)胞的生理作用及其機(jī)理的研究上[1-3]。

近年來，研究者們將人體微生物菌群（human microbiome）視為人體另一個(gè)重要的器官。這其中，腸道微生物菌群（intestinal microbiota）結(jié)構(gòu)與比例的改變被認(rèn)為與人體疾病的發(fā)生有著密切的聯(lián)系[4]。檳榔提取液（areca nut extract，ANE）目前已被證實(shí)能促進(jìn)多種人體免疫細(xì)胞炎癥因子的釋放，并可能導(dǎo)致口腔慢性炎癥的發(fā)生[5-6]。然而ANE是否也能作用于腸道微生物使其產(chǎn)生相應(yīng)的改變并促進(jìn)機(jī)體炎癥的發(fā)生，并沒有相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的支撐。目前也鮮有關(guān)于檳榔食用對(duì)于機(jī)體腸道微生物影響的研究。因此，本研究以小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象著重探究ANE對(duì)于腸道微生物的影響，并結(jié)合小鼠免疫指標(biāo)的測定分析其對(duì)于機(jī)體可能產(chǎn)生的作用以及相關(guān)的影響，以期為日后檳榔食用相關(guān)的腸道菌群研究提供一些參考與借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

鮮檳榔：海南省萬寧市。

1.1.2 主要試劑

小鼠白介素-1（interleukin 1，IL-1）、α 腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor α，TNF-α）、免疫球蛋白 A（immunoglobin A，IgA）、IgM、IgG Elisa試劑盒：長沙達(dá)爾鋒生物科技有限公司。

1.2 儀器

冷凍干燥儀（FD-IA-50）：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；高速萬能粉碎機(jī)（QE-500）：浙江屹立工貿(mào)有限公司；超聲儀（JP-030S）：深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；恒溫水浴鍋（DZKW-S-8）：北京市永光明醫(yī)學(xué)儀器有限公司；離心機(jī)（LXJ-IIB）：上海安亭科學(xué)儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-53）：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性昆明小鼠，4周齡（約20 g）：湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)證號(hào)：SCXK（湘）2013-0004，此次實(shí)驗(yàn)遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》中的要求進(jìn)行。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 灌胃液制備

檳榔水提物制備：將洗凈切碎晾干的檳榔塊冷凍干燥36 h，凍干后用萬能粉碎機(jī)粉碎。檳榔粉加入足量蒸餾水，先超聲30min后60℃水浴1h。隨后5000 r/min離心10 min取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。

1.4.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在溫度22℃左右、相對(duì)濕度60%、光照時(shí)長為12 h的小鼠房經(jīng)過1周環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)后隨機(jī)將30只小鼠分為3組（n=10）。各組均每天準(zhǔn)時(shí)灌胃一次，一共進(jìn)行4周，3個(gè)試驗(yàn)組分別如下：

對(duì)照組（F）：給予蒸餾水，灌胃劑量為 0.1 mL/（10 g·d）；鮮檳榔低劑量組（A1）：灌胃 1 X 鮮檳榔水提物，劑量為0.1 mL/（10 g·d），相當(dāng)于70 kg成人每天食用4顆鮮檳榔；鮮檳榔高劑量組（A2）：灌胃5 X鮮檳榔水提物，劑量為0.1 mL/（10 g·d），相當(dāng)于70 kg成人每天食用20顆鮮檳榔。

1.4.3 樣品采集

經(jīng)過4周的灌胃飼養(yǎng)后，將小鼠摘眼球取血，脫頸處死后轉(zhuǎn)移至冰上，快速解剖取其結(jié)腸內(nèi)容物，分別收集于2 mL滅菌離心管中，-80℃保存待檢測。將全血常溫放置30 min，隨后5 000 r/min離心5 min得血清，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 小鼠免疫指標(biāo)測定

將分裝的凍存血清在4℃冰箱預(yù)解凍，拿出置于25℃室溫下，隨后使用相應(yīng)的試劑盒分別測定其中IL-1、TNF-α、IgA、IgG、IgM 的含量。按要求將一系列標(biāo)準(zhǔn)品在450 nm處測定其吸光度，并擬合各成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定各樣品吸光度，并依照標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算其含量。

1.4.5 DNA提取、擴(kuò)增及高通量測序和分析

為提取凍存腸道內(nèi)容物的DNA，針對(duì)16S rRNA基因V3～V4區(qū)合成帶有barcode的特異引物341F（5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'） 和 806R（5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'）并通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行切膠并用凝膠回收試劑盒（Axygen公司）回收。隨后用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）定量檢測PCR產(chǎn)物，使用Illumina PE250文庫構(gòu)建，再利用HiSeq PE250平臺(tái)進(jìn)行高通量測序及相應(yīng)分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本次試驗(yàn)使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析與Duncan檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)多個(gè)試驗(yàn)組間樣本的顯著性。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，視p＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 小鼠采食與生長狀況

不同組小鼠體重變化與進(jìn)食量見表1。

表1 不同組小鼠體重變化與進(jìn)食量Table 1 Weight gain and food intake of mice in different groups

由表1可以看出，3組小鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后A1組與對(duì)照組間體重具有顯著性差異，這種差異直到灌胃結(jié)束后的第4周依然存在。灌胃開始前F組小鼠與A2組小鼠體重?zé)o差異，到第4周時(shí)則是顯著高于A2組，而A1和A2組從灌胃開始到第4周體重?zé)o顯著差異。通過實(shí)驗(yàn)觀察，A1與A2組小鼠在每次灌胃后半小時(shí)內(nèi)會(huì)出現(xiàn)不同程度腹瀉的現(xiàn)象并且A2組較A1組更為明顯，這可能會(huì)影響小鼠的生長。然而分析小鼠灌胃期間各組體重的變化，比較發(fā)現(xiàn)體重增量在各組間并不具有顯著差異。此外，分析各組小鼠第4周前3天進(jìn)食量數(shù)據(jù)顯示組間小鼠攝食量也無差異性。

2.2 免疫與炎癥指標(biāo)

各組小鼠血清促炎癥因子水平見表2。

表2 各組小鼠血清促炎癥因子水平Table 2 Serum pro-inflammatory cytokines level in different groups of mice

腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor α，TNF-α）與白介素1（interleukin 1，IL-1）是重要的促炎癥因子。IL-1在慢性炎癥與組織修復(fù)過程中起著關(guān)鍵的作用，機(jī)體受到感染后巨噬細(xì)胞會(huì)分泌TNF-α，刺激其它促炎因子的產(chǎn)生并導(dǎo)致組織炎癥的產(chǎn)生。由表2可以看出ANE灌胃小鼠兩種炎癥因子水平與對(duì)照組有顯著性差異。在IL-1水平上，F(xiàn)組為227顯著低于A1與A2組的308、324 pg/mL。在血清TNF-α含量上A2組顯著低于A1與F組，相比A1與F組的566 pg/mL和524 pg/mL，其值僅為422 pg/mL。免疫球蛋白即漿細(xì)胞分泌的抗體，能直接與抗原結(jié)合從而有效地清除侵入機(jī)體內(nèi)的微生物。3種小鼠免疫球蛋白的數(shù)據(jù)如圖1所示。

圖1 不同組小鼠3種免疫球蛋白含量的比較Fig.1 Comparison of three immunoglobulin contents in different groups of mice

A1與A2組小鼠IgA、IgG水平?jīng)]有差異，并且顯著低于F組。此外，A2組小鼠IgM水平明顯高于A1與F組。

2.3 小鼠腸道菌群多樣性與主坐標(biāo)分析

基于高通量測序結(jié)果的結(jié)腸腸道菌群Alpha多樣性分析見表3。

表3 基于高通量測序結(jié)果的結(jié)腸腸道菌群Alpha多樣性分析Table 3 Alpha diversity analysis of colonic intestinal flora based on high throughput sequencing results

操作分類學(xué)單元（operational taxonomic unit，OTU）代表了樣品中物種的豐度，結(jié)果分析得出對(duì)照組所含OTU最多為392而A2組僅為266。Shannon與Simpson指數(shù)代表了樣本中菌群的多樣性，較大的Shannon指數(shù)與較小的Simpson指數(shù)可以反應(yīng)更高的菌群多樣性。從表3中能看出，3組中A2的Shannon指數(shù)最小為3.86，A1組最大為5.89。Chao與Ace指數(shù)表征菌群的豐度，其數(shù)值越大表明菌群擁有更高豐度。比較3組數(shù)據(jù)，F(xiàn)與A1組的兩指標(biāo)均明顯高于A2組，其Chao與Ace指數(shù)分別為302與311，這說明高劑量的檳榔提取液顯著降低了小鼠的腸道菌群多樣性。本次測序覆蓋率均為0.99以上，這反映了樣品中序列未被檢測出的概率很低，可以很好的反應(yīng)樣品中微生物含量的真實(shí)情況。

主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA），是通過一系列的特征值和特征向量排序從多維數(shù)據(jù)中提取出最主要的元素和結(jié)構(gòu)。選取貢獻(xiàn)率最大的主坐標(biāo)組合進(jìn)行作圖展示，樣品距離如果越接近就表示物種組成結(jié)構(gòu)越相似。因此群落結(jié)構(gòu)相似度高的樣品傾向于聚集在一起，而群落差異較大的樣品則會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)分開。結(jié)果如圖2所示。

圖2 樣本主坐標(biāo)分析Fig.2 Principal co-ordinates analysis of mice colonic flora data

可以看出A1組與F組的3個(gè)樣本主要集中在右下方，而A2組的3個(gè)樣本則分布于左上方。這表明了A1組與F組菌群結(jié)構(gòu)相似性較高，而A2組樣本則與它們有較明顯的差異。

2.4 小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 門水平菌群結(jié)構(gòu)分析

通過相對(duì)豐度分析，可以找出分類學(xué)水平上占多數(shù)的菌門和菌屬。不同組小鼠結(jié)腸門水平優(yōu)勢菌群見圖3。

圖3 不同組小鼠結(jié)腸門水平優(yōu)勢菌群Fig.3 Dominant flora in the colon of mice from different groups at the phylum level

如圖各實(shí)驗(yàn)組中門水平上主要由酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、Saccharibacteria、變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）與放線菌門（Actinobacteria）組成，它們?cè)诟鹘M中占據(jù)了90%以上的相對(duì)豐度。可以看出灌胃不同劑量的檳榔液對(duì)小鼠門水平上的菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了明顯的改變。其中A2組相較于F組，疣微菌門產(chǎn)生了顯著增加。此外，A1和F組相較于A2組小鼠腸道菌群，其中厚壁菌門與擬桿菌門的比例也有明顯的差別。擬桿菌門與厚壁菌門共同促進(jìn)人體對(duì)于糖類物質(zhì)的分解利用，有研究表明，厚壁菌門與擬桿菌門豐度的比值在肥胖與正常體重個(gè)體中具有明顯差異，這一比例的改變會(huì)影響機(jī)體對(duì)于食物中能量的吸收[7]。A2與A1組相比其中擬桿菌門相對(duì)豐度顯著降低了，這使得A2組具有更高的厚壁菌門與擬桿菌門比例。實(shí)驗(yàn)過程中高劑量灌胃組小鼠腹瀉表現(xiàn)最為明顯，其攝食量數(shù)據(jù)分析結(jié)果并未顯著高于其他兩組，然而體重增加量卻與之無明顯差異，這說明厚壁菌門與擬桿菌門豐度比值增加可能導(dǎo)致了小鼠對(duì)于食物中能量利用率的提高。此外，A2與A1相比具有顯著增加的疣微菌門與放線菌門豐度，這可能與這兩種門下阿克曼菌屬（Akkermansia）與Enterorhabdus菌屬豐度顯著增加有關(guān)。

2.4.2 屬與種水平差異菌群分析

通過Metastat分析，屬水平上相對(duì)豐度前十的菌屬如圖4所示。

圖4 不同組小鼠屬水平優(yōu)勢菌群Fig.4 Dominant colonic flora of mice from different groups at the genus level

比較3組間菌屬相對(duì)豐度的差別，可以看出A2組中阿克曼菌屬與葡萄球菌屬（Staphylococcus）含量相較A1與F組顯著增加了。過往的研究表明阿克曼菌屬是專門分解腸道中黏蛋白的一類細(xì)菌[8]，并且它能在抗生素作用與腸道膳食營養(yǎng)減少的情況下增加其在腸道菌群中相對(duì)豐度[9-10]。小鼠在長期腹瀉的情況下其腸營養(yǎng)受到影響而阿克曼菌可以通過不斷分解黏蛋白提供能量，這可能是其相對(duì)豐度顯著增加的原因之一。除這兩種菌屬顯著增加之外，A2與A1組相比Enterorhabdus菌屬的豐度也有顯著的提高。對(duì)于Zn缺乏（Zn deficiency）患者的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，長期腹瀉會(huì)導(dǎo)致他們腸道Zn吸收功能的紊亂并因此患上鋅缺乏癥[11]。Sauer等[12]的研究表明輕微的Zn缺乏（marginally Zn deficiency，MZD）會(huì)導(dǎo)致小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的顯著改變，并顯著增加其中疣微菌門和Enterorhabdus菌屬的豐度，這與本實(shí)驗(yàn)A2組小鼠長期腹瀉和疣微菌門與Enterorhabdus菌屬豐度顯著增加的現(xiàn)象一致。Gaulke等[13]的試驗(yàn)表明MZD小鼠腸道菌群對(duì)砷暴露的敏感性會(huì)明顯增加，在環(huán)境水平的砷影響下其腸道菌群結(jié)構(gòu)便會(huì)明顯改變，隨著砷濃度的升高，阿克曼菌屬豐度會(huì)顯著增加而毛螺菌科（Lachnospiraceae）的豐度會(huì)顯著減少。Rmalli[14]指出食用檳榔會(huì)增加人體對(duì)于砷、鎘和鉛的暴露，而本試驗(yàn)中A2與A1組相比其中毛螺科菌A2（Lachnospiraceae bacterium A2）豐度顯著降低了。此外，Zn在維持和參與機(jī)體免疫功能方面具有重要的作用。鋅的缺乏會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫能力的紊亂，并促進(jìn)腸道炎性反應(yīng)[15]。而A2較A1組顯著增加的Enterorhabdus菌屬中的菌種如Enterorhabdus mucosicola和Enterorhabdus plexicaudatum都與腸道黏膜炎癥和腸道上皮細(xì)胞屏障功能紊亂相關(guān)。葡萄糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）處理的小鼠因其腸內(nèi)和糞便中與黏膜相關(guān)的微生物菌群與炎性腸病患者中的相似。因而被廣泛用于研究小鼠炎性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）[16]。Berry 等[17]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠腸道中阿克曼菌屬的豐度以及其黏蛋白降解相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子水平都顯著增加了。這也進(jìn)一步說明了A2組小鼠有結(jié)腸炎癥發(fā)生的可能。

葡萄球菌屬與細(xì)菌感染疾病息息相關(guān)，高通量測序發(fā)現(xiàn)A2組中松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）豐度顯著高于其它兩組。在絕大多數(shù)情況下，松鼠葡萄球菌不是直接導(dǎo)致疾病的菌種，其檢出往往發(fā)生在多菌種感染或者其它致病菌感染后[18]。因此，我們推測其含量的顯著增加可能反應(yīng)了腸道屏障功能的減弱與結(jié)腸感染的發(fā)生。值得注意的是，Ganesh等[19]也指出阿克曼菌屬Akkermansia muciniphila菌種通過大量分解腸道黏蛋白削弱了腸道黏膜屏障，并促進(jìn)了傷寒沙門氏菌（Salmonella typhosa）感染的IBD的產(chǎn)生。A2組葡萄球菌屬與阿克曼菌屬同時(shí)顯著高于A1與F組，可能是其小鼠腸道中阿克曼菌屬大量增加的結(jié)果。綜上，高劑量灌胃小鼠可能出現(xiàn)了結(jié)腸炎癥、感染與Zn缺乏的情況，它們與長期腹瀉，腸道屏障功能削弱和砷暴露相關(guān)。

2.5 結(jié)合Alpha多樣性分析和免疫指標(biāo)的討論

小鼠3種免疫球蛋白含量分析結(jié)果顯示，A1組與F組相比IgA、IgG水平顯著降低，這反映出低劑量檳榔水提液具有一定的免疫抑制作用。A2組IgA、IgG水平顯著低于F組，而IgM水平顯著高于F組，這與一種名為高免疫球蛋白M（hyper-immunoglobulin M syndrome，HIGM）的遺傳免疫缺陷癥狀描述相吻合[20]。HIGM病癥產(chǎn)生的原因在于機(jī)體參與B細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、體細(xì)胞高頻突變與DNA修復(fù)機(jī)制的一系列基因發(fā)生了突變[21]。不同的基因突變對(duì)于免疫系統(tǒng)的影響各不相同，并可能會(huì)導(dǎo)致截然不同的感染并發(fā)癥。考慮到本實(shí)驗(yàn)各組小鼠均經(jīng)過了隨機(jī)分組，因此基本排除了小鼠個(gè)體天生免疫缺陷造成如此結(jié)果的可能性。然而無論是否為HIGM，這些結(jié)果都反映了小鼠免疫功能的紊亂。究其原因，可能在于檳榔中的某些化學(xué)成分如檳榔堿通過改變DNA甲基化水平、組蛋白修飾等表觀遺傳修飾途徑，影響了基因的表達(dá)造成了小鼠表觀遺傳的變異，從而產(chǎn)生了與基因突變類似的表型[22]。大量研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳突變可早于遺傳基因突變的發(fā)生，并能促進(jìn)癌癥的產(chǎn)生[23-24]。這些結(jié)果側(cè)面反應(yīng)了高劑量檳榔水提液對(duì)于機(jī)體可能的致癌性作用。

從小鼠兩種促炎細(xì)胞因子IL-1與TNF-α的水平來看，A2組小鼠IL-1水平相較F組顯著增加而TNF-α水平卻顯著低于另外兩組。兩種促炎因子水平的變化截然相反，這也反應(yīng)出高劑量鮮檳榔水提液灌胃組小鼠免疫功能的紊亂。3組菌群的OTU分析表明，A2組小鼠菌群在多樣性指標(biāo)上明顯低于其它兩組。值得注意的是，大量關(guān)于IBD患者腸道菌群的研究顯示具有IBD癥狀的個(gè)體腸內(nèi)菌群的多樣性較低，并且IBD個(gè)體會(huì)出現(xiàn)多種微量元素吸收異常的情況[25]，這進(jìn)一步暗示了A2組小鼠可能出現(xiàn)了結(jié)腸炎癥與Zn缺乏的現(xiàn)象。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明低劑量檳榔水提物對(duì)小鼠免疫功能具有一定的抑制作用，對(duì)于腸道菌群無明顯影響。而攝入高劑量的檳榔水提物能明顯的擾亂小鼠免疫功能以及相關(guān)指標(biāo)，顯著改變其腸道菌群結(jié)構(gòu)，造成長期腹瀉以及可能的結(jié)腸炎癥發(fā)生?？赡艿淖饔脵C(jī)理在于高劑量檳榔水提液中成分如檳榔堿的促腸蠕動(dòng)作用等導(dǎo)致小鼠長期腹瀉，改變腸道菌群、誘導(dǎo)腸道炎癥產(chǎn)生與吸收紊亂，并可能造成微量元素如鋅的缺乏，而諸如鋅之類的微量元素在維持機(jī)體免疫力方面具有重要的作用。此外鮮檳榔水提液中成分眾多，具體是檳榔中的哪些物質(zhì)造成了本實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果還有待后續(xù)針對(duì)性的研究。