基于含量測定與藥效活性相結合的川楝子質量評價

蘇杭，薛倩倩，費程浩，李偉東，殷放宙

(南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇 南京 210023)

川楝子是楝科植物川楝MeliatoosendanSieb.et Zucc.的干燥成熟果實，表面金黃色至棕黃色，微有光澤，別名金鈴子、川楝實、楝實等，是我國沿用已久的理氣藥和驅蟲藥。其主要產于四川、貴州、湖南、湖北等地，尤以四川的川楝子質量最為上乘。川楝子性寒味苦且有小毒，歸肝、小腸、膀胱經，擅于疏肝瀉熱、行氣止痛及殺蟲，用于胸脅、脘腹脹痛，疝氣疼痛及蟲積腹痛等證[1]。現代醫(yī)學研究表明川楝子具有驅蟲、抗菌、抗炎、抗癌、利膽、抗乳腺增生等功效[2-7]。川楝子主要化學成分為三萜類化合物如川楝素(Toosendanin)，其次是紫羅蘭酮型倍半萜的糖苷類化合物。此外，川楝子中尚含有揮發(fā)油、黃酮、脂肪酸、酚酸和多糖等化合物[8-9]。目前認為川楝素是川楝子的主要藥效物質基礎及毒性成分[10]，其具有驅蟲、抗癌、抗菌等多種生物活性。2015版《中國藥典》將川楝素作為評價川楝子質量的唯一指標。異川楝素(Isotoosendanin)是川楝素的同分異構體，具有與川楝素類似的作用，但其毒性遠較川楝素高，故評價川楝子質量時也需考慮其含量?，F代研究表明川楝子具有顯著的抗腫瘤活性，拓展了川楝子的臨床應用價值。但川楝素對腫瘤細胞的選擇性不強，其抑制腫瘤生長的劑量對正常細胞也具有細胞毒性作用，因此，降低川楝素使用劑量，使其能增強腫瘤細胞對靶向抗腫瘤藥物的敏感性是值得深入研究的方向。TRAIL是臨床研究上極具開發(fā)前景的靶向抗腫瘤蛋白質藥物，在多個國家進入臨床研究，它能選擇性誘導腫瘤細胞死亡，而對正常細胞的毒性較小，對多種腫瘤具有明顯的抑制效果，甚至能完全清除某些特定腫瘤類型。但非小細胞肺癌對其敏感性較低，其主要原因在于非小細胞肺癌細胞膜缺乏TRAIL受體的表達。因此，通過低劑量中藥小分子化合物選擇性誘導非小細胞肺癌細胞膜TRAIL受體表達，逆轉非小細胞肺癌細胞對TRAIL的耐受性，增強TRAIL對非小細胞肺癌治療效果，發(fā)揮中西藥結合增效、精準治療腫瘤的優(yōu)勢。課題組前期研究結果表明川楝素能顯著增強非小細胞肺癌細胞膜TRAIL受體表達[11]，進而顯著逆轉非小細胞肺癌細胞對TRAIL的耐受性。而前期實驗室關于川楝素藥效的研究發(fā)現其對于增加抗癌藥物的敏感性有較強的作用。為實現從內在物質及其細胞活性兩方面評價川楝子的質量，本文針對這2種成分采用超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜法(UHPLC-QqQ-MS/MS)測定了川楝子中川楝素及異川楝素的含量，并利用分光測色儀量化川楝子的顏色，同時采用流式細胞儀檢測川楝子提取物對TRAIL誘導的非小細胞肺癌細胞A549凋亡的增效作用，以及對非小細胞肺癌細胞膜死亡受體DR5表達的影響，以期為川楝子的質量控制提供借鑒。

1 材料

AB SCIEX Triple Quad 5500質譜儀配Analyst工作站(美國AB Sciex公司)，LC-30A超高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)，CM-5型分光測色儀(日本柯尼卡美能達有限公司)，Milli-Q3超純水處理系統(美國Millipore公司)，SQP型電子天平(德國Sartorius公司)，KQ-500E型超聲儀(昆山市科導超聲儀器有限公司)，MicroCL 17臺式高速離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)，FACS Calibur及BD Accuri流式細胞儀(美國BD公司)。

10批川楝子樣品分別采自四川、河北等地，經南京中醫(yī)藥大學李偉東教授鑒定為楝科植物川楝MeliatoosendanSieb.et Zucc.的干燥成熟果實。

2 方法與結果

2.1 川楝素及異川楝素的含量測定[12-13]

2.1.1 對照品溶液制備 精確稱取川楝素及異川楝素對照品，分別用甲醇溶解并配制成含川楝素0.394 mg/mL，異川楝素0.440 mg/mL的對照品母液。分別精密吸取各對照品母液適量至10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成含川楝素41.505 μg/mL，異川楝素0.488 μg/mL的混合對照品溶液，并通過甲醇進一步稀釋制備成6種不同濃度水平的標準溶液，用于評估線性。

2.1.2 供試品溶液制備 取川楝子樣品粉末(過4號篩)0.1 g，精密稱定，置于10 mL容量瓶，加甲醇超聲提取30 min(功率250 W，頻率20 kHz)，取出，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液1 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心5 min，轉速為12 000 r/min，取上清液進樣分析。

2.1.3 色譜及質譜條件 色譜條件：Poroshell 120 SB C18柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～1 min，10%～30%B；1～3.5 min，30%～40%B；3.5～6.5 min，40%～75%B；6.5～7 min，75%～95%B；7～7.5 min，95%B)，柱溫35 ℃，流速0.3 mL/min，進樣量為1 μL。

質譜條件：電噴霧離子源(ESI)，負離子模式，離子噴霧電壓-4 500 V，渦輪噴霧溫度550 ℃，噴霧器氣壓55 psi，加熱器氣壓55 psi，碰撞氣壓中等，氣簾氣壓35 psi，1 psi=6.895 kPa，接口加熱器打開，采用多反應檢測模式(MRM)監(jiān)測。川楝素及異川楝素質譜分析條件參數見表1。

表1 川楝素、異川楝素質譜分析條件參數

2.1.4 線性關系考察 精密吸取混合對照品，注入UHPLC-QqQ-MS/MS系統，以峰面積為縱坐標(Y)，進樣量為橫坐標(X)進行回歸，川楝素及異川楝素的線性方程分別為：Y=8 979.74X+86 723.90，r=0.999 1；Y=1 923.97X-2 090.14，r=0.999 6。川楝素及異川楝素分別在259.4～5 188.2，3.1～61.0 ng/mL范圍內呈良好線性關系。

2.1.5 方法學考察 精密吸取川楝子供試品溶液，連續(xù)進樣6次，測得川楝素、異川楝素平均峰面積分別為19 194 583.33、62 593.23，RSD分別為2.79%、1.96%，表明儀器精密度良好。

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精密吸取川楝子供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h進樣，測得川楝素、異川楝素的平均峰面積分別為18 972 039.16、62 532.29，RSD分別為2.32%、1.22%，表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定性良好。

分別取6份川楝子粉末0.1 g，精密稱定，制備供試品溶液并進樣分析，測得川楝素、異川楝素的平均含量分別為1.024、0.017 mg/g，RSD分別為2.43%、1.68%，表明該方法重復性良好。

取已知含量的同一批川楝子粉末各5份，每份0.05 g，精密稱定，準確加入與樣品中含量等量的川楝素及異川楝素對照品，制備供試品溶液并進樣分析，川楝素及異川楝素的平均加樣回收率分別為102.3%、101.4%，RSD分別為2.28%、2.23%。

2.1.6 樣品含量測定 取各批川楝子粉末(過4號篩)0.1 g，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.3”項條件下進樣，計算含量，每批樣品平行測定3次。由于川楝素和異川楝素結構中具有半縮醛結構，始終有2個互變異構體存在，在色譜圖中顯示2個色譜峰，故以其各自2個峰面積之和定量代入線性回歸方程，計算含量。具體結果見圖1、表2。

2.2 顏色檢測

2.2.1 檢測條件 光源為脈沖氙燈，光源標準觀察角度8°，測量口徑∮30 mm，測量波長范圍為360～740 nm，重復性標準偏差△E*ab在0.07以內，采用SCI反射光模式進行測定[14]。

川楝子樣品粉碎(過4號篩)，各取2 g放入檢測皿中，重復測定色度3次，以均數為最終測定結果。

2.2.2 方法學考察 取同一批次川楝子樣品粉碎后進行測色方法的相應考察。連續(xù)采集同一份樣品的顏色值6次，測得L*、a*、b*的平均值分別為68.89、5.93、27.00，RSD分別為0.01%、0.13%、0.07%，表明該方法精密度良好。

取同一份川楝子樣品分別于0、2、6、8、10、12、18、24、36、48 h進行顏色檢測，測得L*、a*、b*的平均值分別為69.37、5.96、26.97，RSD分別為0.33%、0.49%、0.15%，表明樣品在48 h內檢測結果穩(wěn)定。

取6份川楝子樣品分別置于檢測皿中，進行顏色檢測，測得L*、a*、b*的平均值分別為69.67、5.94、26.94，RSD分別為0.19%、0.58%、0.22%，表明該方法重復性良好。

2.2.3 樣品檢測 分別取10批川楝子樣品粉碎后進行顏色檢測，結果見表2。

表2 10批川楝子樣品的含量及顏色測定結果

2.3 川楝子對TRAIL誘導的非小細胞肺癌細胞凋亡的影響

2.3.1 供試品制備 取不同產地川楝子飲片10 g，粉碎(過4號篩)，加入乙醇回流提取3次，合并提取液，揮去乙醇，將浸膏冷凍干燥，加入100 mL二甲基亞砜(DMSO)溶解，濾去不溶物，將澄清透明含藥DMSO溶液按1∶1 000(合生藥量0.1 mg/mL)加入細胞培養(yǎng)液中，100 nmol/L川楝素標準溶液作為陽性對照。

2.3.2 細胞培養(yǎng)與藥物處理 將非小細胞肺癌細胞A549接種于12孔板，待細胞生長至融合度75%左右，加入TRAIL(10 nmol/L)與不同批次川楝子提取液處理24 h，收集細胞，進行流式細胞儀檢測細胞凋亡。

2.3.3 Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡 采用Annexin V/PI雙染法檢測A549細胞凋亡。將12孔板細胞用PBS清洗，加入胰酶消化，細胞培養(yǎng)液終止消化，離心，棄上清，用Binding buffer清洗細胞，再次離心，用含有AnnexinV-FITC的Binding buffer重懸細胞，冰上暗處孵育15 min，加入碘化丙啶(PI)，通過流式細胞儀(FCM)檢測細胞凋亡率。

2.3.4 細胞凋亡結果 結果見圖2，單用TRAIL組非小細胞肺癌細胞A549凋亡不明顯，表明A549細胞對TRAIL相對耐受，陽性對照藥川楝素能顯著增強A549細胞對TRAIL的凋亡敏感性?；诖?，發(fā)現不同批次的川楝子提取物均能顯著增強A549細胞對TRAIL的凋亡敏感性，但增敏程度有差異。

2.4 流式細胞儀測定非小細胞肺癌細胞膜死亡受體的表達

2.4.1 細胞處理 將A549細胞接種于12孔板中，待細胞匯合度達到75%左右時，加入不同產地川楝子提取物處理細胞12 h，處理后胰酶消化收集細胞，預冷的PBS洗滌細胞，5%的BSA冰上封閉細胞30 min，PBS洗滌，棄上清。加入DR5一抗，并與細胞一起于冰上孵育2 h，離心，加入FITC熒光標記二抗，冰上孵育1 h后離心，棄上清。將細胞沉淀用預冷的PBS重懸，流式細胞儀FL1通道檢測細胞膜DR5表達。

2.4.2 結果 結果見圖3，A549細胞膜(對照組)表面TRAIL受體DR5表達較低，這是A549細胞對TRAIL誘導細胞凋亡不敏感的重要原因，陽性對照藥川楝素能顯著增強細胞膜DR5表達(52.3%)。不同產地來源的川楝子提取物均能不同程度地刺激A549細胞膜DR5受體表達。

3 討論

本實驗采用UHPLC-QqQ- MS/MS質譜掃描確定了川楝素的特征離子對m/z573→531和m/z573→425，異川楝素的特征離子對m/z573→513和m/z573→531，并優(yōu)選響應強度較高的離子對進行定量分析。本方法穩(wěn)定性好、靈敏度高、分析時間短，能快速、準確地對川楝子中川楝素、異川楝素進行含量測定。同時采用CIE L*a*b*顏色空間實現了對川楝子的顏色值量化。本研究發(fā)現不同批次的川楝子提取物均能顯著增強A549細胞對TRAIL的凋亡敏感性與TRAIL受體DR5的表達，該有效成分與藥效活性相結合實驗結果表明，川楝素與異川楝素含量能有效地用于評價川楝子飲片質量。

藥效活性結果發(fā)現來自河北、安徽、云南及四川(2，6)川楝子樣品在增強A549細胞對TRAIL的凋亡敏感性及刺激A549細胞膜DR5受體表達作用較強，此結果與飲片內在特征成分川楝素、異川楝素含量基本一致。但由于川楝素是川楝子的毒性成分之一，2015版《中國藥典》規(guī)定其含量應控制在0.04%～0.20%，藥效作用較強的幾批樣品含量均已超出目前規(guī)定的上限，剩余的4批四川(1，3～5)樣品符合藥典規(guī)定。來自河北、安徽、云南及四川(2，6)川楝子樣品雖不符合藥典規(guī)定，但由于川楝素與異川楝素含量較高，在提取分離川楝素等活性成分方面具有較好的應用價值。此外，與異川楝素相比較，川楝素的含量在決定川楝子增效TRAIL抗非小細胞肺癌中發(fā)揮更重要作用。因此，評價中藥飲片質量一定要結合具體的藥效與功能主治，根據其治療用途選擇合適的有效成分，制定相應質量標準。

川楝子成分復雜，不能以單個成分含量判斷產品的整體質量，后期擬采用多成分同時測定的方式建立更全面的評價方式；另外，川楝子有小毒，常炮制后用藥，后期可以進一步研究川楝子不同炮制品顏色及成分含量的變化，全面地說明炮制對樣品的影響，為中藥川楝子的質量控制提供實驗依據。