廣地龍?zhí)禺愋砸镄蛄械脑O(shè)計及其混偽品的鑒別

張前程，文紅梅，劉娜，袁琪，劉睿，崔小兵，李松，陳盛君

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.江陰天江藥業(yè)有限公司，江蘇 江陰 214434)

地龍為常用動物類中藥，2015年版《中國藥典》收載地龍為鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretimaaspergillum(E. Perrier)、通俗環(huán)毛蚓Pheretimavulgaris(Chen)、威廉環(huán)毛蚓Pheretimaguillelmi(Michaelsen)或櫛盲環(huán)毛蚓Pheretimapectinifera(Mkhaeken)的干燥體。前一種習(xí)稱“廣地龍”，后三種習(xí)稱“滬地龍”[1]。地龍具有清熱定驚，通絡(luò)，平喘利尿的功效[2-4]。現(xiàn)代研究表明，地龍還有降壓[5]、抗癌[6-9]、抗凝血[10]、抗氧化[11-13]、抗肝纖維化[14]等作用。市場上流通的地龍藥材主要為廣地龍，廣地龍體長、藥材加工精細(xì)，藥理活性顯著，臨床應(yīng)用廣泛[15]。以其為原料藥的中成藥有40多個品種，還有廣地龍配方顆粒及廣地龍湯劑等[16]。廣地龍藥材與相近物種因形態(tài)相似，容易造成品種混雜和摻假現(xiàn)象。廣地龍藥材的真?zhèn)侮P(guān)系著臨床用藥的有效性和安全性。因此，有必要建立快速準(zhǔn)確的特異性物種鑒別方法，以控制廣地龍藥材的質(zhì)量。DNA條形碼分子鑒定法是利用基因組中一段公認(rèn)的、相對較短的DNA序列來進(jìn)行物種鑒定的一種分子生物學(xué)技術(shù)，是傳統(tǒng)形態(tài)鑒別方法的有效補(bǔ)充[17-18]。在動物藥的鑒別中大多采用通用引物COⅠ序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增測序，如龐中化等[19]通過COⅠ序列對全蝎及其混偽品進(jìn)行DNA條形碼鑒別；賈靜等[20]采用COⅠ序列和ITS序列分別鑒別家蠶和白僵菌。但COⅠ序列不能直接作為特異性引物來區(qū)分藥材品種，必須對所有的樣品進(jìn)行測序再進(jìn)行聚類分析構(gòu)建進(jìn)化樹，成本較高，時間較長。通過設(shè)計特異性引物，可省去對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序、構(gòu)建進(jìn)化樹等復(fù)雜的步驟，操作簡便快捷，已用于多種動物藥品種的基原鑒定。趙玉洋等[21]通過比較麝香及其混偽品的COⅠ序列，設(shè)計出一對約180 bp的麝香微型DNA條形碼鑒別引物，對麝香及其混偽品進(jìn)行測序鑒定；劉富艷等[22]通過比較海龍及其混偽品的COⅠ基因序列差異，根據(jù)變異位點設(shè)計出刁海龍、尖海龍及擬海龍的特異性鑒別引物，鑒別海龍及其混偽品；陳維明等[23]用12SrRNA序列鑒定了廣地龍及其近緣品種；田娜等[24]建立了多重位點特異性PCR鑒別方法區(qū)分不同地龍品種。本文前期實驗中考察了COⅠ、12SrRNA和16SrRNA 3對引物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)COⅠ序列擴(kuò)增出的條帶更為清晰，利用COⅠ序列對廣地龍、滬地龍及其易混品(如海南大腔蚓)等進(jìn)行PCR擴(kuò)增和雙向測序，通過比對廣地龍及其混偽品的DNA測序結(jié)果，尋找廣地龍的變異位點，設(shè)計出廣地龍的特異性引物，用于廣地龍及其混偽品的鑒定，為廣地龍藥材的質(zhì)量評價提供方法。

1 材料

1.1 儀器

PCR擴(kuò)增儀(伯樂公司，型號：AL110394)；電泳儀(伯樂公司，型號：041BR170879)；浸沒式瓊脂糖水平電泳槽[生工生物(上海)股份有限公司，RDY-SP6]；化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(伯樂公司，型號：721BR10360)。

1.2 試藥

瓊脂糖(批號：4241055)；水為屈臣氏超純水；Ⅰ型核酸染料(批號：20181012)；DNA Marker(100～2 000 bp)(批號：E905KA9473)；2×Taq PCR Master Mix(批號：20190926)；動物DNA基因組提取試劑盒(TSP 201-200，020190120)。通用引物COⅠ以及設(shè)計的特異性引物PA-f/PA-r，由南京擎科醫(yī)藥科技有限公司合成。

1.3 地龍樣品的采集和品種鑒定

地龍樣品及其偽品共計37批次，其中廣地龍(參環(huán)毛蚓)14批，滬地龍(通俗環(huán)毛蚓)6批，滬地龍(威廉環(huán)毛蚓)4批，滬地龍(櫛盲環(huán)毛蚓)3批，海南地龍(大腔蚯蚓)6批。其他的動物品種水蛭，蜈蚣，僵蠶和蟬蛻各1批。

廣地龍購于廣東、廣西，呈長條狀薄片，彎曲，邊緣略卷，長15～25 cm，寬1～2 cm。全體具環(huán)節(jié)，背部棕褐色至紫灰色，腹部淺黃棕色；第14～16環(huán)節(jié)為生殖帶，寬0.8～1.5 cm。

滬地龍藥典上收載有3種品種，長8～15 cm；寬0.5～1.5 cm。全體具環(huán)節(jié)，背部棕褐色至黃褐色，腹部淺黃棕色；第14～16環(huán)節(jié)為生殖帶，較光亮。第18環(huán)節(jié)有一對雄生殖孔。通俗環(huán)毛蚓較常見，購于上海、安徽、河南等地，原動物灰青色，背中線深青色，性狀鑒定顯示其雄交配腔能全部翻出，呈花菜狀或陰莖狀。威廉環(huán)毛蚓購于宿遷泰通地龍養(yǎng)殖基地，原動物性狀鑒定顯示其雄交配腔孔呈縱向裂縫狀。櫛盲環(huán)毛蚓采集于上海閔行校區(qū)，原動物性狀鑒定顯示其雄生殖孔內(nèi)側(cè)有1或多個小乳突。

大腔蚓購于海南，呈長條狀薄片，彎曲，邊緣略卷，長15～35 cm，寬1.0～2.5 cm。全體具環(huán)節(jié)，背部棕黑色，腹部淺黃棕色；第14～16環(huán)節(jié)為生殖帶，寬1.6～2.2 cm，呈棕黑色。

所有樣品由南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室陳建偉教授鑒定，保存于南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥物分析實驗室。樣品信息詳見表1。

表1 地龍及其混偽品的樣品信息表

2 方法

2.1 DNA提取

取已用乙醇擦拭的地龍藥材，打粉過五號篩，稱取藥材粉末約40 mg，使用動物DNA基因組提取試劑盒(TSP 201-200，020190120)提取地龍的總DNA。將提取的DNA模板-20 ℃保存。

2.2 通用引物COⅠ序列的PCR擴(kuò)增及測序

對收集的不同動物藥地龍、蜈蚣、水蛭、僵蠶及蟬蛻進(jìn)行COⅠ序列的PCR擴(kuò)增。COⅠ序列正向引物L(fēng)CO1490：5'-GGTCAACAAATCAAGATATTGG-3'，反向引物HCO2198：5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'。PCR反應(yīng)體積25 μL，體系包含2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，正向引物L(fēng)CO1490(10 μmol/L) 1 μL，反向引物HCO2198(10 μmol/L)1 μL，超純水H2O 8.5 μL，模板(基因組DNA 50 ng)2 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃變性1 min，55 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸1 min(進(jìn)行35個循環(huán))；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳儀參數(shù)設(shè)置：電壓140 V，電泳時間90 min。

對各批次廣地龍以及其他品種地龍進(jìn)行測序，委托南京擎科醫(yī)藥科技有限公司完成。

2.3 廣地龍?zhí)禺愋砸锏脑O(shè)計和PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化

根據(jù)上述測序結(jié)果分析廣地龍及其混偽品COⅠ序列的擴(kuò)增產(chǎn)物，同時使用引物設(shè)計軟件(Snapgene軟件)進(jìn)行序列比對，尋找正品廣地龍及其混偽品的COⅠ基因序列擴(kuò)增產(chǎn)物的差異，在變異位點較多的基因片段處，設(shè)計廣地龍的特異性鑒別引物。引物組由南京擎科醫(yī)藥科技有限公司合成。

對影響PCR鑒別特異性的主要因素如退火溫度(50、55、60 ℃)，循環(huán)次數(shù)(32、35、38)，DNA模板量(3、5、10、30、50、100 ng)以及Taq DNA聚合酶用量(0.625、1.25、2.50 U)進(jìn)行考察。確定PCR擴(kuò)增條件后，利用設(shè)計的廣地龍鑒別引物對收集的藥材進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒別廣地龍及其混偽品，驗證該引物對的特異性。

3 結(jié)果

3.1 通用引物COⅠ序列擴(kuò)增結(jié)果

使用動物DNA基因組提取試劑盒提取廣地龍及其混偽品滬地龍、海南地龍以及其他物種蟬蛻、蜈蚣等藥材的DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到PCR擴(kuò)增電泳圖，見圖1，擴(kuò)增效果較好，條帶較亮，沒有拖尾現(xiàn)象，COⅠ序列擴(kuò)增產(chǎn)物均在750 bp左右。通用引物不僅不能區(qū)分不同品種的地龍，且無法鑒別地龍和其他動物如蜈蚣，蟬蛻等。

3.2 廣地龍?zhí)禺愋砸锏拇_定

經(jīng)測序采用引物設(shè)計Snapgene軟件，發(fā)現(xiàn)正品廣地龍及其混偽品的COⅠ基因序列擴(kuò)增產(chǎn)物的差異，差異最顯著的基因片段見圖2。設(shè)計得到的廣地龍?zhí)禺愋砸餅镻A-f/PA-r，見表2。

表2 廣地龍鑒別引物

3.3 PCR擴(kuò)增條件的確定

使用設(shè)計的特異性引物PA-f/PA-r進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度在50～60 ℃的范圍內(nèi)，廣地龍樣品均可以獲得574 bp左右的條帶，滬地龍通俗環(huán)毛蚓、威廉環(huán)毛蚓、櫛盲環(huán)毛蚓及大腔蚓均呈陰性，為確保退火溫度的穩(wěn)定，選擇55 ℃為適宜的退火溫度，見圖3A。在此基礎(chǔ)上，考察循環(huán)次數(shù)對PCR鑒別的影響，設(shè)置循環(huán)次數(shù)為32、35、38，結(jié)果顯示廣地龍均可以獲得約574 bp的條帶，其中循環(huán)35次條帶更清晰，滬地龍3個品種及大腔蚓均未獲得條帶，見圖3B，故選擇循環(huán)次數(shù)為35次。進(jìn)一步對PCR反應(yīng)的DNA模板量進(jìn)行考察，DNA模板量在3～100 ng廣地龍均可以擴(kuò)增出特異性條帶，滬地龍3種品種及大腔蚓均呈陰性，見圖3C～D。由圖可見，隨著DNA模板量的增加，條帶的亮度增加，其中3、5 ng的擴(kuò)增帶較弱，適合的DNA模板量為10～100 ng。對25 μL PCR反應(yīng)體系中的Taq聚合酶的用量進(jìn)行考察，Taq聚合酶量為0.625～2.5 U，3個酶濃度下廣地龍都可獲得清晰、明亮的條帶，其余樣品則呈陰性，見圖3E。為了節(jié)約成本，最終確定0.625 U為25 μL PCR體系Taq聚合酶的加入量。

3.4 廣地龍?zhí)禺愋砸锏蔫b別結(jié)果

確定PCR擴(kuò)增條件以后對37個批次地龍藥材和混偽品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用廣地龍?zhí)禺愋砸颬A-f/PA-r對14批次廣地龍(7批廣西產(chǎn)和7批廣東產(chǎn))進(jìn)行擴(kuò)增，PCR鑒別圖如圖4所示；對4批廣地龍、6批通俗環(huán)毛蚓和4批威廉環(huán)毛蚓進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖5；對3批廣地龍、3批櫛盲環(huán)毛蚓、6批大腔蚓，其他動物(水蛭、蜈蚣、僵蠶、蟬蛻等)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR鑒別結(jié)果見圖6。

由圖4可見，14批廣地龍樣品均可擴(kuò)增出條帶，序列長度在574 bp左右，廣西產(chǎn)和廣東產(chǎn)的地龍條帶整齊、清晰，未見明顯差異。由圖5可見，只有4批廣地龍樣品呈陽性，可以擴(kuò)增出清晰條帶，大小約574 bp，6批通俗環(huán)毛蚓和4批威廉環(huán)毛蚓地龍樣品呈陰性，無條帶擴(kuò)增；由圖6可見，只有3批廣地龍可以擴(kuò)增出條帶，3批櫛盲環(huán)毛蚓、6批大腔蚓地龍樣品呈陰性，無條帶擴(kuò)增，水蛭、蜈蚣、僵蠶、蟬蛻其他動物樣品也呈陰性。實驗結(jié)果表明，設(shè)計的特異性引物可以區(qū)分廣地龍及3種滬地龍，也可以區(qū)分廣地龍及其他動物品種(蜈蚣、僵蠶、水蛭等)。

4 討論

臨床入藥的地龍品種大多是廣地龍，但是目前市場上地龍品種繁雜，常有廣地龍的偽品混入其中，影響臨床用藥。地龍品種的傳統(tǒng)鑒定受到加工方式及程度的影響，性狀鑒定要求藥材保存完好，藥材破損情況下，性狀鑒別非常困難，此外還需專業(yè)人員和專業(yè)的儀器設(shè)備才能鑒定。本文設(shè)計廣地龍的特異性引物，進(jìn)行廣地龍的DNA條形碼鑒定，對藥材保存要求較低，而且藥材用量很少，并且對藥材部位沒有要求，能提出DNA即可鑒定出是否為廣地龍品種。廣地龍品種的確定，為地龍臨床用藥提供了有效的方法。

目前動物藥DNA條形碼鑒別中，使用的基因片段有COⅠ、16SrRNA和12SrRNA序列，其中COⅠ序列最為常見。在預(yù)實驗中，對COⅠ、16SrRNA和12SrRNA 3對引物都進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)使用COⅠ序列擴(kuò)增的條帶比16SrRNA和12SrRNA序列更清晰。故本文選擇COⅠ序列作為地龍藥材的擴(kuò)增引物。本文在COⅠ序列的基礎(chǔ)上擴(kuò)增了廣地龍及混偽品，并對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序，將廣地龍及混偽品的DNA序列進(jìn)行比對，找出差異位點，設(shè)計了廣地龍的特異性引物PA-f/PA-r。引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。本實驗設(shè)計的廣地龍?zhí)禺愋砸颬A-f/PA-r長度為25 bp左右，G+C含量約50%，避免了因G+C太少擴(kuò)增效果不佳或G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶的情況。引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第2個堿基，嚴(yán)格配對，避免了因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。

酶是PCR擴(kuò)增的關(guān)鍵因子，酶質(zhì)量的好壞，濃度的大小直接影響著擴(kuò)增的效果。本文選擇常用的Taq聚合酶，具有耐高溫(95 ℃)的特性，酶濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少，通過對酶量的考察，確定25 μL PCR反應(yīng)體系中酶的用量為0.625 U。DNA模板的濃度直接影響擴(kuò)增的重復(fù)性、特異性和擴(kuò)增的產(chǎn)量。過量的模板導(dǎo)致錯配機(jī)率增高、非特異性增大，模板太少，擴(kuò)增產(chǎn)物重復(fù)性不佳、難以檢出。通過對DNA模板量的考察，最適宜的DNA模板量為10～100 ng。此外，對影響PCR特異性鑒別的其他重要因素退火溫度和循環(huán)次數(shù)等進(jìn)行了考察，確定了PCR反應(yīng)適宜的條件范圍，最終建立了廣地龍?zhí)禺愋訮CR鑒別方法。

本論文設(shè)計得到的引物PA-f/PA-r具有較好的特異性，可快速、準(zhǔn)確地鑒別廣地龍基原的真實性，可以區(qū)分廣地龍和3種品種的滬地龍，也可以準(zhǔn)確鑒別廣地龍和偽品地龍(海南大腔蚓)及其他動物品種(蜈蚣、僵蠶、水蛭等)，為廣地龍品種鑒定提供有效方法。