正五聚蛋白3和肝素結(jié)合蛋白在肺結(jié)核診斷中的價值

邢志偉 高艷軍 張聰瑤 朱梅玲 張建武

結(jié)核病是最常見并可致命的一種傳染病，盡管目前全球在醫(yī)療技術方面取得了新進展，但結(jié)核病仍然是公共衛(wèi)生方面的一項重要挑戰(zhàn)[1]。世界衛(wèi)生組織報告2016年新增結(jié)核病1 100萬例，死亡140萬例[2]。由于結(jié)核病診斷方法的局限性，所以缺乏最佳診斷方法，臨床醫(yī)生仍然面臨著早期診斷的困惑[3]。結(jié)核病的早期檢測在控制疾病和防止感染蔓延方面具有重要作用。正五聚蛋白(pentraxin，PTX)3屬于機體免疫系統(tǒng)保守的多聚體蛋白超家族，它的成員包括短五聚體蛋白和長五聚體蛋白。所有這些蛋白質(zhì)在先天免疫中起著關鍵作用，通常被認為是急性期免疫蛋白，它們對機體的調(diào)節(jié)作用有多種，如炎癥、血管生成、腫瘤生成、細胞粘附等[4]。相關文獻表明，PTX3在先天性病原體抵抗和炎癥調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用[5]， PTX3也是一種重要的血清學標志物，包括心血管疾病、敗血癥和癌癥在內(nèi)的多種臨床炎癥和感染條件下，能迅速反映局部組織的炎癥和損傷[6]。肝素結(jié)合蛋白(heparin binding protein，HBP)儲存在中性粒細胞的分泌顆粒和嗜苯胺藍顆粒中，在細胞激活時釋放。HBP是一種多功能促炎介質(zhì)，例如激活免疫細胞，具有廣泛的抗菌活性，并誘導血管滲漏。血漿HBP被認為是一種評價嚴重膿毒癥和膿毒性休克進展的預測因子[7]。細菌性腦膜炎[8]時腦脊液和尿路感染[9]時尿液中的HBP水平也升高，這表明HBP可作為指示細菌感染的生物標記物。最近，HBP被認為是支氣管肺泡灌洗液中檢測肺移植受者肺部感染的重要生物標記物[10]。本研究測定活動性肺結(jié)核患者，潛伏性結(jié)核感染者以及健康對照者外周血中PTX3和HBP的表達水平，探討它們對肺結(jié)核診斷的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 (1)肺結(jié)核組：收集2017年3～12月在我院結(jié)核科住院的初治肺結(jié)核患者125例，其中男77例，女48例；年齡21～63歲，平均年齡(40.2±11.7)歲。肺結(jié)核診斷參照中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準(WS288-2017)，以病原學實驗室檢查為主，結(jié)合胸部影像學、流行病學和臨床表現(xiàn)，以及其他相關輔助檢查和鑒別診斷進行綜合分析作出的診斷。肺結(jié)核患者根據(jù)影像學診斷，分為肺部有空洞組31例，無空洞組94例；肺結(jié)核患者給予標準化治療2HRZE/4HR抗結(jié)核方案治療6個月。(2)潛伏感染組：收集同期潛伏性結(jié)核感染109例，其中男51例，女58例；年齡22～65歲，平均年齡(41.3±13.6)歲。細菌學檢測即痰涂片及培養(yǎng)確定陰性，而PPD試驗陽性，有結(jié)核病接觸史，結(jié)合臨床癥狀及影像學表現(xiàn)無肺結(jié)核特征。(3)對照組：來自同期進行體檢的健康者112例，其中男65例，女47例；年齡26～60歲，平均年齡(38.9±10.5)歲。3組間年齡和性別比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有研究對象排除糖尿病、高血壓、自身免疫性疾病等，且均無合并其他傳染性疾病如病毒性肝炎、HIV等感染，均為漢族。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，收集標本已和所有患者及志愿者簽署書面知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 (1)總RNA提取試劑Trizol LS購自Invitrogen公司。(2)聚合酶鏈(PCR)反應體系購自寶生物工程(大連)有限公司。(3)PCR上下游引物購自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司。(4)PCR擴增儀(LightCycler 480Ⅱ，Roche公司)；人HBP的ELISA試劑盒(杭州中翰盛泰生物技術有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 標本收集：研究對象空腹采集靜脈血，收集在EDTA抗凝管， 3 000 r/min離心10 min，分離的血漿可置于-80℃保存。肺結(jié)核組標本收集在抗結(jié)核治療前、抗結(jié)核治療3個月及6個月后采血。

1.3.2 總RNA提取：向分離所得的部分血漿中加入Trizol LS試劑，體積比為1∶3，操作步驟按說明書進行提取總RNA，最后室溫干燥RNA沉淀，加入無RNase的水溶解RNA，放-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 RT-PCR實驗檢測PTX3的mRNA水平：RNA提取后首先反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，嚴格按試劑盒說明書提供的步驟進行操作。以反應產(chǎn)物cDNA為模板進行PCR擴增，體系包括1 μl cDNA模板，2 μl的10倍PCR緩沖液(含Mg2+)，0.3 μl的TaqDNA聚合酶(5 U/μl)，0.5 μl dNTP(10 mmol/L)，上、下游引物各0.5 μl(10 mmol/L)。PTX3的上游引物是 5’-CGTTT

GCGGTTAGGAGTATTC-3’ 和下游引物5’- CAAAACG

TCGTCCGTAACTTA -3’,擴增片段長度為103 bp， GAPDH上游引物5’- GACCACTTTGTCAAGCTCATTT

CC-3’，下游引物5’-GTGAGGGTCTCTCTCTTCC- TCTTGT- 3’,擴增片段長度為323 bp。PCR擴增條件包括95℃預變性10 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)后72℃延伸10 min。取擴增產(chǎn)物，直接加樣于1.2%瓊脂糖凝膠加樣孔中，80V電壓，電泳30 min，用凝膠成像系統(tǒng)拍攝分析各電泳條帶，mRNA表達相對值等于目的片段光密度值/GAPDH光密度值。

1.3.4 ELISA實驗檢測HBP的表達：操作按試劑盒說明書進行，根據(jù)酶標儀的吸光度換算HBP的含量。

2 結(jié)果

2.1 3組PTX3和HBP的表達 采用RT-PCR檢測3組PTX3的mRNA表達，潛伏感染組的表達較對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，肺結(jié)核組PTX3的表達較潛伏感染組和對照組表達均明顯升高(P<0.01)；采用ELISA檢測3組HBP，顯示肺結(jié)核組較潛伏感染組和對照組表達均有顯著升高(P<0.01)。見表1。

組別PTX3 (mRNA)HBP(ng/ml) 對照組(n=112) 0.83±0.31?15.06±2.94?潛伏感染組(n=109)0.93±0.33?16.28±4.49?肺結(jié)核組(n=125) 2.18±0.9924.90±6.02F值142.15155.66P值0.0000.000

注：與肺結(jié)核組比較，*P<0.05

2.2 PTX3和HBP的表達與肺結(jié)核患者肺部空洞的關系 肺結(jié)核患者中有空洞組中PTX3和HBP的表達均顯著高于無空洞組，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.01)。見表2。

組別PTX3(mRNA)HBP(ng/ml)有空洞組(n=31)3.27±0.7631.65±3.77無空洞組(n=94)1.82±0.7822.70±4.84t值9.069.41P值0.0000.000

2.3 肺結(jié)核患者治療前后PTX3和HBP表達比較 所有初治肺結(jié)核患者均接受規(guī)范化抗結(jié)核治療3個月及6個月，與治療前相比，治療 3 個月和6 個月PTX3和HBP表達水平均顯著下降，所有患者抗結(jié)核治療效果良好；且接受治療6個月組與接受治療3個月組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表3。

時間PTX3(mRNA)HBP (ng/ml)治療前 2.18±0.9924.90±6.02治療3個月1.29±0.45?18.93±4.91?治療6個月0.98±0.25?#16.95±4.38?#F值 115.9680.71P值0.0000.000

注：與治療前比較，*P<0.05；與治療3個月比較，#P<0.05

2.4 受試者工作曲線(ROC)評估PTX3和HBP的診斷效能 繪制肺結(jié)核組的ROC曲線，PTX3和HBP有較好的診斷價值：AUC 顯示為0.855和0.849，以1.47為臨界值，PTX3鑒別肺結(jié)核患者的敏感度和特異度分別為 72.8%和87.9%；以 18.68 ng/ml為臨界值，HBP鑒別肺結(jié)核患者的敏感度和特異度分別為82.4%和71.9%。見圖1。

3 討論

五聚體蛋白是一個發(fā)育保守的多聚體蛋白超家族，其特征是在其羧基末端存在一個保守的8個氨基酸長序列。根據(jù)其N端氨基酸的長度主要分為短五肽和長五肽，短五肽和長五肽具有不同的蛋白質(zhì)大小，在不同的基因啟動子的影響下由不同的基因合成。PTX3是一種多功能蛋白，具有多聚體結(jié)構和保守域，與其他長五聚蛋白一樣，PTX3蛋白包含一個獨特的N末端區(qū)域和一個與短戊聚糖同源的C末端區(qū)域，可由多種炎癥相關刺激誘導。PTX3是一種急性期反應物，對原發(fā)性促炎信號和微生物識別反應迅速產(chǎn)生，PTX3作為一種可溶性模式識別受體，可與多種病原體/損傷相關分子模式結(jié)合，在先天免疫系統(tǒng)中起著重要作用，可作為一種激活經(jīng)典補體途徑的調(diào)理素[11,12]。

圖1 PTX3和HBP診斷肺結(jié)核的ROC曲線

它的多重作用可以被認為是位點特異性的，因為它的產(chǎn)生發(fā)生在多種細胞類型中，包括內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞、肝細胞和單核細胞等。PTX3與多種免疫相關性疾病有密切關系，發(fā)揮多種生物學反應，參與機體的免疫防御、炎性反應、血管重塑等。有實驗表明急慢性炎癥疾病中外周血 PTX3 水平迅速增加，且存在時間持久[13]。PTX3對病原體的識別等方面有重要的調(diào)節(jié)作用，是宿主防御某些感染的關鍵成分，在膿毒癥患者血清中，PTX3濃度明顯高于對照組，PTX3水平與膿毒癥嚴重程度相關，可以有助于膿毒癥病情預測以及膿毒癥和膿毒性休克的鑒別診斷[14]。Azzurri等[15]探討了PTX3在感染疾病中作為生物標記物的作用，新診斷的結(jié)核病患者中PTX3水平高于健康家庭對照和社區(qū)對照，在治療方案結(jié)束時，受試者對治療反應顯著降低了PTX3水平，而治療失敗的患者，PTX3水平進一步升高，表明該蛋白的檢測可能有助于監(jiān)測疾病活動和治療效果。

HBP是新近被發(fā)現(xiàn)的炎癥標志物之一，HBP一旦釋放，表現(xiàn)出強烈的促炎活性。在感染部位，HBP的化學作用是吸引和激活更多的中性粒細胞，也包括T淋巴細胞和單核細胞。HBP與單核細胞β2整合素結(jié)合，啟動細胞內(nèi)信號傳導過程，引起趨化因子和促炎介質(zhì)的釋放。HBP通過促進巨噬細胞對病原體的識別和吸收，有助于抗菌藥物的清除。此外，HBP通過與管腔細胞表面糖胺聚糖相互作用以及激活蛋白激酶C和Rho激酶途徑，激活內(nèi)皮細胞并增加內(nèi)皮通透性。HBP已被證明是疑似敗血癥的一個有價值的診斷標志物[16]，在嚴重的敗血癥患者中顯示出良好的預后和鑒別特性[17]。實驗和臨床證據(jù)支持該蛋白在膿毒癥引起的器官功能障礙的病理生理學中發(fā)揮重要作用[18]。最近研究也表明HBP水平的升高與危重患者的循環(huán)衰竭、腎衰竭和死亡率有關[19]。有文獻顯示胸腔積液HBP水平診斷效能高，能較好區(qū)分胸腔積液患者的肺炎旁胸腔積液，可能是肺炎旁胸腔積液鑒別診斷的生物標志物[20]。

PTX3和HBP帶來的多重影響現(xiàn)在越來越受到關注。研究結(jié)果顯示肺結(jié)核組外周血PTX3和HBP水平顯著高于潛伏感染組和對照組(P<0.05)，提示在活動性肺結(jié)核患者中PTX3和HBP表達升高，但潛伏感染組和對照組PTX3和HBP的結(jié)果無統(tǒng)計學差異。根據(jù)不同臨床表型進行分組分析，結(jié)果提示肺部有空洞結(jié)核患者 PTX3和HBP水平高于無空洞患者， PTX3和HBP的水平與臨床表現(xiàn)的嚴重程度顯著相關。PTX3和HBP在肺結(jié)核發(fā)病中發(fā)揮重要作用，我們發(fā)現(xiàn)它們的表達變化與疾病的進展有關，可能影響宿主對于結(jié)核分枝桿菌的免疫應答。活動性肺結(jié)核患者接受標準抗結(jié)核治療，且患者抗結(jié)核治療效果良好。本研究對患者隨訪6個月，發(fā)現(xiàn)與治療前相比，在抗結(jié)核治療3個月后PTX3和HBP水平明顯下降，且隨著治療時間延長，PTX3和HBP表達量逐漸降低。當接受6個月抗結(jié)核治療后， 隨訪患者的PTX3和HBP已下降至正常水平，與對照組比較無統(tǒng)計學差異。

本研究應用ROC曲線分析PTX3和HBP的診斷效能以及鑒別肺結(jié)核患者的敏感度和特異度。ROC曲線是以1-特異度為橫坐標，靈敏度為縱坐標，并可用曲線下面積反映實驗診斷的價值大小。對肺結(jié)核組繪制ROC曲線，結(jié)果顯示PTX3和HBP具有較高的敏感度和特異度。提示PTX3和HBP對活動性肺結(jié)核診斷有一定的優(yōu)勢，對病情的評估有指導作用，可能是區(qū)別活動性和潛伏性結(jié)核感染的較敏感指標。

綜上所述，本實驗研究PTX3和HBP的表達變化，可作為輔助診斷肺結(jié)核病的主要依據(jù)之一，有望成為MTB感染期間炎癥和疾病活動的重要生物標志物，使我們更加深入地了解結(jié)核分枝桿菌的發(fā)病機制，為今后結(jié)核病的早期治療及改善結(jié)核病的結(jié)局，發(fā)揮重要的臨床應用價值。因為PTX3和HBP水平可能受到復雜的過程和途徑中多種因素影響，包括細胞因子、趨化因子、生長因子和特定的啟動子基因[21]，所以根據(jù)具體情況，制定適合各種疾病的血漿PTX3和HBP檢測目標，更好的解釋疾病的發(fā)病機制、診斷或預后。