miR-205靶向調(diào)控PLCε抑制膀胱癌T24細(xì)胞EMT和遷移的作用機(jī)制研究

孫賓 劉多鳳 陳建華

EMT; invasion; metastasis

膀胱癌是常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病隱匿，轉(zhuǎn)移率高。早期膀胱癌患者中，肌層浸潤(rùn)性膀胱癌約占30%左右，其中1/2的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。發(fā)生轉(zhuǎn)移后患者的生存率明顯下降，即使采用手術(shù)切除與聯(lián)合化療方法治療，5年的生存率不足30%[1]，因此預(yù)防和控制膀胱癌向深處浸潤(rùn)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移是目前醫(yī)學(xué)工作者不斷探索的難題。有研究報(bào)道上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是癌細(xì)胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的驅(qū)動(dòng)力，因此研究EMT發(fā)生分子機(jī)制，是提高腫瘤診治的關(guān)鍵[2]。磷脂酰肌醇特異性磷脂酶Cepsilon(PLCε)作為癌基因Ras的效應(yīng)分子，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[3,4]，有文獻(xiàn)報(bào)道PLCε在膀胱癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，且能夠促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)生EMT和轉(zhuǎn)移[5]。miRNA作為全長(zhǎng)含有20～25個(gè)核苷酸的小分子RNA，能夠通過(guò)與靶基因mRNA的 3’端結(jié)合，從而抑制靶基因翻譯。有文獻(xiàn)表明miRNA在腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[6,7]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-205在乳腺癌[8]、卵巢癌[9]中起到促癌基因作用，在胃癌[10]中起到抑癌基因的作用，但其在膀胱癌中的研究筆者尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)靶向調(diào)控PLCε的miRNA，同時(shí)上調(diào)/沉默miR-205表達(dá)，觀察對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞EMT和遷移的影響，為治療膀胱癌提供新的方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年1月至2018年12月于我院就診且經(jīng)病理學(xué)確診的膀胱癌患者癌組織及癌旁組織80例，其中男40例，女40例；年齡35～60歲，平均年齡(40.45±7.54)歲；術(shù)前患者均未進(jìn)行放化療?；颊呒凹覍俸炇鹬橥鈺?shū)。膀胱癌T24細(xì)胞采購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試劑與儀器 胰蛋白酶、qRT-PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；RPIM1640細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Trizol總RNA 提取試劑盒購(gòu)自廣東銳博生物科技技術(shù)股份有限公司；miR-205 inhibitors、miR-205mimics和陰性對(duì)照由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司代為合成；Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；青、鏈霉素購(gòu)自華北制藥有限公司、SYBR Premix Extaq system 日本 Takara 公司、Transwell小室及相應(yīng)產(chǎn)品購(gòu)自美國(guó)Corning公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱采購(gòu)自上海三騰儀器有限公司。PTEN 兔抗 (WB)、PTEN 兔抗 (IHC)、Occludin 兔抗購(gòu)自美國(guó)abcam公司、二抗(IHC)、Actin 鼠抗購(gòu)自Fermentas 公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)美國(guó)Thermo 公司、恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)：從液氮中取出人膀胱癌細(xì)胞系T24，置于37℃水浴溶解，加入含有10%FBS的RPIM1640培養(yǎng)基中，離心去上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2培養(yǎng)，PBS清洗，0.25%胰蛋白酶消化，顯微鏡觀察，加入10%胎牛血清 1640 培養(yǎng)基終止消化，加入到10%FBS的RPIM1640種，37℃，5%CO2培養(yǎng)傳代。傳代次數(shù)一致且細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期且用于后續(xù)研究。

1.3.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-205的表達(dá):取膀胱癌及癌旁組織研磨加入裂解液，混合作用10 min，12 000 r/min 4℃離心10 min，離心取上清，加入Trizol與氯仿震蕩混合均勻，12 000 r/min 離心20 min，加入異丙醇，12 000 r/min離心后，棄上層清液，取管底絮狀沉淀，加入Trizol與乙醇混合液，離心棄上清，沉淀則為細(xì)胞RNA。將RNA用DEPC水溶解，反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄cDNA。按照SYBR方法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，并以Actin為內(nèi)參。反應(yīng)條件為94℃，30 s，1 cycle；95℃，5 s，60℃，30 s，40 cycles；95℃，5 s，60℃，1 min，95℃，1 cycle。結(jié)果用2-ΔΔCT表示。檢測(cè)各組基因的表達(dá)量。引物miR-205 上游5’-ACTCAGTAACCCACACA-3’下游5’-GGGTCCACACTGTGGT-3’。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：調(diào)整膀胱癌細(xì)胞T24細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，取2 ml接種于6孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜，采用Lipofectamine2000將濃度均為100 nM的miR-205 inhibitor、miR-205 mimics和陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，以空脂質(zhì)體作為對(duì)照。qRT-PCR檢測(cè)miR-205的表達(dá)量。

1.3.4 蛋白免疫印跡檢測(cè)E-Cadhein、Vimentin、Slug蛋白的表達(dá):取轉(zhuǎn)染48h細(xì)胞，RIPA裂解液，冰上放置20～30 min，超聲裂解30 s，12 000 r/min，4℃離心10 min，收集上清，置于-20℃保存。BCA定量法檢測(cè)蛋白濃度，待測(cè)樣品和Loading buffer混合，100℃水域變性5 min，然后加入至制備好的SDS-PAGE凝膠(5%濃縮膠，10%分離膠)上樣孔中，每孔25 μl，濃縮膠時(shí)調(diào)整電壓為60 V，分離膠電壓為120 V，結(jié)束后取出凝膠，4℃轉(zhuǎn)膜1.5 h，采用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入一抗，4℃過(guò)夜，TBST洗膜后加入辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃孕育2 h。加入ECL顯影，采用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，以GAPDH作為內(nèi)參，分析蛋白水平。

1.3.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn):稀釋液與基底膠質(zhì)按7∶1體積混合，吸取8 μl的Matrigel覆蓋于transwell小室微孔膜底部，37℃放置30 min，10%FBS的RPIM1640調(diào)整 T24 細(xì)胞的濃度為1×105， 含5%胎牛血清的培養(yǎng)基加入到下室中，上室加入培養(yǎng)的細(xì)胞， 37℃ 5%CO2培養(yǎng)，擦去癌細(xì)胞和基質(zhì)膠，95%乙醇固定15 min；用1%的結(jié)晶紫染色30 min，PBS沖洗多余染料，放于高倍鏡視野計(jì)數(shù)穿透細(xì)胞數(shù)。

1.3.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):取轉(zhuǎn)染48 h 的細(xì)胞，0.25%胰酶消化，RPIM1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度1×105，接種于6孔板中，37℃，5%CO2培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞均勻融合于培養(yǎng)板底部，用一次性接種環(huán)畫(huà)出無(wú)細(xì)胞區(qū)后劃?rùn)M線，采用磷酸緩沖液吸取劃痕后脫落的細(xì)胞并進(jìn)行拍照，實(shí)驗(yàn)分為3組：對(duì)照組、miR-205 inhibitors組、miR-205 mimics組。培養(yǎng)24 h后進(jìn)行拍照，觀察細(xì)胞遷移能力。

1.4 雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定 使用生物信息學(xué)網(wǎng)站Target Scan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)PLCε可互補(bǔ)結(jié)合的微小RNA(microRNA，miRNA)，以正常人基因組DNA為模板，采用PCR擴(kuò)增含有miR-205、PLCε互補(bǔ)位點(diǎn)，構(gòu)建至熒光素酶報(bào)告基因載體psi-CHECK中，記為野生型，同時(shí)構(gòu)建突變型重組質(zhì)粒mutant。將HEK293T 細(xì)胞按30%左右密度鋪24孔板，分別將海腎熒光素酶質(zhì)粒、miR-205及其陰性對(duì)照分別與野生型及突變型mutant共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24 h，根據(jù)雙熒光素酶測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)熒光素酶活性，螢火蟲(chóng)熒光素酶/海腎熒光素酶活性值即為報(bào)告基因活性。

2 結(jié)果

2.1 miR-205在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達(dá) qRT-PCR結(jié)果顯示細(xì)胞癌組織中miR-205的表達(dá)量顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1，圖1。

類別miR-205相對(duì)表達(dá)量膀胱癌組織0.32±0.13癌旁組織 0.97±0.07t值39.376P值<0.001

2.2 miR-205 在轉(zhuǎn)染后膀胱癌細(xì)胞系T24的表達(dá) miR-205 inhibitors、miR-205mimics和空脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞系T24 后，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示miR-205 inhibitors組中miR-205的表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，miR-205mimics組中miR-205的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。提示成功構(gòu)建miR-205沉默細(xì)胞株/過(guò)表達(dá)細(xì)胞株。見(jiàn)表2，圖2。

圖1 miR-205在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

表2 3組細(xì)胞中miR-205相對(duì)表達(dá)量

組別miR-205相對(duì)表達(dá)量對(duì)照組 1.04±0.05miR-205mimics組 2.87±0.11?miR-205 inhibitors組0.15±0.02?F值8.279P值<0.001

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

圖2 RT-PCR檢測(cè)miR-205在膀胱癌細(xì)胞T24中的表達(dá)

2.3 miR-205-對(duì)T24細(xì)胞侵襲能力的影響 miR-205 inhibitors組中穿透細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，miR-205 mimics組中穿透細(xì)胞數(shù)低于對(duì)照組(P<0.05)，提示miR-205能夠抑制T24癌細(xì)胞侵襲能力。見(jiàn)表3，圖3。

組別穿透細(xì)胞數(shù)/視野對(duì)照組 94±9miR-205mimics組 55±8?miR-205 inhibitors組364±18?F值65.298P值<0.001

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.4 miR-205對(duì)T24膀胱癌遷移能力的影響 miR-205 inhibitors組T24遷移率高于對(duì)照組(P<0.05)，miR-205 mimics組T24遷移率明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，提示miR-205能夠抑制T24細(xì)胞的遷移能力。見(jiàn)表4，圖4。

組別細(xì)胞遷移率(%)對(duì)照組 79.31±4.56miR-205mimics組 50.19±4.32?miR-205 inhibitors組96.27±4.34?F值83.212P值<0.001

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.5 miR-205對(duì)E-Cadhein、Vimentin、Slug蛋白的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示miR-205 inhibitors組中上皮標(biāo)志物E-Cadhein的表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin、Slug的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，miR-205 mimics組上皮標(biāo)志物E-Cadhein的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin、Slug的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5，圖5。

miR-205 mimics組對(duì)照組miR-205 inhibitors組

圖3miR-205對(duì)膀胱癌細(xì)胞T24侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色×200)

圖4 miR-205對(duì)T24遷移能力的影響(×100)

組別E-Cadhein相對(duì)表達(dá)量Vimentin相對(duì)表達(dá)量Slug相對(duì)表達(dá)量對(duì)照組 1.12±0.151.17±0.111.16±0.09miR-205mimics組 2.87±0.24?0.23±0.07?0.27±0.08?miR-205 inhibitors組0.24±0.06?3.98±0.21?4.17±0.22?F值13.26519.28724.314P值<0.001<0.001<0.001

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

圖5 miR-205對(duì)E-Cadhein、Vimentin、Slug蛋白的影響

2.6 熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)Target Scan數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)PLCε和miR-205之間有互補(bǔ)結(jié)合序列，推測(cè)兩者可能具有靶向調(diào)控關(guān)系。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-205后，野生型PLCε的熒光素酶活性被抑制(P<0.05)，突變型PLCε的熒光素酶活性無(wú)明顯變化(P>0.05)，證實(shí)PLCε和miR-205具有靶向調(diào)控關(guān)系。Western blot檢測(cè)上調(diào)miR-205細(xì)胞系和空白細(xì)胞對(duì)照中PLCε結(jié)果表明，上調(diào)miR-205后，PLCε表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，證實(shí)miR-205可以特異性結(jié)合PLCε并發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。見(jiàn)表6、7，圖6、7。

組別熒光素酶活性相對(duì)表大量野生型突變型miR-205組0.56±0.091.54±0.17對(duì)照組 1.45±0.121.48±0.12t值13.2670.645P值<0.0010.535

圖6熒光素酶時(shí)間檢測(cè)miR-205與PLCε相互作用關(guān)系

組別PLCε相對(duì)表達(dá)量對(duì)照組 0.95±0.06miR-205mimics組0.29±0.08t值14.758P值<0.001

圖7miR-205對(duì)PLCε表達(dá)的影響

3 討論

膀胱癌為危害人類健康的的重要疾病之一，在我國(guó)的檢出率和發(fā)病率呈遞增趨勢(shì)，研究顯示，男性膀胱癌在所有惡性腫瘤中排第七位，其生物學(xué)行為復(fù)雜，易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，文獻(xiàn)報(bào)道初發(fā)的膀胱癌約有1/3的患者出現(xiàn)局部進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其5年生存率較低，如何控制膀胱癌細(xì)胞組織浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是成為醫(yī)學(xué)科研工作者不斷探尋的課題[11-13]。

miRNA是一類廣泛分布于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的小分子RNA，通過(guò)堿基不完全互補(bǔ)的方式結(jié)合于靶基因上導(dǎo)致基因降解，從而抑制蛋白合成[14]。miR-205是由一段UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG編碼的miRNA，文獻(xiàn)報(bào)道稱其在多種系中高度保守，且其在多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮著抑癌或促癌的作用，但其在膀胱癌中的作用筆者尚未見(jiàn)有報(bào)道，本研究采用RT-PCR檢測(cè)其在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示膀胱癌組織中miR-205表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，提示miR-205在膀胱癌可能起到抑癌的作用。

為進(jìn)一步研究miR-205在膀胱癌侵襲與轉(zhuǎn)移中的作用，本研究通過(guò)上調(diào)/下調(diào)miR-205觀察T24細(xì)胞系侵襲遷移能力變化，Transwell結(jié)果顯示miR-205 inhibitors組中穿透細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，miR-205 mimics組中穿透細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示miR-205能夠抑制T24癌細(xì)胞侵襲能力。劃線法結(jié)果顯示miR-205 inhibitors組T24遷移率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，miR-205 mimics組T24遷移率明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示miR-205能夠抑制T24細(xì)胞的遷移能力。

EMT是上皮細(xì)胞受到癌細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂修D(zhuǎn)移能力的間質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程，惡性腫瘤通過(guò)上皮間質(zhì)化實(shí)現(xiàn)浸潤(rùn)、擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移，因此EMT在癌癥轉(zhuǎn)移中具有重要的意義[15,16]。本研究采用Western blot檢測(cè)上調(diào)/下調(diào)miR-205后上皮標(biāo)志物E-Cadhein，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin、Slug的表達(dá)量，提示miR-205能夠抑制T24癌細(xì)胞EMT進(jìn)程，綜合Transwell和劃線法結(jié)果提示miR-205抑制膀胱細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移可能是通過(guò)抑制EMT實(shí)現(xiàn)的。

PLCε位于人類染色體10q23，作為新發(fā)現(xiàn)的和腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因，有報(bào)道其在膀胱癌中起到促癌的作用[17]，且其表達(dá)水平與膀胱癌患者臨床分期有關(guān)，有學(xué)者采用慢病毒干擾技術(shù)沉默其表達(dá)，發(fā)現(xiàn)膀胱癌細(xì)胞的增殖遷移能力檢索，且EMT標(biāo)志物也顯著下調(diào)[18]，本研究采用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示miR-205和PLCε存在靶向結(jié)合區(qū)域，進(jìn)一步的采用熒光素酶實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了二者存在靶向調(diào)控關(guān)系，且miR-205能夠負(fù)相調(diào)控PLCε。

綜上所述，miR-205在膀胱癌中作為抑癌基因，能夠靶向調(diào)控PLCε 抑制膀胱癌T24細(xì)胞EMT和遷移的作用。