人參皂苷Rg3聯(lián)合沉默MMP-9抑制乳腺癌腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移

廖天志 成宏

乳腺癌是女性高危型性腫瘤之一，其發(fā)生率在女性腫瘤中居于首位[1]。另外，乳腺癌已經(jīng)成為危害發(fā)達(dá)城市女性生命安全的第二大疾病，僅次于肺癌[2,3]。臨床手術(shù)、放化療、內(nèi)分泌治療、分子靶向治療等手段在治療乳腺癌中均有較明顯的缺陷[4]，因此，仍需積極探索乳腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，探尋更有效的抗癌藥物和治療方式。人參皂苷Rg3來源于名貴中藥材人參，是一種已被多項研究確認(rèn)具有明顯抗腫瘤作用的人參活性單體成分，可抑制乳腺癌的增殖、遷移、耐藥性，然而，越來越多研究發(fā)現(xiàn)Rg3可能和抗腫瘤西藥結(jié)合使用具有良好的療效[5-9]。另外，人參皂苷Rg3對于乳腺癌侵襲能力的抑制作用和機(jī)制的研究筆者所見較少。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9可以調(diào)節(jié)包括乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和組織血管生成[10-12]。而且，在甲狀腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌中人參皂苷Rg3均可通過抑制MMP-9等表達(dá)活性對此類腫瘤的轉(zhuǎn)移和惡性發(fā)展發(fā)揮抑制作用[13-15]。有研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中人參皂苷Rg3可抑制MMP-9的分泌[16]。然而到目前為止，人參皂苷Rg3是否通過調(diào)節(jié)MMP-9在乳腺癌中介導(dǎo)惡性發(fā)展還不清楚。本研究使用Rg3刺激體外高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231，擬驗明Rg3對高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞同樣具有抗遷移和侵襲的作用，通過高表達(dá)MMP-9的研究Rg3抑制乳腺癌侵襲作用的下游分子機(jī)制，探討人參皂苷Rg3聯(lián)合沉默MMP-9基因?qū)θ橄侔┠[瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231購買于ATCC美國模式培養(yǎng)物保藏所。人參皂苷Rg3購買于上海純優(yōu)生物科技，MMP-9沉默載體MMP-9 siRNA的構(gòu)建和MMP-9穩(wěn)定低表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞均購于上海吉瑪公司公司，10%胎牛血清(fetal bovine Serum，F(xiàn)BS，10099-141)購買于美國Gibco BRL公司；Ki-67、CDK1、VEGF、Twist1、MMP-9、GAPDH蛋白抗體均購于美國Abcam公司，基質(zhì)膠和Transwell 小室購于美國BD公司。CCK-8檢測試劑盒購于美國MCE公司，DNA含量檢測細(xì)胞周期試劑盒購于美國Solarbio公司，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒Cell Death Detection ELISAPLUS購于德國Roche公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231的培養(yǎng)使用L-15培養(yǎng)基(其中含10% FBS)進(jìn)行常規(guī)含有5%CO2的37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待形成細(xì)胞單層后使用0.25%胰蛋白酶消化傳代，傳代比例1∶3，并繼續(xù)培養(yǎng)。供后續(xù)實驗使用。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和藥物處理分組 細(xì)胞按照實驗?zāi)康慕臃N于合適的培養(yǎng)皿或者多孔板中進(jìn)行處理，control組：無處理的MDA-MB-231細(xì)胞；Rg3組：單獨0.1 mmol/L人參皂苷Rg3處理細(xì)胞；Rg3+pcMMP-9：Rg3和MMP-9過表達(dá)載體共處理組；Rg3+pcMMP-9-NC：Rg3和過表達(dá)空載體作為陰性對照組；Rg3+siMMP-9：人參皂苷Rg3(Rg3，0.1 mmol/L)聯(lián)合沉默MMP-9；Rg3+siNC：人參皂苷Rg3(Rg3，0.1 mmol/L)聯(lián)合沉默MMP-9的陰性對照組。

1.4 細(xì)胞劃痕實驗 各處理組細(xì)胞收集至48孔板。培養(yǎng)細(xì)胞至融合率達(dá)到80%，換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。使用無菌200 μl吸管尖端行培養(yǎng)板內(nèi)側(cè)底部劃痕，然后移除培養(yǎng)基，換成新鮮無血清培養(yǎng)基。用配有數(shù)碼相機(jī)的Olympus IX70顯微鏡進(jìn)行拍照，拍照時間為劃痕后0 h及24 h。利用Image J 1.5軟件計算劃痕兩側(cè)的距離，測量劃痕寬度變化。

1.5 Transwell細(xì)胞侵襲實驗 Transwell侵襲實驗按照供應(yīng)商提供的實驗步驟進(jìn)行。上室底部鋪Matrigel基質(zhì)膠，使用前進(jìn)行基底膜水化。上室接種不同處理組的細(xì)胞(濃度為1× 106/ml)0.5 ml。下室0.6 ml含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。培養(yǎng)24 h后，在上層和下層的測試容器中分別加入0.4%的臺盼藍(lán)，并進(jìn)行風(fēng)干，使用結(jié)晶紫對膜進(jìn)行染色，在顯微鏡(200×)視野下選取5個區(qū)域?qū)?xì)胞遷移數(shù)量直接進(jìn)行計數(shù)統(tǒng)計。

1.6 RT-qPCR 對各組細(xì)胞入適量的TRIzol試劑，嚴(yán)格按照說明書提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將5 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后用SYBR Green進(jìn)行實時定量PCR，每組設(shè)置3個復(fù)孔，反應(yīng)條件設(shè)置為：94℃ 5 min，57℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán)。GAPDH作為內(nèi)參，目的基因的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法計算。

1.7 Western blot 用PBS清洗各組細(xì)胞3次，加入細(xì)胞裂解液于4℃反應(yīng)15 min，4℃離心12 000 r/min，15 min。收集上清并測定各組樣品的蛋白濃度。每個樣品按照20 μg的上樣量，于SDS-PAGE凝膠上分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，采用3%的脫脂牛奶于室溫封閉2 h，4℃過夜孵育一抗，孵育辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗于室溫反應(yīng)1.5 h。最后，ECL發(fā)光顯色，X線膠片曝光，采用ImageJ統(tǒng)計各條帶灰度值。

1.8 CCK-8實驗 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)入24孔板于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；每孔加入10 μl CCK-8，37℃、5%CO2飽和濕度條件培養(yǎng)4 h；酶標(biāo)儀測定各孔吸光值OD 450。細(xì)胞增殖活性率的計算：survival rate (%)= OD/OD0h×100%。

1.9 細(xì)胞周期實驗 通過DNA含量的檢測對細(xì)胞周期進(jìn)行分析。對各處理組的細(xì)胞進(jìn)行收集，隨后對細(xì)胞進(jìn)行碘化丙啶(Life Tecnologies)染色，使用FACS Calibur Flow Cytometer (BD Biosciences)流式細(xì)胞儀確定細(xì)胞周期并對G0/G1和S期的細(xì)胞中DNA含量變化，確定細(xì)胞周期并計算不同組間的差異。

2 結(jié)果

2.1 Rg3抑制高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的遷移和侵襲及MMP-9的表達(dá) 與control組比較，Rg3組MDA-MB-231細(xì)胞的遷移率下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且Rg3組細(xì)胞的侵襲率亦下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與control組比較，MMP-9的mRNA水平和蛋白水平均下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖1。

組別細(xì)胞遷移率(%)細(xì)胞侵襲率(%)MMP-9 mRNA水平相對表達(dá)量MMP-9蛋白水平相對表達(dá)量Control組72.49±3.7728.86±1.180.94±0.160.88±0.09Rg3組 48.11±2.32?17.68±2.51?0.56±0.09?0.38±0.13?

注：與Control組比較，*P<0.05

圖1Rg3抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲及MMP-9的表達(dá)；A 細(xì)胞傷口愈合實驗檢測細(xì)胞遷移率的變化；B Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲率；MMP-9相對 mRNA(C)和蛋白(D)的表達(dá)變化

2.2 Rg3通過抑制MMP-9的表達(dá)負(fù)調(diào)控高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲 與單獨Rg3處理相比，Rg3+pc-MMP-9組的MDA-MB-231細(xì)胞的遷移率部分上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且Rg3組細(xì)胞的侵襲率同樣增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與control組相比，Rg3處理后VEGF和Twst1的蛋白水平都下調(diào)(P<0.05)，與單獨Rg3處理相比，VEGF和Twst1的蛋白水平部分恢復(fù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Rg3下調(diào)MMP-9是其抗乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲的關(guān)鍵機(jī)制之一。見表2，圖2。

組別MMP-9 蛋白水平相對表達(dá)量細(xì)胞遷移率(%)細(xì)胞侵襲率(%)VEGF蛋白水平相對表達(dá)量Twist1蛋白水平相對表達(dá)量Control組0.25±0.0973.08±2.6126.75±2.640.85±0.060.83±0.08pc-NC組0.24±0.08pc-MMP-9組0.88±0.10Rg3組49.67±3.4319.56±1.920.22±0.070.23±0.07pc-MMP-9+Rg3組59.40±2.4323.19±3.070.34±0.050.31±0.02pc-NC+Rg3組49.99±6.8820.42±2.060.24±0.050.23±0.09?P vs.control組<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05#P vs.Rg3組<0.05<0.05<0.05<0.05

2.3 Rg3聯(lián)合沉默MMP-9抑制高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞的增殖活性和G1/S周期進(jìn)展 CCK-8結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單獨Rg3處理組相比，Rg3處理和MMP-9沉默聯(lián)合處理抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖活性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且Ki-67蛋白的表達(dá)在聯(lián)合處理組中下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其次，G1/S期進(jìn)展研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單獨Rg3處理組相比，Rg3處理和MMP-9沉默聯(lián)合處理可抑制G1期細(xì)胞向S進(jìn)展，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。且細(xì)胞周期依賴性蛋白CDK1的表達(dá)水平被下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Rg3聯(lián)合MMP-9沉默可明顯抑制高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞的增殖活性和G1/S周期進(jìn)展。見表3，圖3。

圖2Rg3聯(lián)合MMP-9過表達(dá)調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲；A MMP-9蛋白相對表達(dá)變化；*P<0.05 vs.control組，n=3；B 細(xì)胞遷移率的變化；C Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲率變化；VEGF(D)和Twist1(E)蛋白表達(dá)變化，#P<0.05 vs.control組，△P<0.05 vs.Rg3組，Rg3：人參皂苷Rg3；pc-MMP-9：MMP-9蛋白的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-MMP-9；pc-NC：pcDNA3.1(+)空載體作為陰性對照

組別6 h12 h24 h48 hG1期S期KI-67蛋白水平相對表達(dá)量CDK1蛋白水平相對表達(dá)量Control組0.84±0.050.82±0.070.73±0.100.75±0.1052.69±6.1751.99±5.240.86±0.070.83±0.09si-NC組0.82±0.060.77±0.050.74±0.080.69±0.0952.78±3.9252.21±3.640.85.±0.060.83±0.06si-MMP-9組0.74±0.060.74±0.050.71±0.080.66±0.0762.79±4.9342.83±8.490.42±0.090.46±0.06si-MMP-9+Rg3組0.61±0.070.58±0.100.44±0.110.40±0.0579.50±7.9438.77±1.580.27±0.060.32±0.07si-NC+Rg3組0.67±0.090.64±0.120.57±0.130.55±0.0871.11±7.5946.21±4.560.35±0.060.41±0.10Rg3組0.76±0.030.68±0.090.66±0.110.63±0.0571.11±7.6846.27±6.960.34±0.090.41±0.08?P vs.control組<0.05<0.05<0.05<0.05#P vs.si-MMP-9組<0.05<0.05<0.05<0.05△P vs si-MMP-9+Rg3組<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

圖3Rg3聯(lián)合MMP-9沉默調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程；A CCK-8檢測細(xì)胞的增殖活性；#P<0.05 vs.control組，n=3；B Ki-67蛋白水平變化；C G1期細(xì)胞和S期細(xì)胞相對數(shù)目變化；(D)CDK1蛋白水平變化，*P<0.05 vs.control組，#P<0.05 vs.si-MMP-9組，△P<0.05 vs.si-MMP-9+Rg3組，Rg3：人參皂苷Rg3；si-MMP-9：MMP-9 siRNA沉默載體；si-NC：siRNA陰性對照

2.4 Rg3聯(lián)合沉默MMP-9抑制高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲 細(xì)胞劃痕實驗發(fā)現(xiàn)，與單獨Rg3處理組相比，Rg3處理和MMP-9沉默聯(lián)合處理可抑制乳腺癌細(xì)胞的劃痕愈合能力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Transwell細(xì)胞侵襲實驗發(fā)現(xiàn)，與單獨Rg3處理相比，Rg3處理和MMP-9沉默聯(lián)合處理可以抑制細(xì)胞的侵襲率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。且VEGF和Twist1的蛋白的表達(dá)水平均被下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。因此，Rg3聯(lián)合MMP-9沉默可明顯抑制高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。見表4，圖4。

組別細(xì)胞遷移率(%)細(xì)胞侵襲率(%)VEGF蛋白水平相對表達(dá)量Twist1蛋白水平相對表達(dá)量Control組74.27±4.2927.36±2.170.90±0.050.94±0.08si-NC組74.73±6.6127.33±2.950.89±0.120.93±0.14si-MMP-9組55.08±7.2619.99±2.900.34±0.060.33±0.09si-MMP-9+Rg3組37.72±5.1114.69±4.390.27±0.120.25±0.09si-NC+Rg3組51.49±4.4522.94±4.100.36±0.090.38±0.08Rg3組51.28±3.4822.78±5.330.36±0.080.38±0.09?P vs.control組<0.05<0.05<0.05<0.05?P vs.si-MMP-9組<0.05<0.05<0.05<0.05△P vs si-MMP-9+Rg3組<0.05<0.05<0.05<0.05

圖4Rg3聯(lián)合MMP-9沉默調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲;A 傷口愈合實驗檢測細(xì)胞遷移率的變化；B Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲率變化；VEGF(C)和Twist1(D)蛋白表達(dá)變化；#P<0.05 vs.control組，*P<0.05 vs.control組，#P<0.05 vs.si-MMP-9組，△P<0.05 vs.si-MMP-9+Rg3組，Rg3：人參皂苷Rg3；si-MMP-9：MMP-9 siRNA沉默載體；si-NC：siRNA陰性對照

3 討論

MDA-MB-231細(xì)胞是一種惡性程度較高的人乳腺癌細(xì)胞，具有高轉(zhuǎn)移性和高增殖活性[17]。人參皂苷Rg3可抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖活性并抑制凋亡，其中就包括乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231[5,18]。而且最新研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3可抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力[18]。然而，到目前為止Rg3對于乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力的影響并不明確。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Rg3不僅抑制MDA-MB-231細(xì)胞的劃痕愈合能力，而且可抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力。因此，Rg3不僅明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖和遷移，而且對MDA-MB-231的侵襲性同樣具有明顯的抑制作用。表明人參皂苷Rg3是一種潛在的抗惡性乳腺癌細(xì)胞侵襲的藥物。

MMPs介導(dǎo)基膜和細(xì)胞外基質(zhì)降解和細(xì)胞遷移等過程[19]。而且，MMP9是最關(guān)鍵的腫瘤分泌MMPs之一，在基膜Ⅵ膠原和其他基質(zhì)蛋白的降解過程中發(fā)揮重要作用[20]。有研究表明Rg3在抑制黑素瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移過程中，同樣抑制了MMP-9的表達(dá)[21]，同樣的結(jié)果在結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29中被驗證[22]。本研究發(fā)現(xiàn)Rg3同樣可以抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中的MMP-9的mRNA和蛋白水平的表達(dá)。更重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)MMP-9明顯逆轉(zhuǎn)Rg3對該乳腺癌細(xì)胞侵襲作用的抑制效果。因此表明Rg3可通過下調(diào)MMP-9的表達(dá)抑制高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力。

中藥聯(lián)合基因治療是中西醫(yī)結(jié)合的治療方法之一，已被運用于許多病癥的基礎(chǔ)與臨床研究。在治療肺癌惡性胸水的研究中，王維等使用攻癌利水散的外敷并聯(lián)合重組的p53基因腺病毒胸腔灌注進(jìn)行治療[23]。對原發(fā)性肝癌的中西醫(yī)治療也得到良好的治療效果[24]。更重要的是，研究發(fā)現(xiàn)沉默MMP-9可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，包括胃癌細(xì)胞[25]、白血病單核細(xì)胞[26]、黑色素瘤細(xì)胞等[27]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)單獨沉默MMP-9對乳腺癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程具有明顯的抑制作用，而且沉默MMP-9聯(lián)合Rg3處理對高侵襲性乳腺癌細(xì)胞的增殖活性和細(xì)胞的周期進(jìn)展的抑制效果均高于單獨沉默MMP-9。腫瘤的中西醫(yī)聯(lián)合治療方式在多種報道中已經(jīng)表明，其效果均優(yōu)于單獨治療。重組人血管內(nèi)皮抑制素聯(lián)合Rg3處理乳腺癌細(xì)胞可以抑制乳腺癌腫瘤小鼠的瘤生長，這種抑制效果明顯優(yōu)于單獨Rg3或單獨使用重組人血管內(nèi)皮抑制素處理[28]。另外，Rg3和多種抗腫瘤西藥聯(lián)合使用對多種腫瘤細(xì)胞的生長和血管生成均具有較好的抑制效果[29,30]。而且，研究發(fā)現(xiàn)MMP-9沉默抑制多種癌細(xì)胞的侵襲和遷移[31]。而本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，Rg3聯(lián)合MMP-9基因沉默對細(xì)胞侵襲和遷移具有更明顯的抑制作用。另外，相比單獨沉默MMP-9，siRNA聯(lián)合沉默MMP-9和FAK基因可以明顯抑制高轉(zhuǎn)移性小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10的侵襲和遷移[27]。

綜上所述，中藥單體Rg3聯(lián)合MMP-9敲減可能是西醫(yī)結(jié)合治療乳腺癌的有效方法之一。仍需進(jìn)一步在體內(nèi)實驗進(jìn)行反復(fù)驗證，為乳腺癌等多種腫瘤治療方法提供新的思路。