N-乙基Cy5 菁染料的合成及光譜性能測試*

(揚(yáng)州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127)

五甲川菁染料（Cy5）是菁染料中一類能夠增強(qiáng)感光材料感光性的重要熒光染料，摩爾消光系數(shù)較大，其吸收波長和發(fā)射波長一般在650nm～750nm，屬于可見光至近紅外范圍內(nèi)，因此其屬于近紅外染料。同時在基因診斷（DNA 診斷或分子診斷）、蛋白質(zhì)標(biāo)記（基因的表達(dá)）、臨床診斷（離子和中性小分子的識別、細(xì)胞、組織以及活體成像）等方面廣泛應(yīng)用。

Waggoner 等[1]合成了N-羧基-5-磺酸鹽-3H-吲哚菁染料Cy3 和Cy5，染料分子中的羧基與生物大分子中的氨基共價結(jié)合，形成新的化學(xué)鍵，因此具有良好的熒光性和水溶性，已成為生物芯片上新一代先進(jìn)的商業(yè)化熒光探針。鄭洪等[2]用自合成法合成水溶性近紅外試劑七甲基花菁作為顯色探針，標(biāo)識出近紅外區(qū)的血清蛋白質(zhì)。Mccorquodale 等[3]證實ICG（吲哚菁綠）可用于檢測人體血清蛋白及其他蛋白質(zhì)，通過二極管誘發(fā)激光毛細(xì)管電泳熒光（CEIF）進(jìn)行表征。研究表明：合成的ICG（吲哚菁綠）具有長吸收波長、強(qiáng)熒光特性的優(yōu)點，因此在醫(yī)學(xué)檢測中也得到了廣泛的應(yīng)用。Sowell 等[4]使用水溶性吲哚菁染料作為人血清蛋白的示蹤劑和非共價標(biāo)記物，用毛細(xì)管電泳法測定不同藥物對人血清蛋白結(jié)合能力的強(qiáng)弱。研究[5-6]發(fā)現(xiàn)吲哚菁染料最佳的緩沖溶液是pH 值為9.0 的硼酸鹽，同時對布洛芬、奎納定、萘普生、丙咪嗪等藥物進(jìn)行檢測分析，結(jié)果表明：藥物與人體血清蛋白的結(jié)合對藥物的毒性、活性和人體排泄有一定的影響。

目前，菁染料還有著一些問題：水溶性差、分離提純困難、耐光耐熱性差等，嚴(yán)重影響了菁染料的應(yīng)用，針對這些問題，主要解決辦法有兩種，一是研發(fā)出有著更長的吸收波長的新型功能菁染料；二是通過改變菁染料的分子結(jié)構(gòu)，來增強(qiáng)它的穩(wěn)定性，從而拓寬其應(yīng)用范圍。

本文主要是在3-丙烯醛縮苯胺兩端加入中間體1-間羧芐基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉和1-間羧芐基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀。采用薄層色譜法點樣、展開后，根據(jù)比移值（Rf）與合適的對照物按相同方法所得的色譜圖的比移值（Rf）作對比之后，確定需要的菁染料組成，研究菁染料的性能變化。

1 實驗部分

1.1 實驗藥品

1-間羧芐基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉、1-間羧芐基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀、3-丙烯醛縮苯胺（分析純，湖北巨勝科技）；N，N 二甲基甲酰胺（DMF）（分析純，南京仁恒化工）；二甲基亞砜（DMSO）(分析純，南京蘇研化工科技)；四氫呋喃、乙酸乙酯、無水乙醇、二氯甲烷、甲醇、丙酮（分析純，常州中奧化工）；乙腈、氯仿（分析純，宜興市邁克化工）；乙酸酐、冰乙酸（分析純，蘇州玖佳化工）。

1.2 實驗儀器

集熱式恒溫磁力攪拌器DF-101S，電子天平FA/JA（鞏義市英峪予華儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-201D（上海民橋精密儀器有限公司分析儀器廠）；雙五金電熱鼓風(fēng)干燥箱101A-1E（上海實驗儀器廠有限公司）；真空干燥箱TP-620A（上海精密實驗設(shè)備有限公司）；紫外-可見分光光度計UV-2550、熒光光譜儀RF5000（日本島津公司）；液質(zhì)聯(lián)用色譜儀HP1100LC-MCSD（安捷倫公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料的合成

用實驗室現(xiàn)有的染料中間體1-間羧芐基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀和縮合劑3-丙烯醛縮苯胺作為原料，在一定反應(yīng)條件下發(fā)生縮合反應(yīng)，得到相應(yīng)的對稱性五甲川菁染料Cy5，結(jié)構(gòu)如圖1 所示。

圖1 5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料的基本結(jié)構(gòu)及合成路線Fig.1 Basic structure and synthetic route of 5-sulfonic acid N-ethyl Cy5 cyanine dye

溶劑為冰乙酸，催化劑為乙酸酐，反應(yīng)溫度為110℃，反應(yīng)時間4h，反應(yīng)過程中N2保護(hù)。取50mL 小燒瓶，將冰乙酸和乙酸酐以1：1 配比加入，即加入13mL 的冰乙酸和13ml 的乙酸酐，即再將摩爾比為2（中間體）：1.1（縮合劑）即187.4mg 的中間體和200mg 的縮合劑加入小燒瓶，再放入磁性轉(zhuǎn)子，置于加熱爐上加熱，加熱時不斷攪拌，加熱溫度到達(dá)110℃時開始計時，反應(yīng)時間4h。反應(yīng)結(jié)束后，將小燒瓶取下靜置冷卻到室溫，將其中剩余液體采用旋干蒸餾的方式的旋干，剩余固體樣品用二氯甲烷溶解后保存，用柱色譜法進(jìn)行分離提純。

1.3.2 N-乙基Cy5 菁染料的合成

用實驗室現(xiàn)有的染料中間體1-間羧芐基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉和縮合劑3-丙烯醛縮苯胺作為原料，合成后的結(jié)構(gòu)如圖2 所示。

圖2 N-乙基Cy5 菁染料的基本結(jié)構(gòu)及合成路線Fig.2 Basic structure and synthetic route of N-ethyl Cy5 cyanine dye

取50mL 小燒瓶，將冰乙酸和乙酸酐以1（冰乙酸）：1（乙酸酐）配比加入，即加入13mL 的冰乙酸和13mL的乙酸酐，再將摩爾比為2（中間體）：1.1（縮合劑）即249.5mg 的中間體和200mg 的縮合劑加入小燒瓶，再放入磁性轉(zhuǎn)子，置于加熱爐上加熱，加熱時不斷攪拌，加熱溫度到達(dá)110℃時開始計時，反應(yīng)時間4h。反應(yīng)結(jié)束后，將小燒瓶取下靜置冷卻到室溫，將其中剩余液體采用旋干蒸餾的方式的旋干，剩余固體樣品用二氯甲烷溶解后保存，用柱色譜法進(jìn)行分離提純。

1.4 表征方法

1.4.1 菁染料的分離方法

采取薄層色譜制板和展開，柱層析制作和分離，在色譜柱中不斷加入洗脫劑，樣品逐漸向下分離，收集流出液，用甲醇萃取，萃取后的染料甲醇溶液采用旋干蒸餾的方法旋干，最后留下的固體即較純凈的菁染料。

1.4.2 質(zhì)譜及光學(xué)性能檢測

用液質(zhì)聯(lián)用色譜儀及核磁共振來表征化合物結(jié)構(gòu)，同時在紫外分光光度計上設(shè)定掃描光譜范圍是370nm～900nm，波長間隔為1nm，時間間隔為1s，測定染料在不同有機(jī)溶劑下的的紫外可見吸收光譜。

1.4.3 滴定實驗

選用在無磺酸基的菁染料乙腈溶液中對Cu2+離子的滴定，以得出Cu2+離子使菁染料在乙腈溶液中可以識別時的最佳濃度。在小瓶中配置1×10-5mol/L 的菁染料乙腈溶液，測紫外可見吸收波長，作為空白對比數(shù)據(jù)，使用量程為0.5μL～2.5μL 的移液槍。在溶液內(nèi)濃度梯度為0.3 當(dāng)量地加入1×10-2mol/L 的Cu2+離子，觀察其紫外可見吸收波長的變化，記錄并處理數(shù)據(jù)。

1.4.4 菁染料試紙制作

配置浸泡液，裁剪試紙，取出試紙，晾干并選取顏色分布均勻的紙條，將其裁剪成規(guī)格為1cm×1cm 的紙片，將紙片均勻放在玻璃板上，分別滴加一定量的金屬離子溶液，溶液要求完全浸濕紙片即可，等被金屬離子溶液浸濕的紙片晾干后，滴加乙腈，使乙腈將紙片完全浸濕，靜置晾干觀察是否有顏色變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 菁染料的質(zhì)譜分析

分離純凈后5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料的收率為36 %。1H NMR (400 MHz，DMSO-d6)，δ:8.29 (t，1H，J=11.0 Hz，CH=CH),7.76 (s，2H，Ar-H)，7.65 (d，2H，J=8.0 Hz，Ar-H)，7.35 (d，2H，J=4.4Hz，Ar-H)，6.64(d，2H，J=12.0 Hz，CH=CH)，4.25～4.35 (m，4H，N-CHZ)，1.67 (s，12H,C(CH3)Z)。HRMS (TOF MS ES)calculated for C29H33N2K2(SO3)2H NMR 譜圖如圖3 所示。

圖3 5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料1H NMR 譜圖Fig.3 1H-NMR spectrum of 5-sulfonic acid N-ethyl Cy5 cyanine dye

分離純凈后N-乙基Cy5 菁染料的收率為28.3 %。1H NMR (400 MHz，DMSO-d6)，δ:8.28 (t，1H，J=11.0 Hz，CH=CH),7.76 (s,2H，Ar-H)，7.64 (d，2H，J=8.0 Hz，Ar-H)，7.36 (d，2H，J=4.4Hz，Ar-H)，6.65～6.62 (d，2H，J=12.0 Hz，CH=CH)，4.20～4.35 (m，4H，N-CHZ)，1.67 (s，12H,C(CH3)Z).HRMS (TOF MS ES)calculated for C29H33N2H NMR 譜圖如圖4 所示。

圖4 N-乙基Cy5 菁染料1H NMR 譜圖Fig.4 1H-NMR spectrum of N-ethyl Cy5 cyanine dye

2.2 兩種菁染料的紫外-可見光譜分析

一共選取了實驗室常見的14 種有機(jī)溶劑，分別檢測了合成的兩種菁染料在14 種有機(jī)溶劑中的溶解性，檢測結(jié)果見表1。

表1 兩種菁染料溶解性檢測結(jié)果Tab 1 Test results of two cyanine dyes

在篩選出的溶解性較好的有機(jī)溶劑中進(jìn)行了金屬離子檢測，檢測的金屬離子有：Ca2+、K+、Mn2+、Cu2+、Ni2+、Cr2+、Cu+、Al3+、Fe2+、Na+、Mg2+、Ag+、Zn2+、Hg2+、Fe3+、Ni2+、Pb2+、Ni2+、Sn2+、Sn4+、Ce3+、Co2+、Cd2+和乙醇（防止乙醇清洗比色皿時對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響，作為對比數(shù)據(jù)）。

5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料在乙腈、乙醇、水、甲醇、DMSO、DMF 和丙酮七種有機(jī)溶劑中溶解性較好，紫外-可見光譜譜圖如圖5 所示。N-乙基Cy5 菁染料在乙酸乙酯、四氫呋喃、乙腈、乙醇、氯仿、甲醇、DMSO、DMF 和丙酮九種有機(jī)溶劑中溶解性較好，紫外光譜譜圖如圖6 所示。

圖5 5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料的紫外-可見光譜譜圖Fig.5 UV-visible spectrum of 5-sulfonic N-ethyl Cy5 cyanine dye.

圖6 N-乙基Cy5 菁染料的紫外-可見光譜譜圖Fig.6 UV-visible spectrum of N-ethyl Cy5 cyanine dye

由圖5、圖6 可以看出，5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料在七種有機(jī)溶劑中的紫外-可見吸收波長分別為：640nm、641nm、635nm、634nm、646nm、645nm 和643nm；N-乙基Cy5 菁染料在九種有機(jī)溶劑中的紫外吸收波長分別為：640nm、636nm、640nm、641nm、642nm、634nm、646nm、645nm、643nm。

由圖7、圖8 可知，5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料在乙腈溶液中，由多個金屬離子發(fā)生了熒光淬滅，同時紫外可見吸收譜圖中由一個峰變成了兩個峰。這是因為在乙腈溶液中，菁染料一般為單聚體的形式存在，當(dāng)加入金屬離子后，單聚體變成了二聚體甚至是多聚體，從而導(dǎo)致譜圖的變化及菁染料乙腈溶液的顏色變化。但是加入金屬離子后菁染料本身沒有發(fā)生變化，只是物質(zhì)聚集狀態(tài)發(fā)生了變化，并且有多個金屬離子使它發(fā)生了變化，所以無法證明磺酸基菁染料對哪個金屬離子有識別能力。

圖7 有磺酸基菁染料在乙腈中的紫外譜圖Fig.7 UV spectrum of sulfocyanine dye in acetonitrile

圖8 有磺酸基菁染料在乙腈中的熒光譜圖Fig.8 Fluorescence spectrum of sulfocyanine dye in acetonitrile

N-乙基Cy5 菁染料在乙腈溶劑中加入金屬離子的紫外可見和熒光光譜譜圖分別如圖9、圖10 所示。

圖9 無磺酸基菁染料在乙腈中的紫外譜圖Fig 9 UV spectrum of sulfonate-free cyanine dye in acetonitrile

圖10 無磺酸基菁染料在乙腈中的熒光譜圖Fig 10 Fluorescence spectrum of sulfonate-free cyanine dye in acetonitrile

由圖9、圖10 可知，N-乙基Cy5 菁染料在乙腈溶液中，只有加入Cu2+離子后其光譜發(fā)生了變化，而加入其他金屬離子并未對菁染料有影響。經(jīng)觀察，在N-乙基Cy5 菁染料乙腈溶液內(nèi)滴加Cu2+離子后顏色褪去接近無色透明，由此可以證明，N-乙基Cy5 菁染料在乙腈溶液中對Cu2+離子有著特殊的識別能力。在篩選出有這種特殊識別能力之后，加做滴定實驗，確定能使N-乙基Cy5菁染料褪色的Cu2+離子最大濃度。滴定結(jié)果如圖11 所示。

圖11 Cu2+離子滴定菁染料的紫外可見光譜譜圖Fig 11 UV-Vis spectrum of Cu2+ ion titration of cyanine dye

由圖11 可知，當(dāng)Cu2+離子濃度不斷增大時，紫外波峰不斷降低，其紫外吸收波長也不斷減小，這是因為滴加Cu2+離子之后，Cu2+離子對N-乙基Cy5 菁染料本身發(fā)生了反應(yīng)，不僅使紫外可見吸收波長發(fā)生變化，同時也使溶液顏色褪色至無色。

通過濃度梯度滴加Cu2+離子直至新生成的波峰不再發(fā)生變化，記錄Cu2+離子的濃度為1×10-2mol/L，即在1×10-5mol/L 的N-乙基Cy5 菁染料乙腈溶液中，1×10-2mol/L 濃度的Cu2+離子可使溶液顏色褪至無色。

2.3 菁染料試紙的制作

按照步驟制作好的試紙，結(jié)果如圖12 所示。

圖12 Cu2+離子滴加N-乙基Cy5 菁染料乙腈試紙F(tuán)ig.12 The test paper of Cu2+ ions with N-ethyl Cy5 cyanine dye acetonitrile

由圖12 可知，在選用試紙制作以后，并沒有出現(xiàn)顏色褪去的現(xiàn)象。這可能是因為當(dāng)試紙被菁染料浸泡過后，菁染料附著在了試紙上，成為固定相，當(dāng)再次滴加離子的時候，離子已經(jīng)無法再對固定在試紙上的菁染料產(chǎn)生作用。在此基礎(chǔ)上又增加了一個溶液檢測Cu2+離子的實驗，其結(jié)果如圖13 所示。

圖13 N-乙基Cy5 基菁染料乙腈溶液滴加金屬離子顯色圖Fig.13 The appearance of N-ethyl Cy5 based cyanine dye in acetonitrile solution

由此可得，N-乙基Cy5 菁染料只有在乙腈溶液中才有對Cu2+離子的特殊識別能力，這是因為在乙腈溶液溶液中，菁染料處于游離狀態(tài)，Cu2+離子可以與游離態(tài)的菁染料發(fā)生指示作用，進(jìn)而引起菁染料的褪色。

3 結(jié)論

菁染料(Cy)因在近紅外區(qū)域有較強(qiáng)的熒光發(fā)射且易于修飾，從而近年來被廣泛地應(yīng)用于敏化生物分子、細(xì)胞和組織等物質(zhì)，形成熒光標(biāo)記的復(fù)合體，從而為生物分析、生物成像和疾病(特別是腫瘤)的機(jī)理分析和治療提供了一條非常便利的途徑。

本實驗研究分別合成了兩種Cy5 菁染料，分別是5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料和 N-乙基Cy5 菁染料，對它們產(chǎn)物進(jìn)行了分離提純，并測試了它們的光譜性能及離子檢測，結(jié)論如下：

（1）5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料在乙腈、乙醇、水、甲醇、DMSO、DMF、丙酮七種有機(jī)溶劑中的紫外可見吸收波長分別為：640nm、641nm、635nm、634nm、646nm、645nm、643nm。

（2）N-乙基Cy5 菁染料在乙酸乙酯、四氫呋喃、乙腈、乙醇、氯仿、甲醇、DMSO、DMF、丙酮九種有機(jī)溶劑中的紫外可見吸收波長分別為：640nm、636nm、640nm、641nm、642nm、634nm、646nm、645nm、643nm。

（3）5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料對金屬離子的識別能力較差，達(dá)不到識別性能，而N-乙基Cy5 菁染料對金屬離子的識別能力較為特殊，只有在特定的溶劑中才對特定的離子有識別能力。

（4）N-乙基Cy5 菁染料相對較穩(wěn)定，在大多數(shù)有機(jī)溶劑中可溶，加入金屬離子后對其性質(zhì)無影響，N-乙基Cy5 菁染料在乙腈溶液內(nèi)，對Cu2+離子有一定的識別能力，但是在試紙上實驗不行，只有游離態(tài)的菁染料對Cu2+離子有識別能力。