羅沙司他共晶的合成、表征與理化性質(zhì)研究

徐巾超，陳勇，2，葉輝青，張杰，張霽，2，羅忠華，2

（1 廣東東陽光藥業(yè)有限公司，廣東東莞523871； 2 抗感染新藥研發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東東莞523871）

引 言

難溶性是制約候選藥物成為臨床藥物的關(guān)鍵因素之一[1]，近年來進(jìn)入市場(chǎng)有不少新藥，但變得愈來愈普遍的是，研發(fā)中的候選藥物水溶性不好[2]。據(jù)估計(jì)，大約有40%的口服速釋藥物被歸類為幾乎不溶[3]。通過組合篩選程序鑒定的70%或更多的新化學(xué)實(shí)體(new chemical entity，NCE)水溶性也很差[4]。改善藥物的溶解性，從而提升生物利用度是難溶性藥物成藥的重要手段。在藥物產(chǎn)品的研發(fā)過程中，藥物中活性成分的物理化學(xué)性質(zhì)必須優(yōu)化，如溶解性、生物利用度和穩(wěn)定性等[5-8]。藥物共晶能夠改善藥物的一些重要物理化學(xué)性質(zhì)，也有利于藥物合成和生產(chǎn)工藝的綠色化。文獻(xiàn)報(bào)道的可用于研發(fā)改善藥物物理化學(xué)性質(zhì)的潛在方法手段有形成共晶、多晶型、溶劑化物、水合物和鹽[9-12]。美國藥物管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)在2016 年發(fā)布的《藥物共晶監(jiān)管分類指南》[13]中明確給出了共晶的定義“共晶是兩種或多種不同分子以同樣晶格構(gòu)成的結(jié)晶物質(zhì)，通常是藥物和共晶配體。它們不同于鹽而更像溶劑化物，雖然都是一個(gè)晶格中含有多于一個(gè)的組分”。從物理化學(xué)性質(zhì)角度看，共晶可看作是溶劑化物和水合物的特殊情形，其中第二組分共晶配體是非易失形的。

近年來，藥物共晶[14-18]作為一種新興的藥物晶型，通過引入共晶配體(co-crystal coformers,CCF)可改變其活性藥物成分(active pharmaceutical ingredient,API)的諸多理化性質(zhì)[19-23]。2015 年，諾華的EntrestoTM(代號(hào)LCZ696)獲得了FDA 的批準(zhǔn)，用于治療慢性心衰竭[24]，是有限的幾個(gè)被FDA 批準(zhǔn)的藥物共晶之一。EntrestoTM由沙庫巴曲單鈉鹽、纈沙坦二鈉鹽和水組成[25]，臨床數(shù)據(jù)證明，不僅顯著降低死亡率且在患者耐受性上與依那普利相似。另一個(gè)共晶藥物是埃格列凈-L-焦谷氨酸共晶(ertugliflozin)[26]，于2017 年12 月由FDA 批準(zhǔn)用于治療糖尿病的新型藥物。這些共晶藥物的獲批上市進(jìn)一步提升了研究者和制藥公司對(duì)共晶開發(fā)的關(guān)注，通過共晶研究來改善藥物的理化性質(zhì)或者生物利用度以達(dá)到提早應(yīng)用的目的。

羅沙司他(愛瑞卓Roxadustat，RDXT)，由琺博進(jìn)(FibroGen)、阿斯利康(AstraZeneca)和安斯泰來(Astellas)聯(lián)合開發(fā)，是全球首個(gè)開發(fā)的小分子低氧誘導(dǎo)因子脯氨酰羥化酶抑制劑類治療腎性貧血(chronic kidney disease，CKD)的藥物。2017年12月，羅沙司他膠囊被中國藥審中心納入優(yōu)先審評(píng)公示名單，并于2018 年12 月17 日獲批上市。該藥是首個(gè)在中國本土孵化、首個(gè)率先在中國獲批的全球首創(chuàng)原研藥，用于透析依賴的慢性腎衰性貧血。目前全世界范圍慢性腎病的發(fā)生率達(dá)8%～16%，在中國慢性腎病發(fā)生率達(dá)10.8%，大約有1.2 億人，CKD 已成為一個(gè)重要的全球醫(yī)療保健問題，代表著一個(gè)龐大且日益增長(zhǎng)的未滿足的醫(yī)療需求。最近，RDXT在治療非透析慢性腎臟病患者貧血的Ⅲ期臨床研究也達(dá)到了主要終點(diǎn)[27-28]。

然而，RDXT 的水溶性較差，在水中的溶解度僅為1.71 mg/L[29]。據(jù)專利報(bào)道[30],RDXT原研晶型與鹽型專利中包含了游離酸的晶型A、B、C、D，以及鈉鹽、鉀鹽、賴氨酸鹽等，其中原研上市的晶型為A。目前未見有RDXT 共晶的報(bào)道，對(duì)RDXT 開展多晶型篩選有重要意義。設(shè)計(jì)了數(shù)百組實(shí)驗(yàn),最終只得到若干溶劑合物，沒有得到令人滿意的游離酸晶型，于是開展了共晶研究。本研究選用RDXT 為模型藥物，對(duì)一系列CCF 進(jìn)行500多組實(shí)驗(yàn)的篩選，先后制備出RDXT與煙酰胺、肉桂酰胺、苯甲酰胺和脯氨酸四種共晶并進(jìn)行表征，對(duì)其溶出速率、溶解性和穩(wěn)定性進(jìn)行研究。根據(jù)FDA 的指南，設(shè)計(jì)新共晶的藥物被認(rèn)為是類似于API 的新固體形態(tài)，有別于成鹽的方式。

圖1 羅沙司他以及CCF的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of roxadustat(RDXT)and CCF

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

RDXT 購自上海再啟生物技術(shù)有限公司，純度≥98%，通過XRD 對(duì)原料進(jìn)行表征，可知原料晶型為晶型A[29]。煙酰胺和苯甲酰胺(aladdin)純度≥99%，肉桂酰胺(energy chemical)純度≥97%，脯氨酸(accela)純度≥98%，所有試劑(西隴化學(xué))均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 方法

1.2.1 羅沙司他共晶的制備 羅沙司他-煙酰胺共晶(RDXT-N)的制備實(shí)驗(yàn)：采用溶液冷卻結(jié)晶法，40～60℃下將煙酰胺和RDXT溶于丙酮中，CCF和API的投料摩爾比為2∶1，溶清后緩慢降溫至0℃，析出固體，養(yǎng)晶后過濾、真空干燥得到羅沙司他-煙酰胺共晶。羅沙司他-肉桂酰胺共晶(RDXT-C)的制備實(shí)驗(yàn)：采用溶液混懸結(jié)晶法，室溫條件下將肉桂酰胺溶于丙酮中，加入RDXT，CCF 和API 的投料摩爾比為2∶1，溶液混懸攪拌2～12 h 過濾、真空干燥得到羅沙司他-肉桂酰胺共晶。羅沙司他-苯甲酰胺共晶(RDXT-B)的制備實(shí)驗(yàn)：采用反溶劑溶析結(jié)晶法，室溫條件下將等物質(zhì)的量的苯甲酰胺和RDXT溶于良溶劑1,4-二氧六環(huán)中，攪拌溶清后，滴加反溶劑正庚烷，有大量固體析出，攪拌2～12 h 過濾、干燥得到羅沙司他-苯甲酰胺共晶。羅沙司他-脯氨酸共晶(RDXT-P)的制備實(shí)驗(yàn)：采用反溶劑溶析結(jié)晶法，室溫條件下將等物質(zhì)的量的脯氨酸和RDXT溶于甲醇和乙二醇二甲醚的混合溶劑中，溶清后滴加反溶劑正庚烷，有大量固體析出，攪拌2～12 h 后過濾、干燥，得到羅沙司他-脯氨酸共晶。

1.2.2 羅沙司他共晶的表征 四種RDXT 共晶的X射線粉末衍射法(XRD)(Empyrean，PANalytical，荷蘭)測(cè)試條件為：Cu Kα為光源，電壓45 kV，電流40 mA，掃描范圍3°～40°，掃描步長(zhǎng)0.0168°。差式掃描量熱法(DSC)(Q2000，TA Instruments，美國)的測(cè)試方法為：在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將2～5 mg 樣品置于鋁坩堝中，測(cè)試溫度范圍為室溫～300℃，升溫速率為10℃/min。熱重分析法(TGA)(Q500，TA Instruments，美國)的測(cè)試方法為：在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將5～10 mg 樣品置于鋁坩堝中，測(cè)試溫度范圍為室溫～300℃，升溫速率為10℃/min。傅里葉紅外光譜分析[31](FTIR)(TENSORⅡ，Bruker，德國)采用KBr 壓片，掃描范圍為4000～400 cm-1。核磁共振氫譜分析法(1H NMR)(AdvanceⅢHD 600，Bruker，瑞士)中樣品用氘代DMSO 溶解后進(jìn)行1H NMR測(cè)試。

1.2.3 固有溶出速率測(cè)試 API 的固有(特性)溶出速率可以預(yù)測(cè)潛在的生物利用度問題，本研究參照USP 附錄＜1087＞固有溶出速率的測(cè)定方法，分別檢測(cè)了RDXT 四種共晶和API 在pH 4.5 和pH 6.8 緩沖液中的固有溶出速率并進(jìn)行對(duì)比。實(shí)驗(yàn)方法：稱取適量粉末置于溶出模具中，用壓片機(jī)(digital hydraulic press 數(shù)顯手動(dòng)液壓壓片機(jī)，PIKE，美國)按壓力55 kN 壓片、保持30 s，將壓制好的片與模具置于溶出杯中，采用槳法，溶出介質(zhì)900 ml，轉(zhuǎn)速50 r/min，溫度(37 ± 0.2)℃，使用在線光纖紫外檢測(cè)系統(tǒng)(Rainbow，PION，美國)在線實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)濃度變化[32]，全波長(zhǎng)200～720 nm 掃描，采樣間隔由最初的密集取樣20 s、30 s、1 min(0～40 min)逐漸變?yōu)? min(40～100 min)、10 min(100～700 min)、20 min(11～41 h)，計(jì)算溶出度并繪制溶出曲線。測(cè)試完成后，將剩余的樣品過濾，干燥。

1.2.4 平衡溶解度測(cè)試 本研究借助水浴恒溫振蕩器(SHZ-B，常州國立)充分溶解RDXT 及其共晶：在離心管中稱取過量的樣品，加入4.5 ml 水并置于37℃下的恒溫振蕩器中振搖24 h后取樣檢測(cè)。采用紫外可見分光光度計(jì)(Cary 60，Agilent，美國)檢測(cè)濃度，測(cè)定純水中的平衡溶解度。方法如下：首先掃描得到RDXT 的特征吸收波長(zhǎng)為387 nm，在該波長(zhǎng)下四種CCF 都無紫外吸收峰。接著在387 nm 波長(zhǎng)下利用濃度和吸收強(qiáng)度的關(guān)系繪制RDXT溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)度為99.99%。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和吸光度來計(jì)算RDXT和共晶在水中的溶解度。每個(gè)樣品平行測(cè)量2 次取平均值。測(cè)試完成后，將剩余的樣品過濾，干燥。

1.2.5 影響因素穩(wěn)定性測(cè)試 分別取RDXT 和四種共晶的樣品適量，平鋪于潔凈培養(yǎng)皿中，攤成厚度≤5 mm 的薄層，分別在高溫(60±2)℃、高濕((90%±5%)RH)、光照(可見光（4500±500）cm-1，紫外線不低于0.7（W·h）/m2，（25 ± 2）℃，（60% ± 5%）RH)條件下進(jìn)行影響因素穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，敞口放置15 d，用XRD檢測(cè)樣品的晶型。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 共晶表征與分析

RDXT晶型A和四種共晶產(chǎn)品的XRD表征如圖2 所示，譜圖中新特征峰的出現(xiàn)可以確認(rèn)新晶型的形成。圖2(a)中RDXT-C 共晶在6.22°±0.2°、10.46°±0.2°、14.57°±0.2°、25.30°±0.2°等處出現(xiàn)新的特征峰，而晶型A 中位于8.41°±0.2°、11.39°±0.2°、16.25°±0.2°、21.56°±0.2°、22.90°±0.2°等的特征峰消失；在圖2(b)中 晶 型A 中 位 于11.39°±0.2°、12.83°±0.2°、22.90°±0.2°、25.80°±0.2°等處的特征峰消失，在RDXT-N 共 晶 中 出 現(xiàn) 了6.30°±0.2°、10.90°±0.2°、14.31°±0.2°、20.54°±0.2°等處的新峰；在圖2(c)圖中晶型A 中位于8.41°±0.2°、11.39°±0.2°、18.90°±0.2°、25.80°±0.2°等處的特征峰消失，在RDXT-B 共晶中出現(xiàn)了6.71°±0.2°、10.64°±0.2°、11.11°±0.2°、18.14°±0.2°、25.32°±0.2°等處的新峰；最后在圖2(d)中晶型A 中 位 于8.41°±0.2°、12.83°±0.2°、16.25°±0.2°、22.59°±0.2°、24.66°±0.2°等處的特征峰消失，在RDXT-P 共 晶 中 出 現(xiàn) 了3.63°±0.2°、7.15°±0.2°、10.75°±0.2°、14.31°±0.2°、20.39°±0.2°等處的新峰。

DSC 曲線如圖3所示，RDXT 晶型A 的熔融峰峰值溫度為223.4℃，四種共晶都只有單一的熔融峰，均低于晶型A的熔點(diǎn)。其中RDXT-C共晶的熔融峰值溫度為167.7℃，RDXT-N 共晶為156.2℃，RDXTB共晶為172.7℃，RDXT-P共晶為188.4℃。

圖2 羅沙司他四種共晶的XRD譜圖Fig.2 XRD patterns of RDXT co-crystals

圖3 羅沙司他四種共晶的DSC譜圖Fig.3 DSC curves of RDXT co-crystals

圖4 是共晶的IR 譜圖，由圖4(a)可以看出，RDXT 位于1728 cm-1羧酸中的C====O 伸縮振動(dòng)峰在RDXT-C共晶中向較低波數(shù)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移至1718 cm-1，肉桂酰胺歸屬3374 cm-1的N—H 伸縮振動(dòng)峰，在RDXT-C共晶中向高波數(shù)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移到了3400 cm-1，由此推測(cè)RDXT 分子是通過氫鍵C====O…H—N 與肉桂酰胺形成共晶；這種遷移在RDXT-B 共晶[圖4(c)]中同樣存在，即預(yù)測(cè)RDXT 分子亦是通過氫鍵C====O…H—N 與苯甲酰胺形成共晶。在圖4(b)中可以看到，RDXT位于1728 cm-1的C====O伸縮振動(dòng)峰在RDXT-N 共晶中位移不變，而位于1639 cm-1的C====O 振動(dòng)在共晶中遷移至1590 cm-1，推測(cè)出煙酰胺分子中的氨基與RDXT酰胺基團(tuán)中的羰基形成氫鍵N—H…O====C，而非羧酸中的羰基形成氫鍵。圖4(d)圖中RDXT 位于1728 cm-1的羧基中的C====O 振動(dòng)峰在RDXT-P 共晶中偏移至低波1712 cm-1處，并且脯氨酸位于3381 cm-1的N—H 伸縮振動(dòng)峰在RDXT-P 共晶中并無偏移，因此推測(cè)出脯氨酸分子中的羥基通過氫鍵O—H…O====C 與RDXT 形成共晶。

核磁共振氫譜如圖5 所示，四個(gè)共晶的譜圖顯示均沒有發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移，證明了形成的是共晶而非成鹽；通過核磁共振氫譜分析，計(jì)算出四個(gè)共晶分子中API和CCF的摩爾比均是1∶1。

2.2 固有溶出速率研究

RDXT 及其四種共晶在pH 4.5 和pH 6.8 的緩沖液中的固有溶出速率分別如圖6 和圖7 所示。從圖6 中可以看出，在pH 4.5 緩沖液中，四種共晶的固有溶出速率都比RDXT 晶型A 的大，其中RDXT-C 的溶出速率最大，達(dá)到溶出平臺(tái)后的溶解度將近RDXT 晶型A 的10 倍，其次溶出較快的是RDXT-N和RDXT-B 共晶。從圖7 中曲線斜率可以明顯看出，在pH 6.8 緩沖液中溶出速率的大小順序?yàn)椋篟DXT-C 共 晶＞RDXT-B 共 晶＞RDXT 晶 型A＞RDXT-P共晶＞RDXT-N共晶。

2.3 平衡溶解度研究

在純水中37℃條件下溶解度數(shù)據(jù)如圖8 所示，溶解度相對(duì)大小為：脯氨酸共晶＞肉桂酰胺共晶＞煙酰胺共晶＞苯甲酰胺共晶＞RDXT 晶型A。其中脯氨酸共晶的溶解度最大，為RDXT 晶型A 溶解度的5.3倍；肉桂酰胺共晶的溶解度為RDXT 晶型A 溶解度的5.2 倍；煙酰胺共晶的溶解度是RDXT 晶型A 的4倍；苯甲酰胺共晶的溶解度是RDXT 晶型A 的3.7倍。

圖4 羅沙司他四種共晶的IR譜圖Fig.4 Infrared spectra(IR)of RDXT co-crystals

圖5 羅沙司他四種共晶的1H NMR譜圖Fig.5 1H NMR spectrum of RDXT co-crystals

圖6 羅沙司他四種共晶和晶型A在pH 4.5緩沖液中的固有溶出曲線Fig.6 Intrinsic dissolution rate of RDXT co-crystals and form A in pH 4.5 buffer

圖7 羅沙司他四種共晶和晶型A在pH 6.8緩沖液中的固有溶出曲線Fig.7 Intrinsic dissolution rate of RDXT co-crystals and form A in pH 6.8 buffer

雖然脯氨酸共晶、煙酰胺共晶和苯甲酰胺共晶在達(dá)到平衡時(shí)都已轉(zhuǎn)化為晶型A，但它們?nèi)跃哂刑岣呷芙舛鹊男Ч?，其中脯氨酸共晶在這四個(gè)共晶中的溶解度最大，這是由于脯氨酸這種CCF 有較好的水溶解性，使得共晶更易與水親和溶解。在溶液中，固態(tài)形式的轉(zhuǎn)變是介穩(wěn)晶型的溶解和穩(wěn)定晶型析出的平衡過程，最初的溶解的共晶在達(dá)到平衡時(shí)不一定全部析出轉(zhuǎn)變?yōu)榫虯，所以各個(gè)共晶的平衡溶解度也不一定和晶型A 保持一致，本研究的四種共晶都達(dá)到了提升溶解度的效果[33]。

2.4 影響因素穩(wěn)定性研究

在高溫(60 ± 2)℃、高濕((90% ± 5%) RH)、光照(可見光（4500 ± 500）cm-1，紫外線不低于0.7 (W·h)/m2，(25 ± 2)℃，（60% ± 5%) RH)條件下放置15 d，其中羅沙司他-肉桂酰胺共晶和煙酰胺共晶的XRD 譜圖與0 d 數(shù)據(jù)無差異，晶型未發(fā)生改變。苯甲酰胺共晶在高溫條件下5 d后出現(xiàn)晶型A的特征峰，其余條件下晶型均未變化；脯氨酸共晶在高濕條件下轉(zhuǎn)成晶型A，在高溫和光照條件下穩(wěn)定。

圖8 羅沙司他四種共晶和晶型A在純水中的平衡溶解度(37℃)Fig.8 Solubility of RDXT co-crystals and form A in water at 37℃

3 結(jié) 論

(1)通過溶液結(jié)晶法制備了羅沙司他-肉桂酰胺、羅沙司他-煙酰胺、羅沙司他-苯甲酰胺和羅沙司他-脯氨酸四種共晶，并通過XRD、DSC、TGA、FTIR和1H NMR的表征確認(rèn)了共晶的形成。

(2)固有溶出實(shí)驗(yàn)證明：在pH 4.5 緩沖液中，四種共晶的固有溶出速率均比晶型A 的溶出速率快，羅沙司他-肉桂酰胺共晶的溶出速率將近晶型A 的10 倍；在pH 6.8 緩沖液中，羅沙司他-肉桂酰胺和羅沙司他-煙酰胺共晶的溶出速率高于晶型A。在純水中37℃條件下，脯氨酸共晶的溶解度最大，為晶型A 溶解度的5.3 倍，顯著提高了羅沙司他的溶解度。

(3)結(jié)合影響因素穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，煙酰胺共晶和肉桂酰胺共晶有著良好的穩(wěn)定性，在高濕、光照、高溫條件下晶型均保持不變。

(4)上述研究結(jié)果表明，羅沙司他-肉桂酰胺、羅沙司他-煙酰胺、羅沙司他-苯甲酰胺和羅沙司他-脯氨酸四種共晶能有效地提高溶解度和溶出速率，并且有著良好的穩(wěn)定性。因此制備出的羅沙司他四個(gè)共晶對(duì)于新劑型、新藥的開發(fā)具有重要意義。