甲狀腺相關眼病淚液α1-抗胰蛋白酶的表達量及臨床意義

吳 鈺，魯 奕，孫 柔，張 碩，孫 靜，周慧芳，范先群

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院眼科，上海市眼眶病眼腫瘤重點實驗室，上海 200011

甲狀腺相關眼?。╰hyroid-associated ophthalmopathy，TAO）是彌漫性甲狀腺腫（diffuse goiter）伴甲狀腺功能亢進癥（hyperthyroidism）最常見的甲狀腺外表現(xiàn)。25%～50%的甲狀腺功能亢進癥患者并發(fā)TAO，其他一些自身免疫性甲狀腺疾病如橋本甲狀腺炎，也有可能發(fā)生眼病[1]。TAO居成年人眼眶病發(fā)病率之首，年發(fā)病率為每10萬人中女性16.0人、男性2.9人[2]。TAO的病因尚不明確，目前認為可能的發(fā)病機制是由于眼眶組織與甲狀腺組織中存在共同抗原，如促甲狀腺素受體（thyroidstimulating hormone receptor，TSHR）、胰 島 素 樣 生 長因 子-1受 體（insulin growth factor-1 receptor，IGF-1R）等[3]。循環(huán)中升高的自身免疫相關抗體引起了交叉免疫反應，病變累及眼眶組織，表現(xiàn)為球后淋巴細胞過度浸潤、脂肪組織異常增生、眼外肌肥大與纖維化變性。TAO的臨床表現(xiàn)復雜，包括眼球突出、眼瞼退縮、眼球運動障礙、斜視、復視等癥狀，甚至出現(xiàn)暴露性角膜炎和壓迫性視神經(jīng)病變（dysthyroid optic neuropathy，DON）等[4]。TAO的病理特征為眼球后軟組織及眼外肌的慢性自身免疫性炎癥浸潤[5]。TAO患者特別是活動期患者常出現(xiàn)畏光、結(jié)膜充血、流淚、異物感、針刺感等眼表不適癥狀，超過80%的TAO患者有眼干燥癥[6]。TAO患者發(fā)生眼干燥癥的原因包括眼球突出、眼瞼退縮導致的暴露因素，還包括淚液分泌功能下降、淚膜穩(wěn)定性的下降等。大量淋巴細胞在淚腺及眼表浸潤，以及炎癥因子的釋放損害了正常的淚液分泌的神經(jīng)傳導，影響淚液分泌的質(zhì)與量，進而影響了眼表微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。有研究[7]報道TAO患者淚液中多種炎癥相關細胞因子的平衡遭到破壞，多種炎癥因子的表達水平顯著上升，且活動期患者淚液中的含量顯著高于靜止期。α1抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，α1-AT）是一種急性時相反應蛋白，是人類淚液蛋白中一種重要的組成成分，對蛋白酶具有抑制效果，具有抗炎、抑制細胞凋亡的功能，還具有調(diào)節(jié)免疫應答、影響補體激活以及炎癥反應的作用。淚液中α1-AT在正常情況下表達量較低，有研究[8]表明眼干燥癥患者淚液中α1-AT表達量上升。本研究通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測不同臨床分期的TAO患者淚液α1-AT表達量并與健康對照組淚液比較，旨在探究TAO患者淚液α1-AT水平特點及其臨床意義，探究其在TAO診斷中的價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2019年1—12月于上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院眼科就診的TAO患者。納入標準：①18歲以上。②TAO診斷明確。③甲狀腺功能控制穩(wěn)定，即總?cè)饧谞钕僭彼幔╰otal triiodothyronine，tT3）及總四碘甲狀腺原氨酸（total tetraiodothyronine，tT4）正常1個月以上。④就診前3個月內(nèi)未進行糖皮質(zhì)激素治療或球后放射治療。排除標準：①既往有眼干燥癥病史等眼表疾病或眼外傷史。②患有影響眼表功能的疾病如糖尿病或其他自身免疫性疾病。③ 曾行眼表手術、內(nèi)眼手術、眶減壓手術。④有急性或慢性感染性疾病。⑤3個月內(nèi)佩戴過隱形眼鏡。⑥3個月內(nèi)使用過人工淚液和其他藥品。本研究經(jīng)上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

TAO的診斷參照Bartley標準[9]，即眼瞼退縮合并以下任意1項：①眼球突出。②甲狀腺功能異常史。③眼外肌受累。如無上瞼退縮則必須具備：①甲狀腺功能異常史。②合并有眼球突出、眼外肌受累或視功能障礙之一。③排除其他眼部疾病引起的眼瞼退縮、眼球突出和眼球運動障礙。

患眼采用臨床活動性評分（clinical activity score，CAS）評估疾病活動性（每項計1分，≥3分評估為活動期）。共7項，包括眼瞼充血、眼瞼水腫、結(jié)膜充血、結(jié)膜水腫、淚阜紅腫、自發(fā)性球后疼痛、凝視或眼球活動時疼痛。

1.2 樣本采集與檢測

1.2.1 淚液樣本的采集 眼表面麻醉下，將圓形淚液檢測濾紙片置入顳下方球結(jié)膜囊內(nèi)，輕輕閉合眼瞼，5 min后取出濾紙，放入已經(jīng)預存磷酸鹽緩沖液0.5 mL（0.01 mol/L，pH 7.4）的1.5 mL離心管中，置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.2 淚液中α1-AT含量的測定 采用ELISA法。采用α1-AT檢測試劑盒（Novus Biologicals，美國）。測定步驟：在酶標包被板上設標準孔8孔，按要求對標準孔進行稀釋與加樣，將稀釋后的樣品加于酶標板孔底部，標準孔與各樣品孔加樣量均為50 μL，用封板膜封板后孵育2 h，并將洗滌液稀釋至工作濃度后備用。孵育完成后小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加200 μL洗滌液，靜置30 s后棄去，甩干，如此重復4～5次。每孔加入50 μL酶標抗體，封板后孵育1 h，重復前述洗滌步驟。洗滌后，每孔加入鏈霉親和素過氧化物酶結(jié)合物50 μL，孵育0.5 h，洗滌。每孔加入50 μL顯色底物，孵育12 min至顯色，加入50 μL終止液終止反應，迅速使用Multiskan? FC酶標儀（ThermoFisher Scientific，美國）測量各孔吸光度D（450 nm）。根據(jù)D（450 nm）繪制標準曲線（standard curve）后，計算出樣品α1-AT濃度。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較

共納入TAO 患者30人共55只患眼。按CAS分為TAO 活動期組17人共33 只患眼，年齡范圍18～62歲。TAO 靜止期組13人共22只患眼，年齡范圍30～65歲。同時期就診的30例健康志愿者為對照組共30只正常眼，年齡范圍18～65歲。TAO活動期 組、TAO靜止期組與健康對照組的年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學意義（表1）。

表1 3組研究對象的一般資料比較Tab 1 General information of three groups

2.2 3組間淚液的α1-AT濃度比較

3組間淚液α1-AT濃度測定結(jié)果見表2、圖1。3組間差異有統(tǒng)計學意義（H=50.55，P=0.000）。繼續(xù)進行組間比較，結(jié)果顯示：與健康對照組相比，活動期TAO患者淚液中的α1-AT濃度顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）。與靜止期TAO組間比較，活動期TAO組α1-AT濃度顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）。靜止期TAO組與健康對照組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.165）。

表2 3組淚液的α1-AT濃度比較Tab 2 Comparison of α1-AT concentration in three groups

圖1 3組淚液α1-AT濃度比較Fig 1 Comparison of tear α1-AT level among three groups

2.3 TAO患者淚液α1-AT濃度與CAS評分的相關性

將TAO患者淚液α1-AT濃度與CAS評分數(shù)據(jù)繪制散點圖，見圖2。可見兩者存在一致的變化趨勢。Spearman相關分析結(jié)果顯示，TAO患者淚液中α1-AT濃度與CAS評分呈顯著正相關（r=0.846，P=0.000）。

圖2 TAO患者淚液α1-AT濃度與CAS評分的相關性Fig 2 Correlation between tear α1-AT level and CAS in TAO patients

2.3 ROC曲線

以淚液α1-AT濃度診斷活動期TAO的接受者操作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC curve），見圖3。ROC曲線下面積（area under curve，AUC）為0.959（95%CI0.914～1.000，P=0.000）。由此可見α1-AT濃度在TAO活動性分期診斷中具有較高的價值。當α1-AT濃度臨界值為939.48 ng/mL時，約登指數(shù)（Youden index，YI）最大，為最佳臨界值；此時診斷活動期TAO的敏感度為81.8%，特異度為100%。

圖3 淚液α1-AT濃度用于TAO活動性診斷的ROC曲線Fig 3 ROC curve of tear α1-AT in TAO patients

3 討論

TAO是一種慢性自身免疫性眼眶病，發(fā)病率居成年人眼眶病之首，病理表現(xiàn)為眼眶成纖維細胞的增生、脂肪細胞增殖、細胞外基質(zhì)的沉積等眼眶組織淋巴細胞浸潤性病變[10]。淚腺是眼免疫系統(tǒng)的重要組成成分。Eckstein[11]等發(fā)現(xiàn)淚腺腺泡細胞與球后成纖維細胞表面同樣表達促甲狀腺素受體（ thyroitropin receptor，TSHR），證實淚腺是TAO的靶器官之一。影像學表現(xiàn)方面，TAO患者的淚腺改變表現(xiàn)為體積增大、信號值增高、呈炎癥表現(xiàn)。病理學研究證實TAO患者淚腺組織發(fā)生淋巴細胞浸潤及脂肪增殖。臨床上，TAO患者常有顯著的結(jié)膜充血水腫、畏光流淚、眼干異物感等眼表癥狀，伴有淚膜破裂時間縮短，眼表疾病指數(shù)升高，眼干燥癥狀明顯，嚴重者出現(xiàn)角膜上皮脫落、角膜潰瘍甚至穿孔，嚴重危害視功能[12]。正常的眼表覆蓋一層淚膜，而穩(wěn)定的淚膜是維持眼表健康的基礎。TAO患者的眼表癥狀一方面與眼球突出度增加、瞼裂增寬、淚液蒸發(fā)加速有關；另一方面與淚腺受累，發(fā)生自身免疫炎癥改變，導致淚液分泌功能下降、淚液成分改變密切相關。淚腺分泌的淚液具有維持眼表微環(huán)境穩(wěn)態(tài)、抵御眼表微生物病原等重要作用。淚液中含有多種炎癥反應蛋白，文獻報道TAO患者淚液中的多種炎癥因子如白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-7、IL-17A、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、前列腺素（prostaglandins，PGs）、神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）等較健康者顯著增高，且部分指標水平與疾病活動度、影像學淚腺體積呈正相關[7,13-15]。淚液成分的平衡遭到破壞，可能促進淚腺炎癥以及免疫反應過程中淋巴細胞的遷移，損害正常的淚液分泌神經(jīng)傳導，進而參與TAO自身免疫反應的發(fā)病過程。淚腺組織獲取難度較大，而淚液的采集是無創(chuàng)傷、易得到的，因此通過淚液成分的檢測來間接反映淚腺及眼表組織的功能狀態(tài)，尋求疾病診斷和活動分期的可能指標，具有重要的臨床意義。

α1-AT為多種蛋白水解酶的抑制劑，是生理循環(huán)中一種重要的防御蛋白。α1-AT具有抗炎、抑制細胞凋亡、維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的功能，還具有調(diào)節(jié)免疫應答，影響抗原-抗體免疫復合物清除、補體激活以及炎癥反應的作用[16-17]。有研究[18]將α1-AT用于治療自身免疫性皮膚病銀屑病，在動物模型上取得了顯著的療效，提示了α1-AT在自身免疫性炎癥反應中的調(diào)節(jié)作用。通常情況下α1-AT在淚液中表達量較低，在部分眼部疾病情況下會出現(xiàn)淚液α-1抗胰蛋白酶的改變[19]。1項針對長期角膜接觸鏡佩戴者的試驗[8]發(fā)現(xiàn)，在眼表受到長期刺激后淚液α1-AT濃度顯著增高。另1項關于角膜潰瘍的研究[20]發(fā)現(xiàn)，角膜潰瘍患者淚液中α1-AT濃度顯著升高，達基線的20倍。1項TAO患者淚液蛋白質(zhì)譜研究[21]中首次報道了α1-AT的含量上調(diào)，而對于該蛋白在TAO患者淚液中的表達量及在臨床分期中意義的深入研究尚屬空白。因此，本研究收集了活動期、靜止期以及健康對照組的淚液樣本進行定量測定，探究其在TAO疾病診斷與臨床分期中的意義。

本研究顯示，TAO患者的淚液α1-AT濃度較健康對照組顯著上調(diào)，且活動期患者淚液α1-AT濃度顯著高于靜止期患者，這與前期的蛋白質(zhì)譜報道[21]一致。相關性分析得出TAO患者淚液α1-AT濃度與CAS評分呈顯著正相關（r=0.846，P=0.000），證明了淚液α1-AT濃度能夠反映疾病的活動性。本研究顯示TAO患者眼眶炎癥可能是通過影響淚腺分泌的淚液成分的表達，間接影響了眼表微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，造成眼表病變。本研究納入的患者雖未發(fā)生明顯的角膜上皮脫落、潰瘍等損害，但其α1-AT濃度的顯著上調(diào)可能對亞臨床眼表損害起到提示作用。靜止期TAO患者α1-AT濃度與健康對照組之間比較無統(tǒng)計學意義（P=0.165），這與靜止期患者通常病程較長、眼表充血水腫等炎癥表現(xiàn)較輕、眼干燥癥狀較活動期改善相符合。AUC發(fā)現(xiàn)以α1-AT濃度作為預測值診斷活動期TAO，具有較高的敏感度和特異度，說明該指標在TAO活動性分期的臨床診斷上可能具有較高的價值。目前，TAO活動性分期的診斷依賴于臨床表現(xiàn)即CAS評分，而CAS評分的具體指標判定有一定的主觀性，往往依賴于醫(yī)生的臨床經(jīng)驗。同時，較為客觀的影像學檢查如電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）等耗時較長且費用昂貴。目前TAO尚缺乏一個簡單、準確的實驗室指標為診斷和預測提供依據(jù)。結(jié)合本研究的結(jié)果，淚液α1-AT濃度的檢測無創(chuàng)且準確性高，我們推論未來可能成為臨床上有推廣價值的診斷性實驗室檢查指標之一，為TAO的臨床診斷提供參考。