基于近紅外二區(qū)熒光納米探針的活體光學(xué)成像技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的研究進(jìn)展

陳 驀，陳 俊，陳世益

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科，上海200040

光學(xué)成像技術(shù)具有靈敏度高、非侵入性和實(shí)時(shí)成像等優(yōu)點(diǎn)，符合當(dāng)下生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)τ诜乔秩氤上裨\斷技術(shù)的要求，被越來越多地應(yīng)用于腫瘤組織、血管結(jié)構(gòu)以及其他組織或部位的成像。隨著臨床醫(yī)學(xué)和生物研究對(duì)成像精度和質(zhì)量要求的不斷提高，在傳統(tǒng)的可見光成像的基礎(chǔ)上，近紅外（near-infrared，NIR）成像技術(shù)也日益受到基礎(chǔ)科研工作者和臨床醫(yī)師的關(guān)注。NIR波段介于可見光和中紅外之間，波長(zhǎng)在650～2 500 nm[1-4]，而根據(jù)波長(zhǎng)被細(xì)分為不同的光學(xué)窗口。例如，研究較早、較為經(jīng)典的NIR光學(xué)成像窗口NIR一區(qū)[4]（first near-infrared，NIR-Ⅰ）在650～950 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，近年來光學(xué)活體成像領(lǐng)域研究中令人矚目的NIR二區(qū)[5]（second near-infrared，NIR-Ⅱ）在波長(zhǎng)1 000～1 700 nm范圍內(nèi)。NIR活體成像具有眾多優(yōu)點(diǎn)：與臨床常用的X射線、核磁共振（magnetic resonance imaging，MRI）和超聲等成像方法相比，NIR等光學(xué)成像的最大優(yōu)點(diǎn)是空間分辨率高[6]；與可見光成像方法相比，NIR活體成像具有自體生物熒光背景低，生物體內(nèi)血液和組織對(duì)光吸收少、散射少，組織穿透度深，成像速度快，圖像對(duì)比度（或靈敏度）高，不良反應(yīng)小以及對(duì)水、脂類、膠原蛋白的區(qū)分比較敏感等諸多優(yōu)點(diǎn)[2,7-8]。而由于具有更長(zhǎng)的波長(zhǎng)，且光的散射強(qiáng)度隨波長(zhǎng)的增長(zhǎng)成指數(shù)下降，使得NIR-Ⅱ與經(jīng)典的NIR-Ⅰ活體成像相比，光子散射和吸收更少，自體生物熒光背景更低，具有更深的穿透性、更高的時(shí)空分辨率和信噪比[9]。NIR-Ⅱ又可劃分為NIR-Ⅱ a（1 000～1 400 nm）和NIR-Ⅱ b（1 500～1 700 nm）[10]。目前NIR-Ⅱ的研究大多集中在NIR-Ⅱ a，而已知的NIR-Ⅱ b熒光納米探針尚不多，因此本文主要探討波長(zhǎng)位于NIR-Ⅱ a的熒光納米探針。

雖然NIR-Ⅱ活體成像具有諸多優(yōu)勢(shì)，但目前其應(yīng)用仍受限于熒光納米探針的發(fā)展跟不上成像設(shè)備和成像技術(shù)的發(fā)展需求。NIR-Ⅱ所用的熒光納米探針與NIR-Ⅰ常用的熒光染料（如美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的吲哚菁綠和亞甲藍(lán)）有所不同，只有少數(shù)材料可以發(fā)射NIR-Ⅱ的波長(zhǎng)。這些材料中一大部分是納米材料，因其具有納米級(jí)（0.1～100 nm）尺寸，使其在光學(xué)、熱學(xué)、電學(xué)、磁學(xué)以及化學(xué)方面的性質(zhì)與非納米材料存在顯著差別，并在NIR-Ⅱ成像方面具有一定優(yōu)勢(shì)。NIR-Ⅱ熒光納米探針根據(jù)制備材料可分為無機(jī)熒光納米探針和有機(jī)熒光納米探針，前者主要包括量子點(diǎn)（quantum dot，QD）、稀土納米粒子（rare earth nanoparticle，RENP）、單壁碳納米管（single-wallcarbon nanotube，SWCNT），后者以共軛聚合物為主[5]。本文就這些熒光納米探針的優(yōu)點(diǎn)及局限性介紹其在NIR-Ⅱ活體成像應(yīng)用中的相關(guān)進(jìn)展，并對(duì)其未來的發(fā)展進(jìn)行展望。

1 QD

QD作為一種半導(dǎo)體熒光納米探針，具有良好的光學(xué)和化學(xué)穩(wěn)定性，發(fā)射波長(zhǎng)窄且可調(diào)諧，雙光子吸收截面較高，具多色性等熒光成像特點(diǎn)，而其能夠交聯(lián)分子的特點(diǎn)更使其具有可以載藥或攜帶其他靶向分子的潛質(zhì)。QD最早于20世紀(jì)70年代被成功制備。Bruchez等[11]將QD作為熒光納米探針應(yīng)用于生物染色和診斷，實(shí)現(xiàn)了將其作為特異性生物標(biāo)記的目標(biāo)，為QD在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究樹立了里程碑。

第1代QD主要以鎘化物[硫化鎘（CdS）和硒化鎘（CdSe） ]、鉛化物[硫化鉛（PbS）和硒化鉛（PbSe） ]為主，制備方法成熟，產(chǎn)量高。由于鉛和鎘作為重金屬具有已經(jīng)明確的生物毒性，第1代QD在活體成像方面的應(yīng)用受到限制。第2代QD為解決這一問題主要采用了2種改進(jìn)方式。

第1種是在第1代QD表面包被其他物質(zhì)外殼。Kong等[12]利用微波加熱法合成了一種核糖核酸酶包被的PbS QD（RNase-A@PbS QD）。與之前報(bào)道的紅外染料IR26的量子產(chǎn)率（0.11%）[13]相比，RNase-A@PbS QD的量子產(chǎn)率（17.3%）證實(shí)其是可用于活體成像方面最亮的水溶性NIR-Ⅱ發(fā)射體之一。更重要的是，體外實(shí)驗(yàn)表明這種RNase-A@PbS QD對(duì)胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞、人胃上皮正常細(xì)胞GES-1和人惡性黑色素瘤細(xì)胞A375均無毒性，還可通過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)將體內(nèi)靜脈注射的QD在幾日內(nèi)完全代謝，從而將體內(nèi)可能釋放的鉛的潛在長(zhǎng)期毒性降到最低。

第2種是更換低毒性材料制備QD，如毒性較低的硫化銀（Ag2S）QD[14]、磷化銦-硫化鋅（InP/ZnS）QD[15]、銅銦硫-硫化鋅（CuInS/ZnS）QD[16]、銀銦硒-硒化鋅（AgInSe2-ZnSe）QD[17]等。Allocca等[18]為對(duì)比InP QD和CdSe QD的毒性，利用水螅進(jìn)行生物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)InP QD的毒性較CdSe QD低，且這種毒性在體內(nèi)可逆，類似于相同劑量的無毒納米材料（如碳納米管和二氧化硅納米粒子）在水螅中測(cè)試的報(bào)道結(jié)果。雖然在動(dòng)物模型中改良后的QD與含鎘QD比較似乎相對(duì)安全，但并不能因此完全打消該QD對(duì)人體是否具有毒性的疑慮。Chen等[15]采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察InP/ZnS QD標(biāo)記的人肺癌細(xì)胞HCC-15和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞RLE-6TN，發(fā)現(xiàn)InP/ZnS QD可進(jìn)入細(xì)胞，且促進(jìn)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成。因此，InP/ZnS QD仍存在一定生物毒性，未來如應(yīng)用于活體成像或治療給藥還需優(yōu)化表面修飾，進(jìn)一步降低其生物毒性。

雖然目前的制備方法和表面功能修飾方式已降低了這些NIR-Ⅱ QD的生物毒性，但其安全性還存在爭(zhēng)議，這可能會(huì)成為其應(yīng)用于臨床的潛在危險(xiǎn)因素。

2 RENP

稀土是化學(xué)周期表中鈧、釔和鑭系元素共17種金屬元素的總稱。摻雜稀土元素的納米粒子具有獨(dú)特的光學(xué)、電學(xué)、磁學(xué)特性。鑭系元素具有低光子吸收的特性[7]，以鑭系化合物為代表的RENP的階梯狀能級(jí)具有窄的發(fā)射寬度，使得多光譜成像具有最小的光譜重疊。除此之外，RENP還具有尺寸高度可控、無光漂白現(xiàn)象、保存時(shí)間長(zhǎng)、生物相容性好、發(fā)射波長(zhǎng)較長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)[19-20]。

RENP已應(yīng)用于小腫瘤、血管以及骨的NIR-Ⅱ成像研究。Li等[21]用聚丙烯酸（polyacrylic acid，PAA）對(duì)以四氟镥鈉作基質(zhì)、釓作敏化劑、釹作激活劑的棒狀納米粒子（NaLuF:Gd/Nd納米棒）進(jìn)行改性，以便用于高靈敏度的活體成像和光學(xué)成像引導(dǎo)下的小腫瘤檢測(cè)；以釓作為主要合成元素，通過摻雜釹元素進(jìn)行調(diào)整，以便將發(fā)射波長(zhǎng)集中在1 056～1 328 nm，獲得較高的光穩(wěn)定性；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其在NIR-Ⅱ?qū)π∧[瘤（5 mm）診斷的可行性和對(duì)小血管成像具有高空間分辨率（約105 μm）；組織學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，這種納米棒具有親水性和良好的生物相容性，對(duì)活體動(dòng)物的毒性作用微乎其微。

與大多數(shù)熒光納米探針應(yīng)用于血管成像不同，He等[22]制備了一種由二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇包被并摻有稀土的納米粒子 （RENPs@DSPE-mPEG），該納米粒子因在不連接任何靶向配體的情況下對(duì)骨骼固有親和力，而有望成為骨骼系統(tǒng)成像的熒光納米探針；除骨顯像之外，RENPs@DSPE-mPEG也可在血管和淋巴結(jié)中顯像；有趣的是，與大多數(shù)納米材料在生物體內(nèi)通過肝臟等器官代謝不同，RENPs@DSPE-mPEG可以通過循環(huán)白細(xì)胞內(nèi)化。這一發(fā)現(xiàn)為RENP在腫瘤的免疫治療等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了可能。

3 SWCNT

SWCNT由單層石墨烯卷曲而成，直徑在1～150 nm，長(zhǎng)度可達(dá)厘米級(jí)。自1991年日本電鏡學(xué)家Iijima[23]在Nature雜志上首次發(fā)表了在用直流電弧放電法制備 C60的過程中發(fā)現(xiàn)碳納米管的報(bào)道之后，碳納米管便迅速在物理、化學(xué)和工業(yè)等諸多領(lǐng)域廣泛研究應(yīng)用。直到2002年，O′Connell等[24]發(fā)現(xiàn)SWCNT能 在NIR波段發(fā)射熒光并在Science雜志上發(fā)表該研究成果，SWCNT在NIR光學(xué)成像方面的應(yīng)用才為大家所知曉。SWCNT是一種近似理想的生物探針，在NIR-Ⅱ具有很強(qiáng)的熒光，幾乎不具有任何毒性，且?guī)缀鯚o光漂白現(xiàn)象。

Takeuchi等[25]制備了一種涂有磷脂-聚乙二醇并摻雜氧元素的SWCNT（o-SWCNT-PEG），這種SWCNT通過980 nm激發(fā)光在約1 300 nm處發(fā)出熒光；通過靜脈注射的o-SWCNT-PEG可在小鼠血管內(nèi)循環(huán)3 h，在1 d內(nèi)清除；小鼠肝臟和脾臟的SWCNT熒光信號(hào)持續(xù)了1個(gè)月，2個(gè)月后小鼠未見明顯體質(zhì)量或外觀異常，提示o-SWCNT-PEG的毒性較低。因此，o-SWCNT-PEG具有在NIR-Ⅱ波長(zhǎng)范圍內(nèi)成為血管成像探針的潛質(zhì)。

雖然SWCNT被認(rèn)為是NIR-Ⅱ成像的理想候選材料，但其水溶性和生物相容性較差。現(xiàn)可通過共價(jià)或非共價(jià)表面修飾的方法來解決這一問題。共價(jià)修飾會(huì)打破共軛π鍵連接，降低熒光產(chǎn)量和活體成像的清晰度。相比之下，非共價(jià)表面修飾可以保留由sp2石墨化碳原子組成的初始結(jié)構(gòu)，并保持預(yù)期的NIR-Ⅱ波段的熒光發(fā)射[20]。因此，非共價(jià)表面修飾可作為表面修飾的首選方法。值得注意的是，SWCNT的低熒光量子產(chǎn)量一直是其發(fā)展的一個(gè)瓶頸，有文獻(xiàn)[26]顯示，SWCNT的熒光量子產(chǎn)率僅約為0.4%。

4 共軛聚合物

共軛聚合物是由3個(gè)及以上互相平行的p軌道形成大π鍵的共軛化合物聚合而成的。共軛聚合物具有高摩爾消光系數(shù)、寬發(fā)射波長(zhǎng)、較強(qiáng)的光捕獲能力，可放大熒光傳感信號(hào)，并且易于制備。但它受激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的限制[26]，且大部分共軛聚合物的水溶性較差。

具有供體-受體結(jié)構(gòu)的低能隙共軛聚合物已作為NIR熒光納米探針應(yīng)用于活體成像。Zhang等[27]為控制分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（intramolecular charge transfer，ICT）以保持低能帶隙，提高NIR-Ⅱ熒光強(qiáng)度，開發(fā)了一種水溶性醌型聚合物。這種聚合物通過增加噻吩鏈長(zhǎng)度，降低吸電子基團(tuán)的密度，使ICT減少，NIR-Ⅱ熒光變強(qiáng)。該醌型聚合物探針可用于體內(nèi)細(xì)胞示蹤、血管系統(tǒng)成像、淋巴引流成像等多種生物醫(yī)學(xué)成像，且具有良好的長(zhǎng)期穩(wěn)定性和較高的體內(nèi)空間分辨率。

值得一提的是，共軛聚合物在光聲成像方面具有良好的前景。雖然QD、SWCNT等熒光納米探針也在光聲成像的研究中有所應(yīng)用，但共軛聚合物在光聲成像方面的研究應(yīng)用相比前兩者更多。共軛聚合物能利用光聲效應(yīng)將吸收的光子經(jīng)熱彈性膨脹轉(zhuǎn)化為聲波[28]，從而結(jié)合光學(xué)和聲學(xué)成像各自的優(yōu)勢(shì)，減少光散射和組織吸收，增強(qiáng)成像分辨率。共軛聚合物尤其對(duì)深部組織的成像具有優(yōu)勢(shì)，可實(shí)現(xiàn)更加清晰、直觀、立體的成像目標(biāo)。

Jiang等[29]報(bào)道了一個(gè)可用于NIR-Ⅱ光聲成像的共軛聚合物納米粒子，其可作為光聲發(fā)射器，在1 064 nm處發(fā)出高強(qiáng)度的光聲信號(hào)，透過小鼠的完整顱骨對(duì)皮下腫瘤和深部腦血管系統(tǒng)進(jìn)行清晰的NIR-Ⅱ光聲成像。這種共軛聚合物納米粒子能被吞噬細(xì)胞中的髓過氧化物酶和脂肪酶降解，由非熒光納米粒子（30 nm）轉(zhuǎn)化為NIR熒光超細(xì)代謝物（約1 nm）。更重要的是，小鼠實(shí)驗(yàn)表明其能被肝臟和腎臟完全代謝清除，無毒性。該類報(bào)道增加了對(duì)于共軛聚合物光聲成像未來早日應(yīng)用于臨床的信心。

5 展望

綜上所述，上述NIR-Ⅱ活體成像常用熒光納米探針均有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，因而針對(duì)不同的生物醫(yī)學(xué)需要，需要選擇更加符合客觀要求的NIR-Ⅱ熒光納米探針。相比較而言，目前用于NIR-Ⅱ活體成像研究的熒光納米探針主要集中在QD，尤其是硫化鉛或者硫化銀QD。因?yàn)榇罅课墨I(xiàn)報(bào)道通過表面修飾和/或更換低毒性元素等方法能使QD的潛在生物毒性有所降低，所以可以相信NIR-Ⅱ熒光QD在今后的NIR-Ⅱ活體成像領(lǐng)域仍會(huì)處于主體地位。RENP的研究緊隨其后，也會(huì)在接下來的研究領(lǐng)域占有一席之地。SWCNT在NIR成像領(lǐng)域的應(yīng)用起步較晚，目前研究也較少，且受到低生物相容性和低熒光量子產(chǎn)率的限制；若不能解決這些問題，其今后的臨床應(yīng)用仍困難重重。共軛聚合物因在光聲成像方面具有的優(yōu)良特性，近年來逐漸受到關(guān)注，可能在今后的 NIR-Ⅱ活體多模態(tài)成像領(lǐng)域有更廣闊的前景。隨著這些NIR-Ⅱ熒光納米探針的不斷發(fā)展，NIR-Ⅱ活體成像技術(shù)（包括造影劑和活體成像儀器平臺(tái)）也將逐步突破目前的瓶頸，為后續(xù)臨床應(yīng)用奠定良好基礎(chǔ)，并有可能成為臨床影像診斷中的一種重要技術(shù)手段。