N6-腺苷酸甲基化RNA修飾在免疫調控中的作用

上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院腎臟科，上海200127

在生物系統(tǒng)中，RNA同時具有信息分子和調控分子的雙重身份，不僅將遺傳信息從DNA傳遞到蛋白質，同時調控著許多生物學過程，其中RNA的轉錄后修飾是這種多樣化調控功能的基礎[1]。在真核生物中，N6-腺苷酸甲基化（N6-methyladenosine，m6A）是mRNA內部序列中最常見的一種甲基化修飾。通過甲基酶作用于第6位N原子，使其發(fā)生甲基化，從而影響mRNA的剪接、穩(wěn)定、運輸、出核、定位、翻譯等過程[2-5]。近年來，隨著高通量測序技術及其他化學分析技術的興起，RNA甲基化的研究取得了突破性的進展，m6A作為最常見的mRNA甲基化修飾，成為了表觀轉錄組學的研究熱點。本文就近年來有關m6A及其在免疫調控中作用的相關研究作一綜述。

1 m6A的發(fā)現(xiàn)及分布

1974年，Desrosiers等[6]首次在具有poly（A）片段的RNA中發(fā)現(xiàn)了mRNA的甲基化修飾，其中最主要的是m6A。哺乳動物RNA分子中發(fā)生甲基化修飾的腺苷酸占0.1%～0.4%，相當于每個mRNA分子存在3～5個m6A修飾位點[7]。然而，由于研究技術的限制，m6A在轉錄組水平的分布及其生物學功能一直未闡明。2011年，美國芝加哥大學一項研究[8]發(fā)現(xiàn)肥胖相關蛋白（fat mass and obesity-associated protein，F(xiàn)TO）可以去除m6A的甲基化修飾，證明m6A修飾是一種動態(tài)、可逆的過程。類似于DNA和組蛋白甲基化修飾在表觀遺傳調控中的重要作用，m6A可能具有同樣重要的調控功能，因而引起了研究者們的重新關注。2012年，2項分別發(fā)表在Nature和Cell的獨立研究[2,9]首次在人類和小鼠轉錄組水平上闡明了m6A的分布，研究結果顯示m6A廣泛存在于哺乳動物7 000余種mRNA以及300余種長鏈非編碼RNA轉錄組中，主要在終止密碼子附近、3′端非編碼區(qū)和mRNA內部長外顯子富集，在人類和小鼠mRNA中具有高度保守性。

2 m6A相關酶的組成

m6A是一種動態(tài)、可逆的甲基化修飾，此修飾過程受甲基轉移酶（writers）、去甲基酶（erasers）和甲基化閱讀蛋白（readers）的共同調節(jié)。

2.1 m6A甲基轉移酶

甲基轉移酶是催化mRNA上的堿基發(fā)生甲基化修飾的一類酶，又稱為“writers”。m6A的甲基轉移酶是由多種蛋白質組成的復合物，利用S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）為甲基供體，將腺嘌呤的第6位N原子上的氫甲基化，形成m6A。METTL3是最早發(fā)現(xiàn)的甲基轉移酶，最初被命名為MT-A70，具有SAM結合活性，在真核生物中具有高度保守性[10]。敲除METTL3后m6A甲基化修飾幾乎全部喪失[11]，因此，METTL3是m6A甲基轉移酶復合物關鍵的組成部分，也是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能與SAM結合的甲基轉移酶。METTL14是與METTL3高度同源的另一甲基轉移酶，但METTL14缺乏SAM結合區(qū)域，無法與SAM結合，主要在識別底物RNA及定位上起到關鍵作用，并且與METTL3形成絡合物增強甲基酶的活性[10,12]。WTAP是m6A甲基轉移酶復合物另一個重要組成成分。WTAP同樣缺少SAM結合區(qū)域，無甲基轉移酶活性，通過與METTL3和METTL14結合將甲基轉移酶復合物定位在核散斑上來調控甲基轉移酶復合物與靶標RNA的結合，從而影響m6A的表達。WTAP缺失會抑制METTL3和METTL14在核散斑上的定位，導致m6A水平顯著降低[13]。因此，METTL3、METTL14、WTAP三者的結合是m6A甲基轉移酶復合物的中心活性組分。

KIAA1429和RBM15/15B是在WTAP的蛋白質組學分析中發(fā)現(xiàn)的甲基轉移酶，下調KIAA1429、RBM15或RBM15B均可導致m6A水平大幅度降低；但目前對于KIAA1429如何影響甲基轉移酶復合物以及在m6A形成中的作用，尚未明確[14]。RBM15/15B可通過與m6A修飾位點附近的U富集區(qū)結合，從而招募甲基轉移酶復合物至甲基位點發(fā)揮甲基化功能[15]。METTL16是近來發(fā)現(xiàn)的一種m6A形成酶，主要在U6小核RNA和甲硫氨酸腺苷轉移酶2A mRNA進行RNA甲基化修飾[16]。

2.2 m6A去甲基酶

去甲基酶的發(fā)現(xiàn)是m6A研究領域的重大突破。m6A去甲基酶又稱“erasers”，其作用是將m6A轉化為腺苷酸。FTO最早作為肥胖相關蛋白被發(fā)現(xiàn)，是AlkB雙加氧酶家族成員，大部分定位于核斑點，核內RNA是FTO主要酶活性底物。沉默F(xiàn)TO可導致m6A的總體水平顯著升高，而FTO過表達可使得m6A水平下降[8]。Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO作為m6A的去甲基酶在急性髓細胞性白血病（acute myeloid leukaemia，AML）中具有致癌作用。然而，2017年康奈爾大學研究團隊[18]在Nature上發(fā)表文章提出，與m6A非常相似的N6,2-O-二甲基腺苷（N6,2′-Odimethyladenosine，m6Am）修飾的去甲基酶也是FTO，而且FTO對m6Am的酶活性是m6A的100倍；因此，F(xiàn)TO雖然能將m6A去甲基化，但其真正的活性底物可能是m6Am。目前，關于FTO的功能仍然具有一定爭議。ALKBH5是AlkB家族另一具有m6A去甲基酶活性的蛋白質，主要定位于細胞核，核內mRNA及其他核內的非編碼RNA是其主要的酶活性底物。與FTO不同，ALKBH5對m6Am無催化活性。Alkbh5基因敲除的小鼠表現(xiàn)出明顯的精子形成障礙，可能與減數分裂中期的精母細胞凋亡增加有關，ALKBH5可能通過調控m6A影響精子的形成[19]。

2.3 m6A甲基化閱讀蛋白

發(fā)生m6A修飾的RNA需與相應的結合蛋白結合才能發(fā)揮特定的生物學功能，這類蛋白又稱為閱讀蛋白——“readers”。目前已知的閱讀蛋白主要包括YTH結構域蛋白、真核起始因子（eIF3）和HNRNPA2B1。

哺乳動物基因組中包含兩大類YTH結構域蛋白，分別是DC家族的YTHDC1、YTHDC2以及DF家族的YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3。3種YTHDF蛋白結構非常相似，主要分布在細胞質，能夠與mRNA的所有m6A修飾位點結合[2,4]。YTHDF2是研究最早的閱讀蛋白，廣泛存在于各種細胞中，通過招募CCR4-NOT腺苷化酶復合物將m6A結合使所在的RNA降解[20]。YTHDF1與eIF3及其他翻譯起始因子相互作用，參與蛋白翻譯過程[5]。YTHDF3的調控功能尚不明確。YTHDC類蛋白主要分布在細胞核，DC1與未成熟的mRNA及一些核內非編碼RNA結合，通過YTH區(qū)域介導m6A調控mRNA的剪切[3]。關于DC2的研究較少，研究[21]顯示，YTHDC2可能是結腸癌的診斷標志物和治療的靶基因。

eIF3是翻譯起始前復合物的一個組成部分，結合在m6A的5′-UTR上介導mRNA的翻譯起始。eIF3可通過2種模式介導m6A調控mRNA的翻譯過程。一種是m6A直接結合并招募eIF3至5′-UTR[22]，另一種是由YTHDF1與在終止密碼子附近的m6A結合從而招募eIF3至5′-UTR[5]，具體機制尚不明確。HNRNPA2B1主要分布在細胞核中，參與微小RNA前體（pre-microRNA，pre-miRNA）的剪接和加工[2]。研究[23]發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白可與m6A結合促進mRNA的穩(wěn)定和蛋白翻譯，是m6A的另一種閱讀蛋白。

3 m6A的生物學功能

3.1 m6A影響mRNA成熟

從核內的加工到細胞質的翻譯和降解，m6A幾乎影響mRNA的每一階段。進行選擇性剪接的mRNA具有更多的METTL3結合位點和m6A位點[2]。沉默小鼠胚胎干細胞Mettl3通常導致外顯子跳躍和內含子保留剪接異常[11]。FTO可通過去除剪接位點周圍的m6A以及抑制與富含絲氨酸和精氨酸的剪接因子2（serine/arginine-rich splicing factor 2，SRSF2）的結合來調控選擇性剪接。YTHDC1通過招募SRSF3，同時阻斷SRSF10的結合，導致外顯子增加[3]。因此，m6A在mRNA的剪接加工方面具有重要的作用，從而影響mRNA的成熟。

3.2 m6A參與mRNA的運輸

mRNA從核內輸出是連接核內轉錄、加工與細胞質內翻譯的關鍵一步，能夠選擇性地調控基因的表達。METTL3的缺失可以抑制mRNA的輸出，而ALKBH5的缺失可以促進mRNA向細胞質輸出，因此m6A具有促進mRNA向細胞質輸出的作用。并且，研究者認為，促進mRNA向細胞質輸出可能是m6A調控基因表達的主要機制[19,24]。

3.3 m6A調控mRNA翻譯效率

m6A促進蛋白翻譯的作用主要與YTHDF1有關。YTHDF1通過與m6A修飾的mRNA結合，并且招募eIF3，顯著提高翻譯效率。YTHDF1不僅將甲基化的轉錄物與核糖體偶聯(lián)，同時還募集翻譯起始因子來加快翻譯的限速步驟[5]。近期，研究[25]發(fā)現(xiàn)，METTL3同樣具有m6A閱讀蛋白的作用，通過在翻譯起始期間募集eIF3促進特定亞群mRNA中eIF4E依賴的翻譯。

3.4 m6A參與mRNA降解

在人類和小鼠細胞中敲除METTL3和METTL14基因后，相應的mRNA水平卻顯著提高，表明m6A與mRNA的穩(wěn)定性有關[26]。一般來說，m6A作為mRNA的不穩(wěn)定劑發(fā)揮作用，促進甲基化mRNA在各種生物環(huán)境中的降解。YTHDF2是第一個發(fā)現(xiàn)的以m6A依賴方式降解mRNA的蛋白。YTHDF2蛋白的羧基端YTH結構域可選擇性地與甲基化轉錄物結合，通過氨基末端的功能結構域將結合的轉錄物傳遞到細胞質RNA降解機制區(qū)進行降解[4]。

4 m6A參與免疫調控

4.1 m6A參與機體固有免疫反應

2005年，Karikó等[27]發(fā)現(xiàn)，暴露于RNA修飾如m6A的樹突狀細胞表達的細胞因子及活化標志物顯著低于不含m6A的細胞。DEAD-box（DDX）螺旋酶對于RNA的識別和代謝至關重要，也是啟動機體抗病毒固有免疫的關鍵。研究[28]發(fā)現(xiàn)，核內DDX蛋白質家族成員DDX46可抑制病毒感染后Ⅰ型干擾素的產生。在病毒感染后，DDX46通過DEAD螺旋酶結構域招募ALKBH5使得m6A修飾的抗病毒轉錄物去甲基化，導致轉錄物滯留于細胞核，抑制蛋白翻譯。因此，DDX46可通過消除m6A修飾將選定的抗病毒轉錄物滯留在細胞核中，從而抑制抗病毒固有免疫反應。近期，研究[29]發(fā)現(xiàn)，在樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）中，m6A通過YTHDF1調控腫瘤免疫反應。與野生型小鼠比較，Ythdf1基因缺陷型小鼠抗原特異性CD8+T細胞抗腫瘤免疫反應顯著增強，經典DCs中YTHDF1的缺失可顯著增強腫瘤抗原的交叉呈遞和CD8+T細胞的交叉激活作用。因此，YTHDF1可作為抗腫瘤免疫治療的潛在靶點。

4.2 m6A調控初始T細胞穩(wěn)態(tài)和分化

初始T細胞在不同的特定條件下可分化為不同的T細胞亞群。2017年Li等[30]在Nature首次報道，m6A通過靶向初始T細胞IL-7/STAT5/SOCS信號通路中的信號分子影響T細胞的穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，Mettl3基因敲除小鼠來源的初始T細胞分化為輔助性T細胞（helper T cell，Th）1和Th17細胞比例顯著減少，Th2細胞比例顯著增多，而調節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Treg）比例無顯著變化。將這種初始T細胞轉輸至腸炎模型中，初始T細胞將無法進行穩(wěn)態(tài)增殖和分化，維持初始狀態(tài)長達12周，從而抑制小鼠慢性腸炎的發(fā)生。該研究首次揭示了m6A修飾在哺乳動物T細胞介導的腸炎中的重要作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，m6A通過促進細胞因子信號轉導抑制物（suppressor of cytokine signaling，SOCS）蛋白家族mRNA降解，來調控IL-17/STAT5信號通路介導的初始T細胞穩(wěn)態(tài)增殖和分化。

4.3 m6A維持Treg細胞免疫抑制功能

Treg是一類具有免疫抑制功能的由初始T細胞分化而來的CD4+T細胞。有研究[31]發(fā)現(xiàn)，m6A具有維持Treg細胞免疫抑制功能的作用。該研究顯示Treg細胞特異性缺失Mettl3的小鼠，在斷乳后表現(xiàn)出外周淋巴結腫大、脾腫大、脫發(fā)等嚴重自身免疫性疾病的表現(xiàn)。出生后10 d和20 d的Mettl3缺失小鼠的Treg細胞在脾和胸腺的比例、數量與野生型小鼠無明顯差異；但在60 d時由于過度炎癥而衰竭，并且Mettl3缺失的Treg細胞免疫抑制功能顯著降低。類似于m6A調控初始T細胞的機制，研究者同樣發(fā)現(xiàn)敲除Mettl3可導致特定Socs基因轉錄物中m6A修飾減少，使得SOCS家族蛋白mRNA表達上調，從而抑制與Treg細胞抑制功能相關的IL-2/STAT5信號通路，使得Treg抑制功能喪失。因此，m6A在調控T細胞分化及維持Treg細胞抑制功能中具有重要的作用，表明m6A可能是自身免疫性疾病治療的一個新靶點。

5 m6A與疾病的關聯(lián)性

5.1 m6A與腫瘤

m6A在基因表達調控中的重要作用表明了其可能參與了腫瘤的發(fā)生。目前，在肝細胞癌[32]、腎癌[33]以及AML[17]等多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)異常的m6A修飾及其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要作用。Gong等[33]研究發(fā)現(xiàn)，m6A在腎細胞癌組織RNA中顯著降低，METTL14通過調控m6A修飾水平減少ATP受體P2RX6蛋白翻譯從而抑制腎細胞癌轉移。Li等[17]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO高表達于AML的t(11q23) /MLL-重組、t(15;17)/PML-RARA、FLT3-ITD或NPM1突變亞型中。FTO可通過降低AML轉錄物中m6A水平，調節(jié)ASB2、RARA等靶基因的表達，促進白血病癌基因介導的細胞轉化和白血病發(fā)生，并抑制全反式維甲酸（alltrans retinoic acid，ATRA）誘導的AML細胞分化。因此，異常的m6A修飾與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。

5.2 m6A與心血管疾病

心血管疾病是慢性腎臟病主要的并發(fā)癥和死亡原因。Dorn等[34]發(fā)現(xiàn)，心肌細胞METTL3表達增加可導致心臟代償性肥大，但不影響心臟功能，而METTL3基因敲除可誘導心肌重構，并表現(xiàn)出心臟衰竭的形態(tài)學和功能性的體征。Mathiyalagan等[35]提出，F(xiàn)TO可選擇性地去甲基化心肌收縮轉錄物，從而防止其降解并提高其在缺血時的蛋白表達。此外，在心肌梗死小鼠模型中FTO的過表達可降低纖維化和增加血管生成。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）在人類基因組中廣泛存在。研究[36]顯示，m6A相關的SNPs可能與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)病機制有關，其中SNP rs12286在全基因組與該病顯著相關。

5.3 m6A與糖尿病

糖尿病是繼發(fā)性腎病的主要病因之一。研究[37]顯示，m6A可能是2型糖尿病的新型標志物。與對照組比較，2型糖尿病患者及糖尿病大鼠的RNA中m6A含量顯著降低，并且2型糖尿病患者FTO的mRNA表達量顯著高于對照組。Yang等[37]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者與FTO血糖水平呈正相關，并且在人肝癌細胞中，高血糖水平可顯著上調FTO蛋白表達量。因此，高血糖水平可能是導致2型糖尿病患者FTO表達增加的刺激因子。

5.4 m6A與自身免疫性疾病

自身免疫性疾病是一類由于機體對自身抗原發(fā)生免疫反應而導致自身組織損害的疾病，也是繼發(fā)性腎臟疾病的主要病因之一?；谠诿庖哒{節(jié)尤其是T細胞穩(wěn)態(tài)和分化中的重要作用，m6A可能與自身免疫性疾病的發(fā)病機制息息相關。目前，已有研究[38]顯示m6A相關的SNPs（m6A-associated SNPs，m6A-SNPs）可能在類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的發(fā)病中扮演重要的角色；該研究共發(fā)現(xiàn)37個在亞洲或歐洲人的全基因組水平上與RA顯著相關的m6A-SNPs，其中包括編碼主要組織相容性復合體的基因，如C6orf10中的rs1033500和HLA-DPB1中的rs1042136，為研究m6A與RA以及自身免疫性疾病之間的關系提供了新的思路。

6 總結與展望

目前，m6A作為真核細胞中最常見、最豐富的mRNA轉錄后修飾，已經得到了研究者們的廣泛關注。甲基轉移酶、去甲基酶以及閱讀蛋白調控的動態(tài)可逆的甲基化過程是m6A表觀遺傳調控功能的基礎。m6A在免疫細胞分化及調控功能中的重要作用表明其可能是免疫相關性疾病治療的一個新靶點。因此，進一步研究m6A在免疫相關性疾病及其繼發(fā)的腎病中的作用，可能為該類患者的治療帶來新的希望。