測試人牙周膜粘彈性力學(xué)特性的納米壓痕實驗條件研究

施昊天，鹿如鑫，劉 鑫，劉 懋，黃輝祥，吳 斌，嚴(yán) 斌

牙周膜(periodontal ligament,PDL)是牙齒和牙槽骨之間的重要連接組織，在正畸力作用下其介導(dǎo)牙槽骨的改建，影響牙齒的移動[1]。研究牙周膜的力學(xué)行為是正確理解正畸生物力學(xué)機制以及合理預(yù)測正畸治療結(jié)果的關(guān)鍵。牙周膜為一種厚度為0.15～0.38mm的結(jié)締組織[2]，主要由纖維、細(xì)胞和基質(zhì)組成，其中基質(zhì)中含有70%左右的水。以往研究表明牙周膜是一種典型的非線性材料[3]，多樣的成分組成導(dǎo)致其力學(xué)特性非常復(fù)雜，兼具彈性和粘性。力學(xué)實驗是精確了解牙周膜組織力學(xué)特性的最佳方法，傳統(tǒng)的反應(yīng)力學(xué)特性的實驗包括拉伸、壓縮、剪切等，但體內(nèi)實驗在現(xiàn)有的條件下難以開展[4]，已有的實驗研究中大部分是宏觀的拉伸實驗[5-6]。而牙周膜結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性以及受樣本制備與儀器功能的限制，導(dǎo)致宏觀實驗獲得的牙周膜組織力學(xué)特性參數(shù)并不夠精確。

納米壓痕是一種在微小區(qū)域內(nèi)測試力學(xué)性能的有效實驗方法，近年來被廣泛應(yīng)用于軟骨、角膜等生物材料[7]，具有精度高、對樣品形狀要求低、操作簡便等優(yōu)點[8]。對于粘彈性材料，為在微觀層面測試其力學(xué)性能，需開展的納米壓痕實驗通常包括基于納米壓痕的蠕變實驗[9]和基于納米壓痕的約化彈性模量測試[10]，前者主要通過納米壓痕時間-位移曲線的保載段變化研究材料的粘性特征，而后者主要通過載荷-位移曲線的卸載段變化研究材料的硬度和約化彈性模量等彈性屬性。

Ashrafi等[11]使用Berkovich壓頭將牙周膜視為一種普通的韌帶進行實驗獲得了時間和蠕變?nèi)岫汝P(guān)系的曲線，但樣本量僅為一顆人牙。傅肄芃等[8]通過Oliver-Pharr法[12]得到并比較了犬牙根不同層面的牙周膜的約化彈性模量；Huang和Wu等[13-14]使用豬和犬的牙周膜組織開展了納米壓痕實驗，并通過有限元法模擬了實驗過程，從而驗證了粘彈性模型的適用性。但上述研究存在以下缺陷，包括：①動物牙周膜樣本不能完全反映人牙周膜特性；②部分壓頭，如Berkovich壓頭的選擇不適用于軟組織實驗[15]；③未強調(diào)保濕條件，可能影響結(jié)果的穩(wěn)定性[16]；④蠕變實驗中未強調(diào)加載率的控制以盡可能達到階躍載荷[17]；⑤基于納米壓痕的約化彈性模量測試中未嚴(yán)謹(jǐn)控制參數(shù)條件消除蠕變效應(yīng)[10]；⑥載荷的選擇過小，導(dǎo)致應(yīng)力應(yīng)變曲線不完整。

因此，為了獲得更準(zhǔn)確的人牙周膜納米壓痕實驗數(shù)據(jù)，需要對納米壓痕實驗條件和參數(shù)進行控制。本研究應(yīng)用人牙周膜樣本，使用0.2mm直徑的平頭壓頭，在對保濕條件進行穩(wěn)定控制的條件下，分別研究基于納米壓痕的蠕變實驗和約化彈性模量測試的合適參數(shù)范圍，包括加載率、保載時間和峰值載荷等，以期獲得更合理的測試人牙周膜粘彈性力學(xué)特性的納米壓痕實驗方案，為明確人牙周膜力學(xué)特性提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料與儀器

健康人類上頜骨3個[24～52歲，南京醫(yī)科大學(xué)倫審(2019)324號]。

納米壓痕儀(Nano Indenter G200，Agilent，美國)，壓頭為可替換的金剛石圓柱形平頭壓頭(半徑為100μm)，見圖1A；低速切割機(IsoMet, Buehler, 美國, 500r/s)，見圖1B；自制保濕容器(專利申請?zhí)枺篊N109520837A)；切片石蠟(上海華靈康復(fù)機械廠，熔點 56～58 ℃)；迷你鋼鋸(SATA，304.8mm)；圖表制作軟件Origin(Version 9，origin-lab，美國)。

A：納米壓痕儀,B：低速切割機

圖1主要實驗儀器圖

Fig.1Experimental instruments

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本制作與處理 樣本制備當(dāng)日從-20 ℃冰箱中取出人上頜骨，如圖2A，去除軟腭、牙齦等軟組織。使用骨鋸切取人上頜切牙樣本9個，在石蠟包埋下用低速切割機切為垂直于根長軸的(2.0±0.3)mm的厚切片，如圖2B。每例樣本牙取根中段，如圖2C，共獲取9個包含牙周膜的人切牙根中段樣本。切割好的樣本置于生理鹽水中并保存在-20 ℃環(huán)境下[18]。實驗當(dāng)天，從冷凍室中取出樣本于室溫下解凍，測試室的溫度保持在環(huán)境溫度25 ℃。

A：人上頜骨樣本；B：低速切割機切割后的人前牙樣本；C：不同牙根位置的樣本

圖2樣本預(yù)備示意圖

Fig.2Preparation of samples

1.2.2 基于納米壓痕的蠕變實驗 ①加載率的確定：將解凍后的來自不同上頜骨的3個牙周膜根中段樣本(樣本1、2、3)置于保濕容器中并固定于納米壓痕儀器加載臺上，自制保濕容器見圖3。在樣本周圍滴注生理鹽水后，于100倍光鏡下選取牙周膜寬度>0.2mm的實驗位點并開始納米壓痕實驗，分別選取(0.1 mN/s、0.3 mN/s、0.5 mN/s、0.7 mN/s)的加載率加載至3 mN后直接卸載，每個點均使用平頭壓頭反復(fù)進行壓痕，每次壓痕間隔15min以待牙周膜充分恢復(fù)，每個參數(shù)重復(fù)3次實驗以驗證可重復(fù)性。②蠕變實驗：將所得數(shù)據(jù)作載荷-位移曲線，選取合適的加載率參數(shù)，進行保載200 s的蠕變實驗。

圖3 保濕裝置與根中部樣本

1.2.3 基于納米壓痕的約化彈性模量測試 ①保載時間的確定。在基于納米壓痕的約化彈性模量測試中需使用Oliver-Pharr法[12]求約化彈性模量，在使用Oliver-Pharr法時，應(yīng)避免蠕變效應(yīng)的影響，為使蠕變效應(yīng)飽和從而消除其影響，需在峰值載荷下維持足夠的保載時間[19]。Xia等[20]根據(jù)保載段曲線模型擬合所得時間參數(shù)得到進入緩慢鈍化階段的時間節(jié)點，以確定保載時間。使用該定量方法時需使用粘彈性模型，本研究選取Burgers模型，此模型是研究粘彈性材料性狀最常用的模型之一[20-21]，以往研究中，Burgers模型與不同材料的納米壓痕實驗數(shù)據(jù)擬合較好[22]，且可以得出納米壓痕過程中不同材料粘彈性行為的精確變化。使用該模型擬合壓痕曲線保載段的公式如下[23]：h=he+h1(1-e-t/τ)+t/μ。其中，h是壓痕位移，t為保載時間，he是加載階段后的彈性形變。τ為保載達到穩(wěn)定階段所需的緩沖時間，h1為初始段粘彈性系數(shù)，μ為保載段曲線進入穩(wěn)定階段后的線性變化斜率的倒數(shù)[9]。②確定基于納米壓痕的約化彈性模量測試的保載時間范圍。選取另3個不同人牙周膜樣本(樣本4、5、6)，在相同加載率和載荷下，分別使用(25、50、75 s)的保載時間進行實驗，壓痕方法同1.2.2，作載荷-位移曲線。對曲線卸載段使用Oliver-Pharr法計算約化彈性模量，以分析保載時間對約化彈性模量計算的影響，計算得到的約化彈性模量越大，保載時間對其的影響越?。皇褂帽］d時間定量法，擬合保載段曲線以得到時間參數(shù)，并加入10 s緩沖時間以避免誤差[20]。③確定基于納米壓痕的約化彈性模量測試的載荷范圍。取其余3個不同人牙周膜樣本(樣本7、8、9)，在相同加載率和保載時間下，使用(1 mN、2 mN、3 mN、4 mN)峰值載荷進行納米壓痕實驗，壓痕方法同1.2.2，作載荷-位移曲線及蠕變速率曲線。識別不具有完整性的載荷-位移曲線，以排除過小的載荷范圍。計算比較不同載荷下的約化彈性模量和蠕變速率，分析適合基于納米壓痕的約化彈性模量測試的載荷范圍。

2 結(jié) 果

2.1 基于納米壓痕的蠕變實驗

在使用0.1、0.3、0.5、0.7 mN/s 4種加載率進行納米壓痕實驗時，每種加載率參數(shù)重復(fù)3次實驗的載荷-位移曲線趨勢近似相同，具有可重復(fù)性。為便于觀察消除誤差，將每個參數(shù)所得載荷及位移數(shù)據(jù)取平均后作圖(圖4)。圖像顯示，隨著加載率減小，加載段的峰值載荷和最大壓痕位移增大。為分析比較加載率對壓痕曲線穩(wěn)定性的影響，取每次實驗加載段達到的最大載荷作加載率-最大載荷趨勢圖(圖5)，發(fā)現(xiàn)0.3～0.5mN/s的加載率既能達到2.9～3.0mN的峰值載荷，也有相對較短的加載時間，為較適合人牙周膜基于納米壓痕的蠕變實驗的加載率參數(shù)范圍，而選取0.5mN/s加載率可達到更接近階躍載荷的效果。

A：樣本1;B：樣本2;C：樣本3

圖4載荷-位移關(guān)系圖

Fig.4Load-displacement diagram

圖5 加載率-最大載荷趨勢圖

選取0.5mN/s加載率進行保載200s的蠕變實驗，時間-位移曲線如圖6所示，表明了人牙周膜具有蠕變行為。

圖6 納米壓痕蠕變曲線

2.2 基于納米壓痕的約化彈性模量測試

2.2.1 保載時間范圍 分別使用25、50、75 s的保載時間進行基于納米壓痕的約化彈性模量測試，對卸載段使用Oliver-Pharr法進行約化彈性模量計算，發(fā)現(xiàn)約化彈性模量隨保載時間增長呈遞減趨勢(見圖7)，因此應(yīng)盡量選取較短的保載時間以避免其對約化彈性模量計算的不利影響。

圖7 約化彈性模量變化隨保載時間變化趨勢圖

使用Burgers模型對曲線保載段進行擬合(見圖8)，比較3組樣本擬合所得的時間參數(shù)τ，分別為15.6、14.9、15.7s。即0.5mN/s加載率下牙周膜蠕變曲線在保載開始后約15s達到緩慢鈍化階段，此時進行壓痕卸載，即可基本避免蠕變效應(yīng)的影響。同時為避免誤差，參考Xia等[20]的方法在15s的基礎(chǔ)上增加10s的緩沖時間，以優(yōu)化實驗結(jié)果。最終，選取25s作為基于納米壓痕的約化彈性模量測試的保載時間參數(shù)。

圖8 75s保載段曲線擬合Burgers模型

2.2.2 峰值載荷范圍 分別使用1、2、3、4mN的峰值載荷進行基于納米壓痕的約化彈性模量測試結(jié)果如圖9所示，載荷為1mN時，曲線不完整。圖10A、B分別為不同載荷下的保載段時間-位移曲線和時間-蠕變速率曲線，在1～3mN的峰值載荷下，蠕變曲線更早達到穩(wěn)態(tài)。蠕變速率在保載初始迅速下降，隨后趨于平緩，當(dāng)載荷小于3mN時，蠕變速率在保載時間達到20s后幾乎已降至穩(wěn)定，但載荷4mN以上的蠕變速率在保載20s時仍然較大。為避免過大的蠕變效應(yīng)，峰值載荷選取不宜大于4 mN。

圖9 載荷-位移曲線圖

A：保載段時間-位移曲線；B： 保載段時間-蠕變速率關(guān)系

圖10保載時間-蠕變速率關(guān)系圖

Fig.10Curve of relationship between loading timeand creep rate

使用Oliver-Pharr法求取2～4mN載荷實驗的約化彈性模量范圍為0.012～6.840 MPa，如圖11所示，其值隨峰值載荷的增加而降低。4mN時載荷對于彈性模量計算值的影響較大。提示2～3mN為較合理的實驗參數(shù)范圍。

3 討 論

蠕變?yōu)檎硰椥缘闹饕憩F(xiàn)形式，蠕變實驗可反映粘彈性材料在受力狀態(tài)下的穩(wěn)定性和長期負(fù)載能力[24]。Ashrafi等[11]使用人牙周膜得到了時間-蠕變?nèi)岫惹€，但并未給出具有蠕變行為的時間-位移曲線。本實驗觀察到，人牙周膜在保載200s的過程中出現(xiàn)了長期非彈性形變逐漸增加的蠕變行為，證明了人牙周膜不僅有彈性特征，還有粘彈性材料特有的時間依賴性特性。

納米壓痕蠕變實驗加載段為斜坡載荷，而理想的拉伸蠕變?yōu)槭┘与A躍載荷。本研究中，0.1mN/s的加載率過慢，壓痕位移較大，即在加載過程中會產(chǎn)生額外的粘彈性形變[25]。0.7mN/s的加載率與預(yù)設(shè)載荷偏離較遠(yuǎn)，根據(jù)Yang等[17]研究，過快的加載率會導(dǎo)致預(yù)設(shè)壓痕載荷出現(xiàn)較大的超調(diào)，易引起峰值載荷的失穩(wěn)。因此，為了減輕粘彈性形變的影響，選擇0.3～0.5mN/s的加載率可在保持較快加載率的同時盡量保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性。

以往基于納米壓痕測試牙周膜的約化彈性模量時并未對保載時間進行控制與分析。本實驗結(jié)果顯示(見圖5)，蠕變速率最初隨著保載時間的推移迅速降低到接近穩(wěn)定狀態(tài)，在15s后進入緩慢鈍化階段?？赡苁请S著保載時間的延長，纖維間的相對運動越來越劇烈，使得粘性得到充分表達，引起蠕變速率的迅速變緩。這也印證了在消除蠕變效應(yīng)的同時不宜選取過長的保載時間。本研究中選取25s的保載時間測試彈性模量取得了較好的效果，未發(fā)現(xiàn)蠕變效應(yīng)的不利影響。

以往對人牙周膜的納米壓痕實驗常使用小于等于1mN的載荷[8]，本實驗發(fā)現(xiàn)，此時加載段曲線未完全展開，牙周膜纖維性質(zhì)未充分表達，難以算得精確的彈性模量。但載荷設(shè)定過大也存在不利影響。本實驗中，隨峰值載荷增大，約化彈性模量降低，考慮為蠕變效應(yīng)增大可能導(dǎo)致牙周膜纖維的軟化[26]。同時，由于壓痕深度增大，接觸面積增加[27]，導(dǎo)致牙周膜纖維的自恢復(fù)更顯著地發(fā)生在壓頭周圍的區(qū)域中。此外，更深的壓痕深度會使牙周膜表層纖維和基底的關(guān)系發(fā)生變化。雖然牙周膜樣本厚度足夠，但由于其并非各向同性的整體，而是多層牙周膜纖維的堆疊，同樣可能存在基底效應(yīng)[28]。因此，在牙周膜納米壓痕設(shè)定載荷時，還需要考慮到對壓痕深度和峰值載荷進行限定，防止約化彈性模量計算精度的下降。本實驗結(jié)果表明，2～3mN是測試約化彈性模量時較合適的載荷范圍。

在以往的研究中，最常被使用的壓頭為Berkovich壓頭，此類壓頭尖端鋒利，由彈性到塑性行為的轉(zhuǎn)變幾乎瞬間發(fā)生，更適用于剛性材料的實驗[15]。而本研究使用平頭壓頭具有以下優(yōu)勢：①在壓痕過程中，接觸面積保持不變，因此接觸壓力隨壓痕載荷的線性增大而增大，便于約化彈性模量的計算；②壓痕中心周圍的堆積或下沉對壓痕應(yīng)力沒有影響，體現(xiàn)為蠕變曲線的穩(wěn)定；③載荷與位移曲線可顯示一個清晰的屈服點，可以更容易更準(zhǔn)確地與材料性能相關(guān)聯(lián)。同時，使用大半徑的平頭用于軟組織的納米壓痕測試可使其工作范圍更大。牙周膜的寬度為0.15～0.38mm，因此,選用0.2mm直徑的平頭壓頭，既能適應(yīng)牙周膜的寬度，又能減少表面粗糙度對實驗結(jié)果的不利影響。

Yamashita等[29]的研究表明，溫度對膠原纖維的粘彈性沒有產(chǎn)生顯著影響，而組織的含水量對其粘彈性有顯著影響。本實驗使用保濕裝置增加了數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，減少了機械反應(yīng)改變的風(fēng)險；然而，即使樣品已經(jīng)保溫保濕，實驗環(huán)境仍然無法模擬真正的生理狀態(tài)。未來可發(fā)展更先進便捷的表面處理技術(shù)和體內(nèi)測試技術(shù)以提供更接近真實的實驗數(shù)據(jù)。

4 結(jié) 論

本文對人牙周膜納米壓痕實驗的實驗條件和優(yōu)化參數(shù)范圍進行了初步研究，得出了以下結(jié)論：①本研究通過基于納米壓痕的蠕變實驗驗證了人牙周膜的粘彈性性質(zhì)，通過基于納米壓痕的約化彈性模量測試得到了人牙周膜的約化彈性模量為0.012～6.840 MPa；②人牙周膜基于納米壓痕的蠕變實驗建議使用0.3～0.5 mN/s的加載率；③人牙周膜基于納米壓痕的約化彈性模量測試建議使用25 s的保載時間和2～3 mN的峰值載荷以消除蠕變效應(yīng)的影響。本研究獲得了合理的測試人牙周膜粘彈性力學(xué)特性的納米壓痕實驗方案，為明確人牙周膜力學(xué)特性提供了參考。