總前列腺特異性抗原熒光免疫層析定量檢測(cè)試劑的研究及應(yīng)用

朱利國(guó)，劉 云，陳永偉，施龍順，孫 萍，吳 國(guó)

（1.江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所附屬江原醫(yī)院，江蘇 無錫 214063；2.江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所，江蘇 無錫 214063；3.國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

前列腺疾病是我國(guó)中老年男性泌尿系統(tǒng)中的一種常見疾病。目前，我國(guó)已經(jīng)步入老齡化，前列腺疾病不僅在中老年中高發(fā)多見，而且有年輕化趨向。在臨床上前列腺特異性抗原（tPSA）常常被用作早期發(fā)現(xiàn)、早期篩查前列腺癌的重要指標(biāo)[1-2]。目前常見的tPSA方法學(xué)檢測(cè)主要有ELISA、化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）、電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）、時(shí)間分辨熒光免疫分析（TRFIA）等。這幾種方法都存在操作步驟繁瑣且反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)的共性問題，我們研發(fā)的tPSA熒光免疫層析定量檢測(cè)方法，可以有效地縮短樣本檢測(cè)時(shí)間[3-4]，以便更好地為臨床服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2018年1月—2019年5月于江蘇省江原醫(yī)院門診、住院就診患者和體檢中心體檢人群90 名，年齡38～83 歲，均為男性，晨起空腹抽取3 mL血液，分離血清后備用。

1.2 試劑與儀器 標(biāo)記兩株不同點(diǎn)位的抗tPSA抗體L1、檢測(cè)抗體C1、質(zhì)控抗體Q1（羊抗鼠IgG）、熒光微球、tPSA標(biāo)準(zhǔn)品、AFP標(biāo)準(zhǔn)品均來自無錫市江原實(shí)業(yè)技貿(mào)公司；ECLIA tPSA試劑盒、tPSA質(zhì)控品均為羅氏公司產(chǎn)品；CA199標(biāo)準(zhǔn)品，為達(dá)安公司產(chǎn)品；硝酸纖維素膜來自美國(guó)Merck-Millipore公司；樣品墊、聚酯膜、底板、吸水紙采購(gòu)于上海杰一公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純；HG-98免疫熒光檢測(cè)儀為上?；焦井a(chǎn)品。

1.3 制備方法

1.3.1 抗體標(biāo)記熒光微球：使用pH 7.2～7.6的MES活化緩沖液洗滌熒光微球，加入碳二亞胺（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），室溫反應(yīng)20～30 min，洗滌熒光微球，用0.05 mol/L pH 7.2～7.6的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶后加入標(biāo)記抗體L1，室溫反應(yīng)2 h，加入含有10% BSA的0.05 mol/L pH 7.2～7.6的磷酸鹽緩沖液，室溫反應(yīng)30 min，洗滌熒光微球，用含有1% BSA，0.1% Tween-20，0.05 mol/L pH 7.2～7.6的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶至原體積，定量噴涂于聚酯膜上，避光35 ℃～38 ℃烘干1 h，加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 熒光免疫層析試紙條組裝部件處理：(1)樣品墊的處理：使用含1%BSA、0.1%Triton100的0.02 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液浸泡樣品烘干。(2)包被膜的制備：使用含1%蔗糖的0.02 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液，分別將檢測(cè)抗體C1和質(zhì)控抗體Q1稀釋到1 mg/mL，將二者以0.5 cm的間隔噴于硝酸纖維素膜上，烘干后加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 熒光免疫層析試紙條的組裝：在濕度小于35%，穩(wěn)定20 ℃～25 ℃的環(huán)境下，在PVC底板上黏貼上包被膜、結(jié)合了熒光微球標(biāo)記的結(jié)合墊、樣品墊和吸水紙形成微濾體系，切割成0.3 cm寬，裝入卡殼中即制成試紙條（圖1）。

1.4 檢測(cè)方法 用加樣器將20 μL血清標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)參考品加入測(cè)試卡加樣孔中，同時(shí)加入50 μL樣品稀釋液，加樣孔朝外放入孵育器中。連接電源，打開檢測(cè)主機(jī)，膜層析反應(yīng)15 min，運(yùn)行儀器，儀器通過相應(yīng)的分析軟件自動(dòng)計(jì)算出待測(cè)樣本中的tPSA濃度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將tPSA標(biāo)準(zhǔn)品制成6個(gè)不同的濃度，分別為0、2、4、10、50、100 ng/mL，每個(gè)濃度做5個(gè)平行樣。膜層析反應(yīng)15 min后，儀器讀取T、C線信號(hào)。

與ECLIA檢測(cè)試劑盒比較：按ECLIA試劑盒要求將90份血清標(biāo)本與免疫層析法同時(shí)進(jìn)行平行檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)結(jié)果判讀 檢測(cè)時(shí)，液體在層析作用下前移動(dòng)，若血清標(biāo)本中tPSA的含量過少，試樣中的tPSA與結(jié)合墊上標(biāo)記抗體L1結(jié)合的熒光微球結(jié)合形成復(fù)合物C1則相應(yīng)較少，結(jié)合墊中的標(biāo)記抗體L1與C線上的質(zhì)控抗體Q1大量結(jié)合，因此T線將比C線熒光值低很多，結(jié)果為陰性；若試樣中tPSA的濃度較大，則復(fù)合物C1相應(yīng)較多，與T線處的檢測(cè)抗體C1結(jié)合并大量形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物C2，而且試樣中tPSA越高, T線熒光值越高，結(jié)果為陽(yáng)性。無論是陽(yáng)性還是陰性結(jié)果，因鼠源性抗體標(biāo)記的熒光微球過量包被，因而總有未結(jié)合檢測(cè)抗體C1的部分熒光微球與C線處的羊抗鼠IgG結(jié)合，在C線處出現(xiàn)熒光微球的聚集。如果C線沒有出現(xiàn)熒光計(jì)數(shù)，無論T線有無熒光條帶，結(jié)果均無效（圖1）。

圖1 tPSA熒光免疫層析檢測(cè)試紙結(jié)構(gòu)圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 按照統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，以檢測(cè)樣品熒光值信號(hào)為縱坐標(biāo)，tPSA標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，建立方程并擬合成標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。該標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2為0.9779，線性較好，符合定量檢測(cè)的要求。

圖2 tPSA熒光免疫層析試紙條標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 tPSA免疫層析熒光試紙條性能評(píng)價(jià) (1)靈敏度：重復(fù)測(cè)定零劑量點(diǎn)（20 次），以±2s的熒光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到的相應(yīng)值為檢測(cè)低限，相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)靈敏度平均值為0.02 ng/mL。(2)穩(wěn)定性和精密度：免疫層析熒光試紙條法檢測(cè)tPSA高、低兩個(gè)質(zhì)控品濃度（39.6 ng/mL，4.26 ng/mL）的批內(nèi)和批間CV（n＝10）。結(jié)果顯示，批內(nèi)CV為3.86%、4.68%，平均批內(nèi)CV為4.27%，批間CV為6.22%、7.5%，平均批間CV為6.86%，均低于10%，表明免疫層析熒光試紙條法檢測(cè)tPSA精密度良好。同一批試劑4 ℃放置6 個(gè)月后，熒光計(jì)數(shù)無明顯變化（P＞0.05），說明該方法穩(wěn)定性較好。(3)準(zhǔn)確度：用10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品分別加入到含量為1.980、4.58、15.66 ng/mL的血清中進(jìn)行回收試驗(yàn)，回收率分別為105.2%、101.3%、98.1%；平均回收率為101.5%。(4)特異性：將1 000 U/mL的AFP、500 ng/mL的CEA高濃度標(biāo)準(zhǔn)品作為樣品，用tPSA免疫熒光層析試紙條進(jìn)行檢測(cè)，各濃度點(diǎn)測(cè)定值分別為1.82 ng/mL、1.02ng/mL，說明兩者無交叉反應(yīng)，方法特異性好。

2.4 與ECLIA方法的比較 按ECLIA試劑盒要求將90 份血清標(biāo)本與免疫層析法同時(shí)進(jìn)行平行檢測(cè)并對(duì)所有檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，免疫層析試紙條與ECLIA試劑盒的相關(guān)系數(shù)為R2＝0.9945（圖3），平均相對(duì)偏倚為18.39%，兩種方法高度相關(guān)；ECLIA試劑盒CUT-off值為4.0 ng/mL，其中ECLIA試劑盒檢測(cè)出的陽(yáng)性血清標(biāo)本采用熒光免疫層析試紙檢測(cè)均為陽(yáng)性。

圖3 熒光免疫檢測(cè)試紙條-ECLIA試劑盒相關(guān)性

3 討論

tPSA是一種蛋白酶[5]，主要由前列腺腺泡、導(dǎo)管細(xì)胞分泌，具有提高精子活力和液化精液的效果。由于屏障隔離的原因，正常情況下tPSA在血液中含量極少，但當(dāng)前列腺發(fā)生病變時(shí)可引起血液中tPSA含量增高，所以tPSA可作為一種有效標(biāo)志物。tPSA具有前列腺器官的特異性，但tPSA非前列腺特異性抗原，不具有相應(yīng)的腫瘤特異性[6-7]，良性前列腺疾病和惡性前列腺疾病都可以讓患者的tPSA水平升高，但tPSA仍然具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值，被臨床作為一種穩(wěn)定有效的早期篩查方法，在病變?cè)缙凇熜гu(píng)價(jià)、預(yù)后判斷等方面發(fā)揮重要作用。由于多數(shù)前列腺癌患者早期常無特異性的臨床表現(xiàn)，僅在臨床超聲檢查或外科直腸指檢時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)，經(jīng)直腸穿刺活檢是前列腺癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但有一定的漏診率，患者臨床檢查的依從性相對(duì)較低。血清tPSA的檢測(cè)操作簡(jiǎn)單，對(duì)病人而言沒有痛苦，檢查的依從性較好，建議45 歲以上的男性應(yīng)當(dāng)進(jìn)行血清tPSA的常規(guī)普查，特別可以用于特定人群的篩查。

目前常見的tPSA方法學(xué)檢測(cè)主要有ELISA、CLIA、ECLIA、TRFIA等，以上幾種檢測(cè)方法均具備較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，但對(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)而言都具有耗時(shí)長(zhǎng)、操作相對(duì)繁瑣等缺點(diǎn)，單項(xiàng)檢測(cè)成本高昂，手工操作容易產(chǎn)生人為誤差，儀器設(shè)備的高投入及對(duì)操作人員的高要求一定程度上限制了其在臨床的應(yīng)用。我們開發(fā)研制的tPSA熒光免疫層析試紙條能夠符合床旁檢測(cè)（point of care test, POCT）要求，具有較高的靈敏度，精密度良好（批內(nèi)、批間誤差小），與ECLIA法檢測(cè)所得結(jié)果沒有顯著差異（R2＝0.9945），但是操作簡(jiǎn)單，快速、靈敏。檢測(cè)儀器體積小、便于攜帶，試劑易于保存，完全符合POCT的臨床應(yīng)用要求[8]。本方法采用雙抗體夾心檢測(cè)反應(yīng)模式，將標(biāo)記抗體的熒光納米微球作為示蹤物，噴涂在結(jié)合墊上，另一抗體固定于試紙的T線區(qū)，滴加樣本后在層析作用下移至結(jié)合墊，形成熒光微球-抗抗體-抗體，繼續(xù)層析至T線區(qū)，被固定在T線區(qū)的抗體捕獲，形成熒光微球-抗抗體-抗體-抗抗體復(fù)合物，通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以得到相應(yīng)的血清標(biāo)本濃度。

采用該熒光免疫層析試紙條可實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便、快速、單人份定量檢測(cè)，更適應(yīng)臨床檢驗(yàn)特別是基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的臨床篩查需求，同時(shí)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)儀器和試劑的產(chǎn)業(yè)化，達(dá)到較好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益，值得臨床推廣應(yīng)用。