特丁噻草隆降解菌的分離鑒定及降解特性

任建軍 牛東澤 湯姚 張晉 田英申 李春雨

關(guān)鍵詞：特丁噻草隆;降解菌;生物降解

中圖分類號：S482.4文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2020）02-0526-03

Key words：tebuthiuron;degrading bacteria;biodegradation

隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的不斷發(fā)展，農(nóng)藥被廣泛應(yīng)用于病蟲害的防治中，這極大地提高了糧食產(chǎn)量。但是，農(nóng)藥的頻繁使用和超劑量施用會導(dǎo)致土壤中農(nóng)藥殘留量超標(biāo)，特別是新型農(nóng)藥具有熱穩(wěn)定性強、不易光解等特點，很難在自然條件下快速降解[1-2]。土壤中的農(nóng)藥殘留不僅影響食品安全，也給人畜的生活環(huán)境和健康帶來了巨大威脅[3]。因此，有效解決土壤中農(nóng)藥殘留帶來的污染問題已迫在眉睫。

目前，常用的土壤農(nóng)藥殘留修復(fù)技術(shù)包括物理修復(fù)技術(shù)、化學(xué)修復(fù)技術(shù)和生物修復(fù)技術(shù)。但是，物理修復(fù)技術(shù)和化學(xué)修復(fù)技術(shù)主要用于修復(fù)工業(yè)污染農(nóng)田的土壤[4]，因其存在設(shè)備昂貴，處理成本高，可能產(chǎn)生二次污染等問題，所以很少用于修復(fù)農(nóng)藥污染的農(nóng)田土壤[5]。生物修復(fù)技術(shù)具有成本低，無二次污染，可以改善土壤結(jié)構(gòu)等優(yōu)點，能夠降解農(nóng)藥等大多數(shù)有機污染物，可將污染物徹底分解為二氧化碳、水、無機化合物等對環(huán)境和人畜無害的物質(zhì)[6-7]。

特丁噻草隆是一種滅生性的雜環(huán)取代脲類除草劑[8]，因其具有藥效高、毒性小等特點而被用于控制多種農(nóng)林作物的雜草，并且因其在土壤和水體中的高溶解度、低生物降解性及潛在的可致癌性，受到學(xué)者的廣泛關(guān)注[9]。但是，目前關(guān)于特丁噻草隆微生物降解的研究較少。因此，本研究擬篩選特丁噻草隆的高效降解菌，并研究其對特丁噻草隆的降解特性，以期為特丁噻草隆污染的修復(fù)提供方法和理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試儀器及試驗材料

特丁噻草隆純品及主要化學(xué)試劑（分析純）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分子生物試劑購自寶生物工程（大連）有限公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自于南京奧青生物技術(shù)有限公司。土壤樣品由河北慈心環(huán)?？萍加邢薰咎峁?，采集于長期施用特丁噻草隆的農(nóng)田以及特丁噻草隆生產(chǎn)工廠排污口的污泥。試驗主要器材包括：恒溫?fù)u床、電泳儀、自動凝膠圖像分析儀、恒溫培養(yǎng)箱、高速離心機、高壓滅菌鍋、通風(fēng)干燥箱、超純水儀、紫外分光光度計、高效液相色譜儀、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。

基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基：KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 1.5 g、NaCl 1.0 g、（NH4）2SO4 2.0 g、MgCl2 0.1 g、去離子水1 000 ml、pH 7.0，以特丁噻草隆為碳源，根據(jù)需要調(diào)整特丁噻草隆的濃度，基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中再添加1.5%的瓊脂。Luria-bertani（LB）培養(yǎng)基：酵母粉5.0 g、氯化鈉10.0 g、胰蛋白胨10.0 g、去離子水1 000 ml，LB固體培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基中再添加1.5%的瓊脂。

1.2試驗方法

1.2.1富集與分離

取5 g特丁噻草隆污染土樣，加入特丁噻草隆質(zhì)量濃度為100 mg/L的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，置于37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)7 d，以3%的接種量將其接入相同的培養(yǎng)基中，傳代3次。取1 ml富集培養(yǎng)物分別進行梯度（1×10-5、1×10-6、1×10-7）稀釋，用移液槍吸取100 μl，分別涂布于特丁噻草隆質(zhì)量濃度為100 mg/L的基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)35 d，選擇有透明光圈的菌落在LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落，通過培養(yǎng)得到純化菌株。

1.2.2菌株鑒定

通過16S rRNA基因序列鑒定純化菌株的種屬[10]。以降解菌的基因組DNA為模板，擴增16S rRNA基因，用16S通用引物，即27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′。25.00 μl擴增體系為：10×Buffer 2.50 μl，脫氧核糖核苷三磷酸（2.5 mmol/μl） 2.00 μl，引物（25.0 mmol/μl）各0.75 μl，MgCl2（25.0 mmol/μl） 2.50 μl，模板DNA 0.25 μl，rTaq DNA聚合酶（5 U/μl） 0.20 μl，用雙蒸水（ddH2O）補齊至25.00 μl。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）條件為：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35次，72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序，基因序列在NCBI上進行Blast比對分析，并與GenBank中其他菌株的16S rRNA基因序列進行同源性比較，利用Mega 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.3特丁噻草隆質(zhì)量濃度的測定

發(fā)酵樣品過濾后，用高效液相色譜法（HPLC）進行檢測[8]，條件為：C18（250.0 mm×4.6 mm，長度×內(nèi)徑）不銹鋼柱，流動相是甲醇+0.1%甲酸/超純水（75/25，體積比），流速為1.0 ml/min，進樣體積為10 μl，柱溫為25 ℃，保留時間為5 min，檢測波長為255 nm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=0.971 8x-2.746 6（R2=0.998 7）計算特丁噻草隆的質(zhì)量濃度。

1.2.4降解菌生長狀況和降解性能的測定

將篩選出的降解菌及其混合菌（等量混合）分別按0.5%接種于含400 mg/L特丁噻草隆的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，置于37 ℃、180 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)7 d，測定特丁噻草隆的質(zhì)量濃度和OD600的吸光值。

1.2.5吐溫-80對特丁噻草隆降解率的影響

將篩選出的降解菌及其混合菌分別按0.5%接種于含400 mg/L特丁噻草隆和0.5%吐溫-80的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，置于37 ℃、180 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)7 d，測定特丁噻草隆的質(zhì)量濃度，并計算降解率。

1.2.6數(shù)據(jù)處理

利用DPS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并用ANOVA方法進行多重比較，采用Duncans方法檢驗差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1特丁噻草隆降解菌的篩選與鑒定

本試驗從受污染的土樣中篩選出15種菌株，對其進行富集馴化、分離純化、初篩和復(fù)篩，最終選出了4株能在以特丁噻草隆作為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基上生長的菌株，并將其分別命名為T2-1、T2-2、T2-3和T2-4。以菌株的總DNA為模板，擴增16S rRNA基因片段1.5 kb左右。將測序結(jié)果提交至NCBI在線Blast上，并用16S rRNA基因序列構(gòu)建進化樹，結(jié)果表明，T2-1為殺香魚假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida），T2-2為臺灣銅綠假單胞菌（Cupriavidus Taiwanensis），T2-3為惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida），T2-4為施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）。

2.2降解菌的生長和降解性能

不同降解菌對特丁噻草隆降解性能的研究結(jié)果表明，降解菌T2-1、T2-2、T2-3、T2-4和混合菌對特丁噻草隆的降解量分別為11.39 mg/L、11.53 mg/L、10.95 mg/L、7.38 mg/L和15.27 mg/L，對應(yīng)的降解率分別為0.028 5、0.028 8、0.027 4、0.018 5和0.038 2。由此可知，混合菌的降解效果最好，在單菌降解中，T2-1和T2-2的降解效果較好。不同降解菌在降解培養(yǎng)基中的生長情況表明，降解菌T2-1、T2-2和T2-4的菌體生物量增長明顯，而T2-3和混合菌的菌體生物量幾乎沒有變化。

2.3 ?吐溫-80對降解菌降解特丁噻草隆效果的影響

結(jié)果表明，降解菌T2-1、T2-2、T2-3、T2-4和混合菌在添加0.5%吐溫-80的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，降解量分別為20.12 mg/L、27.37 mg/L、23.89 mg/L、23.20 mg/L和32.43 mg/L，對應(yīng)的特丁噻草隆降解率分別為0.050 3、0.068 4、0.059 7、0.058 0和0.081 1。由此可知，吐溫-80能夠明顯提高降解菌對特丁噻草隆的降解率。

3討論

用于農(nóng)藥殘留生物修復(fù)的微生物包括芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、克雷伯氏菌屬、黃單胞菌屬等[10-11]。假單胞菌是重要的生物降解資源[11-13]。本研究篩選出4株降解菌，包括殺香魚假單胞菌、臺灣銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌和施氏假單胞菌，均可用于降解環(huán)境中的特丁噻草隆等有機污染物。除此以外，假單胞菌還可以用于生物防治，是具有潛力的生物防治菌種資源[9，14]。微生物降解農(nóng)藥等有機污染物的本質(zhì)是一系列酶促反應(yīng)，單一微生物往往不具備降解有機物所需要的全部酶，因此，多種微生物協(xié)同作用能夠加快有機污染物的降解。有研究結(jié)果表明，紅球菌屬和假單胞菌屬混合培養(yǎng)可以明顯提高氯氰菊酯的降解率[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，殺香魚假單胞菌、臺灣銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌和施氏假單胞菌混合后對特丁噻草隆的降解率更高。表面活性劑充分保證了底物與微生物的接觸，有利于微生物的降解作用[17]。本試驗發(fā)現(xiàn)，吐溫-80能提高假單胞菌對特丁噻草隆的降解率。

盡管本研究對分離菌株的降解率進行了研究，但特丁噻草隆的生物降解途徑和代謝產(chǎn)物尚不明確。在今后的研究中，可以改進代謝產(chǎn)物的提取方法，優(yōu)化檢測系統(tǒng)，進一步探索其降解機理，同時優(yōu)化降解條件，更好地促進其在特丁噻草隆污染修復(fù)中的應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯：王妮）