Box-Behnken中心組合設(shè)計優(yōu)化酶法提取馬齒莧多糖的工藝

陳凌 曹巧巧 張建群

摘要：采用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計，以果膠酶添加量、酶解溫度、料液比為自變量，以多糖得率和羥基自由基（·OH）清除率為因變量，利用響應(yīng)面法優(yōu)化果膠酶酶解提取馬齒莧多糖的工藝。結(jié)果表明，料液比1∶37（g/ml）、果膠酶添加量10.67 g/kg、酶解溫度36.4 ℃、pH值5.0、酶解時間80 min條件下，馬齒莧多糖得率預(yù)測值與測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.29%，模型擬合度較高。體外抗氧化試驗結(jié)果表明，馬齒莧多糖具有較好的抗氧化性。因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化酶法提取馬齒莧多糖工藝條件是可行的。

關(guān)鍵詞：Box-Behnken中心組合設(shè)計;馬齒莧;多糖;酶解提取

中圖分類號：TS201.1文獻標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2020）02-0500-07

Abstract： The Box-Behnken central composite design was used in this study. Taking pectinase addition， hydrolysis temperature and solid-liquid ratio as independent variables， the extraction rate of polysaccharides and the clearance rate of hydroxyl radical（·OH） as dependent variables， the response surface method was adopted to optimize the enzymatic extraction process of polysaccharides from Portulaca oleraceae L.. The results showed that the optimal conditions were as follows∶the solid-liquid ratio was 1∶37 （g/ml）， pectinase addition was 10.67 g/kg， hydrolysis temperature was 36.4 ℃， pH value was 5.0， and enzymolysis time was 80 min. Under the optimal conditions， the relative standard deviation of polysaccharide yield between the predicted value and the measured value was 2.29%， and the model fitting degree was high. The results of antioxidant test in vitro indicated that polysaccharides from Portulaca oleracea L. had better antioxidant properties. Therefore， it is feasible to optimize the extraction conditions of Portulaca oleracea L. polysaccharides by the method of response surface.

Key words：Box-Behnken central composite design;Portulaca oleracea L.;polysaccharide;enzymatic extraction

馬齒莧（Portulaca oleracea L.）為馬齒莧科一年生肉質(zhì)草本植物，在中國分布廣泛，是中國衛(wèi)生部劃定的藥食兩用植物之一[1]。多糖作為馬齒莧藥材中一種非常重要的活性成分，有抗癌、抗氧化和降糖等生物活性作用[2]。馬齒莧多糖對核桃油的抗氧化性較好[3]。因此，有效提取馬齒莧多糖，對開發(fā)多功能食品抗氧化劑具有重要意義。酶法提取多糖使得植物細胞壁及組織能夠快速降解[4]，具有反應(yīng)溫度溫和，易于控制等諸多優(yōu)點[5]。目前，酶法提取馬齒莧多糖的工藝已有一些研究。錢志偉等[6]用纖維素酶提取馬齒莧多糖，呂萍等[7]比較了木瓜蛋白酶、纖維素酶、果膠酶酶解提取馬齒莧多糖的效果，米熱班古·木太力甫等[8]用纖維素酶超聲輔助法提取馬齒莧多糖，上述研究均以多糖含量為指標(biāo)，用正交試驗法研究馬齒莧多糖的提取工藝。李良等[9]建立苯酚-硫酸法的多糖測定原理是：利用濃硫酸將多糖水解成單糖，并迅速脫水生成糠醛衍生物，再與苯酚縮合成有色化合物，用分光光度法測定多糖含量。在酶法提取植物多糖的工藝研究中，若用苯酚-硫酸法測定多糖含量，需要以雙因子為應(yīng)變量，以防止酶解過度產(chǎn)生的葡萄糖對多糖測量結(jié)果的影響。在利用不同酶酶解提取馬齒莧多糖的體外抗氧化試驗中，從馬齒莧多糖對鐵離子（Fe3+）和鈰離子（Ce4+）的還原能力，對超氧陰離子（O2·-）和羥基自由基（·OH）的清除率這4個方面進行綜合評價，發(fā)現(xiàn)果膠酶酶解提取的多糖抗氧化性最強[10]。本研究擬以多糖得率和·OH清除率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法優(yōu)化果膠酶酶解提取馬齒莧多糖的工藝，修正酶解過度產(chǎn)生的誤差，以期為馬齒莧多糖的高效提取提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1試驗材料與試劑

馬齒莧采自嘉興有機農(nóng)業(yè)示范園，經(jīng)嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院園藝教研室陳玉琴副教授鑒定。葡萄糖、濃硫酸、苯酚、無水乙醇、濃鹽酸、水楊酸、雙氧水、檸檬酸、檸檬酸鈉均為分析純，由上海聯(lián)試化工試劑有限公司提供。FeSO4·7H2O由江蘇強盛功能化學(xué)股份有限公司提供，Na2SO4由蘭溪中星化工試劑有限公司提供，Ce（SO4）2·4H2O由北京康普匯維科技有限公司提供，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）由東京化成工業(yè)株式會社提供，VC由天津博迪化工股份有限公司提供，果膠酶（含量99%）由無錫市百瑞多化工產(chǎn)品有限公司提供。

1.2儀器與設(shè)備

試驗所用儀器有CP225D型1/100 000電子分析天平（SATORIOS公司產(chǎn)品）、JP-500B-2型多功能粉碎機（上海久品貿(mào)易有限公司產(chǎn)品）、UV-1102Ⅱ型單光束紫外/可見分光光度計（上海天美科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品）、DK-S24型恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司產(chǎn)品）、DGG-9240BD型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司產(chǎn)品）、Millipore超純水儀（Merck millipore公司產(chǎn)品）、Smartpark DQ3純水柱（Merck millipore公司產(chǎn)品）。

1.3試驗方法

1.3.1馬齒莧多糖的提取新鮮馬齒莧洗凈，50 ℃烘干后粉碎，用石油醚脫脂后50 ℃烘干。以超純水為溶劑，酶解一定時間后，加熱至100 ℃滅酶5 min，離心分離，取上清液，保存于4 ℃冰箱中備用。

1.3.2馬齒莧多糖含量測定采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%），利用分光光度計測定多糖含量[10]。

1.3.3馬齒莧多糖對·OH清除率的測定采用水楊酸捕獲法測定馬齒莧多糖對·OH的清除率[11]。

1.3.4還原能力的測定基于金屬離子還原能力的抗氧化能力評價方式，根據(jù)四價鈰離子[Ce（Ⅳ）]和三價鈰離子[Ce（Ⅲ）]之間的轉(zhuǎn)化度，評價樣品的總還原能力[12]。

1.3.5馬齒莧多糖對DPPH自由基清除率的測定準(zhǔn)確稱取30.6 mg DPPH，用70%乙醇溶解后定容于500.0 ml容量瓶中，作為儲備液貯藏在棕色瓶中，置于4 ℃的冰箱中保存，用時取出。DPPH溶液呈紫紅色，加入抗氧化劑后顏色的變淡程度可以表示其對自由基的清除能力。取0.5 ml馬齒莧多糖溶液，加入10.0 ml DPPH乙醇溶液，搖勻，37 ℃避光反應(yīng)15 min，在523 nm處測定其吸光度（以70%乙醇為空白調(diào)零），重復(fù)測定3次，取平均值。根據(jù)下列公式計算樣品對DPPH自由基的清除率：

DPPH清除率=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%

式中，A0表示加入0.50 ml水時溶液的吸光值，Ai表示加入0.50 ml樣品時溶液的吸光值，Aj表示在0.50 ml樣品中加入70%乙醇的吸光值。

1.3.6單因素試驗按照試驗方法1.3.1中所述的方法提取馬齒莧多糖，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液調(diào)整pH值，酶解后在沸水浴中滅酶5 min。酶添加量（0 g/kg、5.0 g/kg、7.5 g/kg、10.0 g/kg、12.5 g/kg、15.0 g/kg）對馬齒莧多糖得率及·OH清除率的影響，其他提取條件為料液比1∶25（g/ml）、pH值5.0、酶解溫度40 ℃、酶解時間60 min。pH值（3.0、3.4、4.0、4.4、5.0、5.4、6.0）對馬齒莧多糖得率及·OH清除率的影響，其他提取條件為料液比1∶25（g/ml）、酶添加量10.0 g/kg、酶解溫度40 ℃、酶解時間60 min。酶解時間（30 min、60 min、80 min、100 min、120 min、140 min）對馬齒莧多糖得率及·OH清除率的影響，其他提取條件為料液比1∶25（g/ml）、pH值5.0、酶添加量10.0 g/kg、酶解溫度40 ℃。酶解溫度（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃）對馬齒莧多糖得率及·OH清除率的影響，其他提取條件為料液比1∶25（g/ml）、pH值5.0、酶解時間60 min、酶添加量10.0 g/kg。料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g/ml）對馬齒莧多糖得率及·OH清除率的影響，其他提取條件為pH值5.0、酶添加量10.0 g/kg、酶解溫度40 ℃、酶解時間60 min。

1.3.7Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選定對多糖得率和·OH清除率影響較大的3個因素，建立三因素三水平的Box-Behnken中心組合試驗，以多糖得率和·OH清除率為響應(yīng)值，各因素及水平如表1顯示。

1.3.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析所有測定均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。采用Origin Pro 9.0軟件作圖，用Design-Expert 8.0.6軟件進行方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1酶添加量對多糖得率及·OH清除率的影響圖1顯示，隨著果膠酶添加量的增加，馬齒莧多糖的吸光度和·OH清除率均呈先上升后下降的趨勢。這是因為酶添加量增加導(dǎo)致酶解速度加快，當(dāng)果膠酶的添加量大于10 g/kg時，底物全部與酶結(jié)合，多余的酶進一步酶解多糖，使多糖的濃度降低，導(dǎo)致其對·OH的清除率降低，這與鄒雪等[13]的研究結(jié)果相吻合。多糖濃度最大時，其對·OH的清除率并不是最大的，原因可能是測得的多糖包含了酶解過度產(chǎn)生的葡萄糖。因此，選擇果膠酶添加量為10 g/kg。

2.1.2pH值對多糖得率及·OH清除率的影響圖2顯示，pH值小于5.0時，隨著pH值的增大，吸光度和·OH清除率增加。當(dāng)pH值達到5.0后，繼續(xù)增大pH值，吸光度和·OH清除率降低。這是因為在最適pH值時，酶分子上的活性基團發(fā)生解離，其離子最適合與底物結(jié)合，故多糖得率最高，·OH清除率也最大。當(dāng)pH值高于或低于最適pH值時，活性基團的解離狀態(tài)可能發(fā)生改變，酶與底物的結(jié)合力減弱，酶反應(yīng)速率降低，多糖得率降低[14]，·OH清除率也減小。因此，選擇pH值為5.0。

2.1.3酶解時間對多糖得率及·OH清除率的影響圖3顯示，馬齒莧多糖吸光度隨著酶解時間的增加而增加，·OH清除率在酶解時間為80 min時達到最大，之后隨酶解時間的增加而下降。說明，酶解時間對多糖得率有著比較明顯的影響，時間過短，多糖提取不充分，時間過長，可能引起多糖分解，導(dǎo)致其對·OH的清除率減少。綜合考慮，確定酶解時間為80 min。

2.1.4酶解溫度對多糖得率及·OH清除率的影響圖4顯示，酶解溫度為35 ℃時吸光度和·OH清除率最高，酶解溫度為35～55 ℃時，隨著酶解溫度升高，吸光度和·OH清除率下降，這可能是因為溫度升高導(dǎo)致酶失活。酶解溫度高于55 ℃時，吸光度和·OH清除率又開始上升，這是因為提取劑溫度的升高使多糖的提取率增加。因此，最適酶解溫度為35 ℃。

2.1.5料液比對多糖得率及·OH清除率的影響表2顯示，當(dāng)料液比為1∶30（g/ml）時，吸光度及·OH清除率最高。原因可能是當(dāng)提取劑比較少時，不利于多糖的溶出，使得多糖得率較低，對·OH的清除率也較低，而當(dāng)提取劑體積過大時，酶濃度降低導(dǎo)致酶解作用下降，并且多糖成分已充分溶出，因此多糖得率會趨于恒定甚至下降[15]，從而對·OH的清除率恒定甚至降低。因此，采用料液比1∶30（g/ml）來完成進一步的優(yōu)化試驗。

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken的試驗設(shè)計，以酶添加量、酶解溫度、料液比為自變量，以馬齒莧多糖得率和·OH清除率為響應(yīng)值，具體試驗方案見表3。

表4顯示，回歸模型對馬齒莧多糖得率的影響顯著（P=0.024 1<0.050 0，相關(guān)系數(shù)為0.924 4），回歸模型對·OH清除率的影響極顯著（P=0.001 6<0.010 0，相關(guān)系數(shù)為0.975 6），表明該回歸模型的擬合情況良好，回歸模型的代表性較好，能準(zhǔn)確地預(yù)測實際情況。對多糖得率的回歸模型進行分析，酶解溫度與料液比的F值較大，交互作用較大;對·OH清除率的回歸模型進行分析，酶添加量與酶解溫度的F值較大，交互作用較大。

多糖得率的校正決定系數(shù)為0.788 3，表明此模型能解釋78.83%的多糖得率的變化?！H清除率的校正決定系數(shù)為0.931 8，表明此模型能解釋93.18%的·OH清除率變化。多糖得率的變異系數(shù)為0.095 1%，·OH清除率的變異系數(shù)為0.626 1%，說明試驗離散性小，該模型擬合程度較好，試驗誤差小，可以用來進行分析和預(yù)測。由線性項可以看出，酶解溫度對多糖提取率的影響最大，其次是酶添加量，第三是料液比。

采用Design-Expert.V8.0.6軟件制作響應(yīng)面圖，根據(jù)響應(yīng)面圖曲面坡度越陡峭，等高線越密集成橢圓形表示兩因素交互影響越大的原則[16]進行分析。多糖得率響應(yīng)面圖（圖5）顯示，酶解溫度與料液比之間的交互作用較大。·OH清除率響應(yīng)面圖（圖6）顯示，酶添加量與酶解溫度之間的交互作用較大，與表4結(jié)論一致。

2.3驗證試驗

利用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結(jié)果進行優(yōu)化，果膠酶酶解提取馬齒莧多糖的最佳工藝參數(shù)為：酶解pH值5.0、酶解時間80 min、酶添加量10.67 g/kg、料液比1∶37（g/ml）、酶解溫度36.4 ℃。在此條件下，馬齒莧多糖得率理論值為6.06%，對·OH清除率為68.40%。為檢驗響應(yīng)面法所得結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，又考慮到實際操作的情況，將提取工藝參數(shù)修正為：酶解pH值5.0、酶解時間80 min、酶添加量10.67 g/kg、料液比1∶37（g/ml）、酶解溫度36.0 ℃，做3次平行試驗，多糖平均得率為6.20%，與理論預(yù)測值相比，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.29%，基于響應(yīng)面法所得的優(yōu)化提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

2.4馬齒莧多糖與VC抗氧化活性比較

圖7顯示，隨著馬齒莧多糖和VC體積的增加，DPPH清除率也逐漸增加，所試范圍內(nèi)馬齒莧多糖提取液（多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.053%）對DPPH的清除能力小于VC（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.100%）。

圖8顯示，隨著馬齒莧多糖和VC體積的增加，Ce（Ⅳ）還原能力逐漸增加，并呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，所試范圍內(nèi)馬齒莧多糖提取液對Ce （Ⅳ）的還原能力大于VC。

3結(jié)論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對果膠酶酶解提取馬齒莧多糖的工藝進行優(yōu)化，影響馬齒莧多糖提取的工藝因素表現(xiàn)為酶解溫度>酶添加量>料液比。最終確定了其最優(yōu)工藝條件為：酶解pH值為5.0，酶解時間為80 min，酶添加量為10.67 g/kg、料液比為1∶37（g/ml）、酶解溫度為36.4 ℃。回歸模型預(yù)測多糖得率為6.06%，驗證試驗的馬齒莧多糖得率為6.20%。體外抗氧化試驗結(jié)果表明，馬齒莧多糖具有較好的抗氧化性。

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（責(zé)任編輯：王妮）