制備大腸桿菌菌蛻的方法比較

袁橙 郭長明 左偉勇 郝福星 左沁丹 藺輝星

摘要：為進(jìn)一步研究大腸桿菌菌蛻的制備技術(shù)，以pBV221、pCold IV和pETDuet1載體為基礎(chǔ)構(gòu)建了表達(dá)噬菌體E基因的溶菌質(zhì)粒，并利用pETDuet1的2個(gè)多克隆位點(diǎn)構(gòu)建了同時(shí)表達(dá)E基因和金黃色葡萄球菌核酸酶A的雙表達(dá)溶菌質(zhì)粒。經(jīng)檢測(cè)，pBV221-E/DH5α組和pCold-E/BL21組的裂解效率最高，但pCold-E/BL21組的裂解起始時(shí)間晚于其他幾組。誘導(dǎo)劑的濃度對(duì)pETDuet1-E-SNA/BL21（DE3）的裂解效率有較大影響。電泳結(jié)果顯示，隨著E基因的表達(dá)，細(xì)菌DNA逸出膜外，同時(shí)金黃色葡萄球菌核酸酶A將DNA降解為250 bp以下的小片段。除pBV221-E/BL21組外，β-丙內(nèi)酯可實(shí)現(xiàn)對(duì)其他試驗(yàn)組菌蛻的完全滅活。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，幾組菌蛻在結(jié)構(gòu)上并無明顯差別。與對(duì)照菌相比，菌蛻結(jié)構(gòu)完整，電子密度低且不均勻，細(xì)胞膜有不同程度的皺縮。

關(guān)鍵詞：菌蛻;大腸桿菌;E基因;金黃色葡萄球菌核酸酶A;裂解效率

中圖分類號(hào)：S852.5+2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2020）02-0410-07

Abstract：In order to further study the preparation technology of bacterial ghosts from Escherichia coli， the bacteriolytic plasmids expressing bacteriophage E gene were constructed based on vectors including pBV221， pCold IV and pETDuet1. Using two polychonal sites of pETDuet1， a double expression plasmid expressing E gene and Staphylococcus aureus nuclease A was constructed. The lysis efficiency of pBV221-E/DH5α group and pCold-E/BL21 group was the highest， but the lysis initiation time of pCold-E/BL21 group was later than other groups. The concentration of inducer had a great influence on the lysis efficiency of pETDuet1-E-SNA/BL21（DE3）. Electrophoresis results showed that with the expression of E gene， bacterial DNA escaped from the cell membrane. Meanwhile， Staphylococcus aureus nuclease A degraded DNA to a small fragment below 250 bp. The β-propiolactone could completely inactivate the bacterial ghost of experimental groups expect pBV221-E/BL21 group. Electron microscopic observation indicated that there was no significant difference in the structure of the bacterial ghost among different groups. Compared with Escherichia coli， the electron density of bacterial ghost was lower and uneven， the cell membrane shrank， and the structure was complete.

Key words：bacterial ghost;Escherichia coli;gene E;Staphylococcus aureus nuclease A;lysis efficiency

1985年，Lubitz等發(fā)現(xiàn)噬菌體PhiX174的裂解基因E在革蘭氏陰性菌中表達(dá)后能使菌體形成跨膜孔道，細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞器等從孔道逸出，形成細(xì)菌空殼[1]，這種細(xì)菌空殼被稱為菌蛻或菌影。與福爾馬林滅活細(xì)菌疫苗相比，菌蛻的制備過程沒有損壞細(xì)菌菌體的抗原結(jié)構(gòu)，其免疫原性得到了較好的保留[2-3]，因此可將其作為新型滅活疫苗、疫苗載體或佐劑使用。目前，國內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道中大都采用E基因單獨(dú)表達(dá)來制備菌蛻[4-7]。也有研究者嘗試使用15個(gè)柔性氨基酸接頭將E基因和金黃色葡萄球菌核酸酶A（SNA）基因串聯(lián)，通過2個(gè)蛋白質(zhì)在宿主菌中共表達(dá)來制備菌蛻[2，8-9]。SNA是一種胞外核酸非專一性磷酸二酯酶，能降解單鏈或雙鏈DNA或RNA。在菌蛻制備中該蛋白質(zhì)的表達(dá)可將細(xì)菌DNA（包括耐藥基因和毒素基因）降解為400 bp以下的小片段，從而提高菌蛻使用的安全性[2]。

為研究不同原核表達(dá)載體對(duì)宿主菌的裂解效率，比較大腸桿菌菌蛻不同制備方法的效果，為大腸桿菌菌蛻疫苗載體和致病性大腸桿菌菌蛻疫苗的研制奠定基礎(chǔ)，本研究利用溫控型表達(dá)載體pBV221、冷休克表達(dá)載體pCold IV和雙蛋白表達(dá)載體pETDuet1構(gòu)建4種重組質(zhì)粒用于大腸桿菌菌蛻的制備，對(duì)不同制備方法的裂解效率、滅活率等進(jìn)行比較，同時(shí)對(duì)雙蛋白表達(dá)質(zhì)粒中SNA蛋白對(duì)宿主菌DNA的降解效果進(jìn)行檢驗(yàn)，對(duì)4種制備方法進(jìn)行綜合評(píng)估。

1材料與方法

1.1菌株、載體及試劑

1.1.1菌株大腸桿菌DH5α和BL21感受態(tài)細(xì)胞購自TaKaRa公司，BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。由于大腸桿菌DH5α菌株無乳糖啟動(dòng)子阻遏蛋白基因lac lq，故不需要異丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG）。大腸桿菌BL21來源于B株，為Lon蛋白水解酶、ompT外膜蛋白水解酶缺陷型，有利于外源蛋白的穩(wěn)定表達(dá)，可用于pCold I-IV DNA的蛋白質(zhì)表達(dá)。因?yàn)锽L21宿主不表達(dá)T7 RNA聚合酶，所以不適合于啟動(dòng)子為T7的蛋白質(zhì)表達(dá)體系（如pET系列）。BL21（DE3）菌株整合了T7噬菌體基因組，可用于高效表達(dá)克隆于含有噬菌體T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體（如pET系列）的基因。

1.1.2質(zhì)粒溫控型表達(dá)載體pBV221、冷休克表達(dá)載體pCold IV和雙蛋白表達(dá)載體pETDuet1由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物流行病學(xué)研究中心保存。

1.1.3試劑PCR試劑盒、ClonExpressII One Step克隆試劑盒、膠回收試劑盒、核酸染料GelRed、DL2000 Plus DNA marker等購自南京諾唯贊生物科技有限公司。限制性內(nèi)切酶和連接酶為賽默飛世爾科技（中國）有限公司產(chǎn)品。質(zhì)粒提取試劑盒為愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司產(chǎn)品。酵母提取物、胰蛋白胨、氯化鈉、氨芐青霉素、IPTG等試劑為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[10]中配方制備LB液體、固體培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖液（PBS）等?？剐赃x擇培養(yǎng)基中氨芐青霉素的工作質(zhì)量濃度為100 mg/L。所用引物由英濰捷基公司合成。

1.24種溶菌質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)NCBI公布的噬菌體PhiX174的裂解基因E堿基序列合成E基因（276 bp）并連接至pUC57載體，命名為pUC57-E。用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sal I雙酶切重組質(zhì)粒pUC57-E和表達(dá)載體pBV221，利用T4 DNA連接酶將E基因片段連接至載體pBV221，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBV221-E。

根據(jù)載體pCold IV多克隆位點(diǎn)（Multiple cloning site，MCS）序列和pETDuet1 的第1個(gè)MCS序列，分別設(shè)計(jì)插入E基因片段正/反向PCR引物（見表1）。以pUC57-E為模板擴(kuò)增，使得PCR產(chǎn)物5′和3′最末端分別帶有與線性化載體兩末端一致的序列和酶切位點(diǎn)。按照ClonExpressII One Step克隆試劑盒說明書，完成重組質(zhì)粒pCold IV-E和pETDuet1-E的構(gòu)建。

根據(jù)NCBI公布的SNA序列，合成其無信號(hào)肽的膜外區(qū)序列453 bp并連接至pUC57載體，命名為pUC57-SNA。根據(jù)載體pETDuet1的第2個(gè)MCS序列，設(shè)計(jì)插入SNA基因片段正/反向PCR引物（見表1），按照ClonExpressII One Step克隆試劑盒說明書，完成重組質(zhì)粒pETDuet1-E-SNA的構(gòu)建。

將以上重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α，在抗性平板上篩選陽性克隆。提取陽性克隆質(zhì)粒，通過雙酶切和測(cè)序?qū)﹃栃钥寺∵M(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

1.3運(yùn)用溶菌質(zhì)粒制備大腸桿菌菌蛻

參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[10]中方法，將上述溶菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至適宜的宿主菌。同時(shí)將空質(zhì)粒pBV221、pCold IV和pETDuet1分別轉(zhuǎn)化相應(yīng)宿主菌作為對(duì)照，進(jìn)行溶菌動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。試驗(yàn)分組見表2。

將pBV221-E/DH5α、pBV221/DH5α、pBV221-E/BL21和pBV221/BL21菌液于28 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.5時(shí)，取2 ml菌液樣品作為誘導(dǎo)前對(duì)照，然后將菌液置于42 ℃誘導(dǎo)表達(dá)，每隔30 min取樣測(cè)量OD600值。將pCold IV-E/BL21和pCold IV/BL21菌液于37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.5時(shí)，取2 ml菌液樣品作為誘導(dǎo)前對(duì)照，然后將菌液置于16 ℃，添加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，每隔1 h取樣測(cè)量OD600值。將pETDuet1-E/BL21（DE3）、pETDuet1-E-SNA/BL21（DE3）和pETDuet1/BL21（DE3）菌液于37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.5時(shí)，取2 ml菌液樣品作為誘導(dǎo)前對(duì)照，然后將菌液置于37 ℃，添加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，每隔30 min取樣測(cè)量OD600值。IPTG的誘導(dǎo)濃度見表2。

以上菌液振蕩培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化有溶菌質(zhì)粒的菌液OD600值不繼續(xù)下降時(shí)，停止誘導(dǎo)并取2 ml菌液作為誘導(dǎo)后樣品。將試驗(yàn)組誘導(dǎo)前菌液樣品用生理鹽水進(jìn)行10-4～10-6稀釋，誘導(dǎo)停止時(shí)菌液樣品進(jìn)行10-1～10-3稀釋，每個(gè)稀釋度涂3塊無抗LB平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h。選取合適稀釋度的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，取CFU平均值計(jì)算裂解率。計(jì)算公式為：裂解率=（1-誘導(dǎo)后CFU/誘導(dǎo)前CFU）×100%[11]。

1.4SNA蛋白對(duì)宿主菌DNA的降解作用檢測(cè)

取方法1.3中pETDuet1-E-SNA/BL21（DE3）誘導(dǎo)前（0 h）和誘導(dǎo)后（2 h）的菌液樣品各1 ml瞬時(shí)離心，移取上清液備用。菌體沉淀用煮沸裂解法提取DNA[12]：將沉淀溶于100 μl PBS（pH7.4），進(jìn)行沸水?。?0 min）和冰?。? min），12 000 g離心10 min取上清液。取樣品5 μl通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析SNA蛋白對(duì)細(xì)菌DNA的降解活性。同時(shí)制備pETDuet1-E/BL21（DE3）誘導(dǎo)后（2 h）的菌液樣品作為對(duì)照。

1.5菌蛻的滅活

菌液停止誘導(dǎo)后，向菌蛻溶液中加入β-丙內(nèi)酯至終體積分?jǐn)?shù)為0.025%，并置于42 ℃作用1 h，離心菌液收集菌體沉淀，沉淀用滅菌PBS（pH7.4）溶液清洗3遍后重懸，加入β-丙內(nèi)酯至終體積分?jǐn)?shù)為0.05%，再置于42 ℃作用2 h。分別取滅活后的菌蛻溶液涂板進(jìn)行無菌檢驗(yàn)。

1.6透射電鏡觀察菌蛻

用負(fù)染色方法對(duì)滅活后的大腸桿菌菌蛻pBV221-E/DH5α、pBV221-E/BL21、pCold IV-E/BL21、pETDuet1-E/BL21（DE3）和pETDuet1-E-SNA/BL21（DE3）進(jìn)行染色。同時(shí)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有不同空載體的宿主菌作為對(duì)照樣品。透射電鏡觀察樣品的制備方法為：將銅網(wǎng)置于不干膠底紙上，向銅網(wǎng)上滴加一滴大腸桿菌菌液，靜置10 min后用濾紙吸取菌液，再向銅網(wǎng)上滴加一滴2%磷鎢酸染液，染色1 min后吸去染液，置于紅外烘燈下處理10 min。使用Philips透射電子顯微鏡（Tecnai 12）觀察菌體結(jié)構(gòu)。

2結(jié)果

2.1溶菌質(zhì)粒的構(gòu)建

重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pBV221-E、pCold IV-E和pETDuet1-E中的插入基因片段長度與E基因長度一致（圖1）。重組質(zhì)粒pETDuet1-E-SNA中第2個(gè)MCS位點(diǎn)中的插入基因片段長度與SNA基因長度一致。依據(jù)質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果選擇插入基因片段序列完全正確的克隆用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2宿主菌的生長曲線

通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)30 min內(nèi)，pBV221-E/DH5α菌液OD600即開始下降，在誘導(dǎo)150 min后數(shù)值趨于穩(wěn)定，約為0.30（圖2A）。在誘導(dǎo)30 min后，pBV221-E/BL21菌液OD600開始下降，在誘導(dǎo)120 min后達(dá)到最低，約為0.55（圖2A）。pCold-E/BL21菌液OD600在E蛋白誘導(dǎo)表達(dá)2 h后開始下降，誘導(dǎo)4 h后數(shù)值趨于穩(wěn)定，約為0.30（圖2B）。當(dāng)IPTG終濃度為0.5 mmol/L時(shí)，pETDuet1-E/BL21（DE3）菌液OD600在誘導(dǎo)30 min內(nèi)開始下降，90 min后停止下降，約為0.20。pETDuet1-E-SNA/BL21（DE3）菌液在誘導(dǎo)30 min后開始下降，120 min后達(dá)到最低值，約0.30（圖2C）。當(dāng)提高IPTG終濃度至1.5 mmol/L時(shí)，pETDuet1-E-SNA/BL21（DE3）菌液OD600的下降時(shí)間晚于0.5 mmol/L和1.0 mmol/L誘導(dǎo)組（圖2D）。與此同時(shí)，轉(zhuǎn)化有空載體的各對(duì)照菌液的OD600一直保持上升趨勢(shì)（圖2）。

2.3溶菌質(zhì)粒的裂解效率

經(jīng)計(jì)算，得到不同菌蛻制備方法的裂解效率（表2）。表2顯示，pBV221-E溶菌質(zhì)粒對(duì)DH5α和pCold IV-E溶菌質(zhì)粒對(duì)BL21的裂解效率均較高，可達(dá)99.99%。而pBV221-E對(duì)BL21的裂解效率最低，為12.00%。pETDuet1-E-SNA對(duì)BL21（DE3）的裂解效率受IPTG濃度的影響，在IPTG濃度為1.0 mmol/L時(shí)裂解效率較高，為90.44%。

2.4SNA蛋白對(duì)宿主菌DNA的降解作用

IPTG誘導(dǎo)后0 h，pETDuet1-E-SNA/BL21（DE3）細(xì)菌培養(yǎng)上清液中未見明顯的基因組條帶，而同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)菌裂解物中可見大片段基因組條帶（圖3）。在E蛋白對(duì)菌膜打孔的作用下細(xì)菌DNA滲出，誘導(dǎo)后2 h的pETDuet1-E/BL21（DE3）DNA樣品中無基因組條帶，而誘導(dǎo)后2 h的pETDuet1-E/BL21（DE3）細(xì)菌培養(yǎng)上清液樣品中出現(xiàn)未被降解的基因組條帶（圖3）。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后2 h，在SNA蛋白的作用下，pETDuet1-E-SNA/BL21（DE3）細(xì)菌DNA被降解，誘導(dǎo)后細(xì)菌培養(yǎng)上清液和細(xì)菌裂解物中均未出現(xiàn)大片段基因組條帶，僅有約100 bp左右的條帶（圖3）。

2.5不同方法制備的大腸桿菌菌蛻滅活效果

通過涂板檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)β-丙內(nèi)酯滅活處理后pBV221-E/BL21菌蛻溶液中仍有活菌存在，而pBV221-E/DH5α、pCold-E/BL21、pETDuet1-E/BL21（DE3）和pETDuet1-E-SNA/BL21（DE3）4種菌蛻溶液中無活菌。

2.6大腸桿菌菌蛻的結(jié)構(gòu)

透射電鏡觀察，結(jié)果（圖4）顯示，對(duì)照菌結(jié)構(gòu)完整，菌體電子密度較高且分布均勻，而幾種菌蛻的電子密度明顯降低且分布不均，細(xì)胞膜出現(xiàn)不同程度的皺縮變形，對(duì)照菌和菌蛻樣品均未見鞭毛結(jié)構(gòu)。

3討論

目前，已報(bào)道的大腸桿菌菌蛻的制備方法較多，其中大多數(shù)方法均利用了噬菌體E基因在大腸桿菌中的表達(dá)。有研究者嘗試?yán)眉?xì)胞穿透肽在大腸桿菌中的表達(dá)來制備菌蛻，未能獲得成功[8]。另有研究者將E和SNA串聯(lián)表達(dá)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌的高效裂解和基因組DNA的降解。這些研究中，被用于E基因表達(dá)的載體包括pBV220、pBV221、pBAD、pET32a、pML1、pDKL01等。這些載體中，除pBAD外，均不能實(shí)現(xiàn)2個(gè)以上蛋白質(zhì)的共表達(dá)。被用于表達(dá)的大腸桿菌中既有致病菌又有工程菌，如E.coli pop 2135、E.coli O157∶H7、禽致病性大腸桿菌APEC1（O45）、CH2（O78）、O78K80，以及工程菌TOP10、JN10、DH5α和BL21（DE3）等[11，13-15]。人們?cè)趯@得的菌蛻作為菌苗的研究中，往往選擇致病菌作為表達(dá)菌，而在將菌蛻作為核酸或重組蛋白載體的研究中，一般選擇工程菌用于菌蛻制備。本研究中創(chuàng)新性地將pCold IV冷休克表達(dá)載體和pETDuet1雙表達(dá)載體運(yùn)用于大腸桿菌菌蛻制備，并與pBV221載體制備方法進(jìn)行綜合比較。

研究中發(fā)現(xiàn)，不同菌蛻制備方法中的宿主菌裂解效率有較大差別。pBV221-E溶菌質(zhì)粒對(duì)DH5α和pCold IV-E溶菌質(zhì)粒對(duì)BL21的裂解效率較高，達(dá)99.99%。而pBV221-E對(duì)BL21的裂解效率最低，且相同滅活條件下不能實(shí)現(xiàn)對(duì)菌蛻的完全滅活。這提示我們將pBV221-E用于不同來源宿主菌的菌蛻制備時(shí)，裂解效率有較大差異。pCold系列載體屬于大腸桿菌冷休克表達(dá)載體，可在低溫下誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，提高表達(dá)產(chǎn)物的溶解性和穩(wěn)定性[16]。在本研究中pCold IV-E的裂解效率接近100%，但其缺點(diǎn)是需要較長的誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間。前期試驗(yàn)中，pETDuet1-E-SNA組IPTG終濃度為常用的0.5 mmol/L，但細(xì)菌裂解效率僅為50%，明顯低于pETDuet1-E組。在后續(xù)試驗(yàn)中將IPTG誘導(dǎo)濃度提高為1.0 mmol/L和1.5 mmol/L后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)IPTG終濃度為1.0 mmol/L時(shí)，該質(zhì)粒對(duì)宿主菌的裂解效率優(yōu)于0.5 mmol/L和1.5 mmol/L組，為90.44%。我們推測(cè)，這是因?yàn)椴煌T導(dǎo)劑濃度對(duì)E蛋白和SNA蛋白的共表達(dá)具有較大影響，從而影響了蛋白質(zhì)對(duì)宿主菌的裂解作用。從宿主菌生長曲線中可以看出，pCold IV-E/BL21的OD600值下降時(shí)間晚于其他組。這可能是因?yàn)閜Cold IV屬于低溫誘導(dǎo)表達(dá)載體，其適宜的表達(dá)溫度為16 ℃，而細(xì)菌在此溫度下增殖速度較慢，E蛋白表達(dá)速度也受到影響。本研究中，其他菌蛻制備組的OD600值下降時(shí)間均為30 min前后，且在誘導(dǎo)約90～120 min后趨于穩(wěn)定。這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)早于國內(nèi)外的部分報(bào)道[2，11，17]，提示這幾種方法在生產(chǎn)周期上可能有一定優(yōu)勢(shì)。

值得注意的是，雖然不同制備方法的裂解效率有較大差異，但是除pBV221-E/BL21外，其他試驗(yàn)組均能實(shí)現(xiàn)β-丙內(nèi)酯處理下的100%滅活。提示裂解效率達(dá)到一定的數(shù)值后，裂解效率的高低將不會(huì)對(duì)β-丙內(nèi)酯的滅活效果產(chǎn)生影響。與常用的甲醛滅活劑相比，β-丙內(nèi)酯不直接作用于蛋白質(zhì)，而是作用于病原體DNA或RNA，因此能保持病原良好的免疫原性，且作用時(shí)間短，易水解無殘留，不會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的接種反應(yīng)[18]。如果從降低生產(chǎn)成本的角度考慮，pBV221-E/DH5α方法不需添加誘導(dǎo)劑，通過提高培養(yǎng)溫度即可完成細(xì)菌裂解，有顯著優(yōu)勢(shì)。如果從提高安全性的角度考慮，雖然pETDuet1-E-SNA/BL21（DE3）（IPTG 1.0 mmol/L）組的裂解效率不是最高，但該方法可實(shí)現(xiàn)細(xì)菌DNA的降解，因此理論上獲得的菌蛻產(chǎn)品的安全性更好。這與國內(nèi)一些學(xué)者的研究結(jié)果一致[2，19]。同時(shí)，pETDuet1還可與pACYCDuet1雙表達(dá)載體聯(lián)合使用，在合適的宿主菌中實(shí)現(xiàn)4個(gè)基因的共表達(dá)，在菌蛻制備的同時(shí)實(shí)現(xiàn)其他外源基因的表達(dá)，進(jìn)一步拓展菌蛻的功能。同時(shí)值得注意的是，pET系列載體的表達(dá)需要使用融合有T7噬菌體RNA聚合酶的宿主菌[20]，這在一定程度上限制了該載體的使用。

通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，不同方法獲得的菌蛻均能保持較為完整的細(xì)菌形態(tài)，但是未觀察到鞭毛結(jié)構(gòu)。這提示如果將溶菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)入禽致病性大腸桿菌分離株進(jìn)行菌蛻制備，獲得的菌蛻可能具有更好的免疫原性，更適合作為菌苗使用[14，21]。而利用DH5α、BL21和BL21（DE3）等工程菌制備的菌蛻因宿主菌來源清晰，可用于核酸疫苗和亞單位疫苗等疫苗菌蛻載體的制備。

綜上所述，與溶菌質(zhì)粒pCold IV-E和pETDuet1-E相比，pBV221-E和pETDuet1-E-SNA在未來的生產(chǎn)和應(yīng)用中更具潛力。我們將在本研究的基礎(chǔ)上對(duì)溶菌質(zhì)粒進(jìn)行改造，繼續(xù)開展將細(xì)菌菌蛻作為新型疫苗遞送系統(tǒng)的研究。

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（責(zé)任編輯：張震林）