糞便具核梭桿菌與clbA+大腸埃希菌DNA 檢測(cè)在結(jié)直腸癌診斷中的價(jià)值

劉 艷，龍 吟，潘偉杰，張 通，翁文浩，俞 瑩

（1.上海市第二康復(fù)醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200431；2.上海市楊浦區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200090）

近年來(lái)，我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，成為繼肺癌、肝癌后居第3位的惡性腫瘤。我國(guó)2015年癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，與2005年相比，我國(guó)大腸癌新發(fā)病例數(shù)和死亡例數(shù)均在10年間翻了一番，分別達(dá)到37.7萬(wàn)例和19.11萬(wàn)例[1]。此外，有近20%～25%的腸癌患者在初診時(shí)發(fā)現(xiàn)伴有肝轉(zhuǎn)移，且晚期腸癌患者生活質(zhì)量很低，盡管使用各種昂貴的化療及靶向藥物，但其5年生存率仍?xún)H為65%。因此，結(jié)直腸癌早查篩期生物標(biāo)志物相關(guān)研究成為熱點(diǎn)。近年來(lái)，腸道微生態(tài)與腸癌的關(guān)系正不斷被揭示。有研究發(fā)現(xiàn)，clbA1+大腸埃希菌具有pks致病島，并可產(chǎn)生大腸埃希菌素，而大腸埃希菌素可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞DNA斷裂、細(xì)胞衰老，促進(jìn)分泌生長(zhǎng)因子，使細(xì)胞增殖[2]。具核梭桿菌可在結(jié)腸、直腸中富集，與腸癌患者預(yù)后有關(guān)，可促進(jìn)腸癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，并參與腫瘤細(xì)胞的免疫逃避、化療藥物抵抗等[3-5]。本研究擬檢測(cè)糞便樣本中clbA+大腸埃希菌及具核梭桿菌DNA相對(duì)表達(dá)量，同時(shí)結(jié)合臨床診斷資料、糞便隱血試驗(yàn)（fecal occult blood test，F(xiàn)OBT）及血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）檢測(cè)結(jié)果，評(píng)價(jià)clbA+大腸埃希菌、具核梭桿菌潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2017年12月—2019年1月上海市楊浦中心醫(yī)院、上海市第二康復(fù)醫(yī)院38例腺瘤患者、115例腸癌患者及58位體檢健康者（健康對(duì)照組）糞便樣本。腺瘤患者男20例、女18例，年齡（61±10）歲；腸癌患者男62例、女53例，年齡（60±11）歲，其中早期（Ⅰ～Ⅱ期）腸癌患者87例、晚期（Ⅲ～Ⅳ期）腸癌患者28例。健康對(duì)照者男31名、女27名，年齡（59±8）歲。健康對(duì)照者糞便性狀正常，F(xiàn)OBT結(jié)果陰性；腺瘤及腸癌患者無(wú)消化道或全身炎癥表現(xiàn)，未進(jìn)行抗菌藥物及化療藥物治療，其糞便樣本采集于手術(shù)前。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用糞便DNA抽提試劑盒（批號(hào)為DP328，北京天根生化科技有限公司），按說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作。抽提后DNA濃度及質(zhì)量采用Nanodropone分光光度計(jì)（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）進(jìn)行分析，A260nm/A280nm比值應(yīng)為1.7～1.9。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)clbA+大腸埃希菌及具核梭桿菌DNA相對(duì)表達(dá)量。儀器為7900HT熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司），試劑為T(mén)B Green qPCR Master Mix（貨號(hào)639676，大連寶生物有限公司），按說(shuō)明書(shū)要求配制反應(yīng)緩沖液及DNA模板。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性 95°C 30 s；變性95°C 10 s，退火/延伸60°C 35 s，45個(gè)循環(huán)。clbA+大腸埃希菌引物序列：上游引物為5'-AT GAGGATTGATATATTAATTGGACA-3'，下游引物為5'-GGTTTGCCATATTTGCACGTAC-3'。具核梭桿菌引物序列：上游引物為5'-TTCAAT AAAAGTGGCAGGTCAAG-3'，下游引物為5'-TAACAACACATGCAGGTCAATGG-3'?？偧?xì)菌內(nèi)參基因16SrDNA引物序列：上游引物為5'-CCATGAAGTCGGAATCGCTAG-3'；下游引物為5'-GCTTGACGGGCGGTGT-3'。靶細(xì)菌DNA相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔCt表示，ΔCt=Ct靶細(xì)菌序列-Ct16SrDNA。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism及MedCalc軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線(xiàn)評(píng)價(jià)各項(xiàng)指標(biāo)診斷及鑒別診斷腸癌的價(jià)值，采用χ2檢驗(yàn)比較早、晚期腸癌患者各項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性率的差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健康對(duì)照組、腺瘤組及腸癌組糞便clbA+大腸埃希菌及具核梭桿菌DNA相對(duì)表達(dá)量的比較

腸癌組糞便clbA+大腸埃希菌DNA相對(duì)表達(dá)量高于腺瘤組和健康對(duì)照組（P＜0.01、P＜0.0001）。健康對(duì)照組、腺瘤組、腸癌組糞便具核梭桿菌DNA相對(duì)表達(dá)量依次升高，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 糞便clbA+大腸埃希菌及具核梭桿菌DNA相對(duì)表達(dá)量診斷診斷腺瘤和腸癌的效能

采用Logistic回歸模型建立clbA+大腸埃希菌與具核梭桿菌聯(lián)合檢測(cè)的模型，診斷腺瘤的模型為L(zhǎng)og（P腺瘤）=94.56447a+91.36771b－1.39321，診斷腸癌的模型為L(zhǎng)og（P腸癌）=77.53525a+139.44605b－0.53603，式中a為clbA+大腸埃希菌DNA相對(duì)表達(dá)量，b為具核梭桿菌DNA相對(duì)表達(dá)量。ROC曲線(xiàn)分析結(jié)果顯示，clbA+大腸埃希菌診斷腺瘤和腸癌的曲線(xiàn)下面積（area under curve，AUC）分別為0.672、0.712，診斷腸癌的最佳臨界值為0.0033，敏感性為64.32%，特異性為65.52%；具核梭桿菌診斷腺瘤和腸癌的AUC分別為0.628、0.750，診斷腸癌的最佳臨界值為0.0023，敏感性為80.87%，特異性為68.97%；聯(lián)合檢測(cè)診斷腺瘤和腸癌的AUC分別為0.723、0.761，診斷腸癌的最佳臨界值為0.5378，敏感性為80.87%，特異性為67.17%。clbA+大腸埃希菌和具核梭桿菌單項(xiàng)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)鑒別診斷腺瘤與腸癌的AUC分別為0.517、0.616、0.608。

表1 健康對(duì)照組、腺瘤組及腸癌組糞便clbA+大腸埃希菌及具核梭桿菌DNA相對(duì)表達(dá)量的比較 M（P25～P75）

圖2 clbA+大腸埃希菌和具核梭桿菌的診斷效能

2.3 早期腸癌組、晚期腸癌組糞便clbA+大腸埃希菌DNA、糞便具核梭桿菌DNA及血清CEA、FOBT陽(yáng)性率的比較

早期腸癌組、晚期腸癌組糞便clbA+大腸埃希菌DNA陽(yáng)性率、糞便具核梭桿菌DNA陽(yáng)性率、糞便clbA+大腸埃希菌DNA與具核梭桿菌DNA聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率、FOBT陽(yáng)性率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），晚期腸癌組血清CEA陽(yáng)性率高于早期腸癌組（P＜0.05）。早期腸癌組clbA+大腸埃希菌DNA及糞便具核梭桿菌DNA單項(xiàng)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)的陽(yáng)性率分別為75.7%、80.5%、81.6%，均高于FOBT及CEA的陽(yáng)性率。見(jiàn)表2。

表2 早期腸癌組、晚期腸癌組糞便clbA+大腸埃希菌DNA、糞便具核梭桿菌DNA及血清CEA、FOBT陽(yáng)性率的比較 例（%）

3 討論

在大腸癌篩查的方法中，僅有FOBT和乙狀結(jié)腸鏡檢查具有高級(jí)別的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。FOBT是目前應(yīng)用最為廣泛的篩查方法，具有無(wú)創(chuàng)、價(jià)廉的優(yōu)點(diǎn)，篩查敏感性為30%～80%[6]。乙狀結(jié)腸鏡主要用于觀察遠(yuǎn)側(cè)結(jié)腸的病變情況，敏感性為60%～70%[6]。多項(xiàng)臨床研究結(jié)果證實(shí)，F(xiàn)OBT和乙狀結(jié)腸鏡檢查對(duì)早期發(fā)現(xiàn)大腸癌，降低患者死亡率還不夠理想[7-8]。盡管FOBT操作簡(jiǎn)單、成本低，但受多種因素影響，結(jié)果穩(wěn)定性及敏感性均不理想，而乙狀結(jié)腸鏡檢查為創(chuàng)傷性操作，患者依從性差[9-10]。因此，目前尚缺少高敏感性、低創(chuàng)傷性的實(shí)驗(yàn)室檢查手段。

糞便微生物標(biāo)志物檢測(cè)具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如經(jīng)濟(jì)有效、無(wú)創(chuàng)傷、人群依從性好、留取樣本簡(jiǎn)便等。此外，糞便微生物DNA穩(wěn)定、提取方法成熟且簡(jiǎn)便。本研究以糞便具核梭桿菌與clbA+大腸埃希菌為研究靶點(diǎn)，初步探索了微生物標(biāo)志物作為結(jié)直腸癌篩查工具的臨床潛在應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果顯示，健康對(duì)照者、腺瘤患者、腸癌患者具核梭桿菌和clbA+大腸埃希菌DNA相對(duì)表達(dá)量逐漸升高，診斷腸癌的敏感性分別為80.87%、64.32%，較文獻(xiàn)報(bào)道的FOBT為30%～80%[6]、乙狀結(jié)腸鏡檢查為60%～70%[6]有一定提高。此外，在早期腸癌中，具核梭桿菌和clbA+大腸埃希菌檢測(cè)敏感性分別為80.5%、75.7%，而CEA為25.3%，F(xiàn)OBT為50.6%，表明糞便具核梭桿菌和clbA+大腸埃希菌作為腸癌早期篩查的生物標(biāo)志物具有廣闊的應(yīng)用前景。

近年來(lái)，有學(xué)者提出腸癌發(fā)生的腸道微生態(tài)“驅(qū)動(dòng)-被動(dòng)”學(xué)說(shuō)，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為某些細(xì)菌具有致癌性，可驅(qū)動(dòng)腸癌發(fā)生；而另一群細(xì)菌在腸癌發(fā)生過(guò)程中由于腸道內(nèi)環(huán)境的變化，被動(dòng)發(fā)生數(shù)量或組成的改變[11]。產(chǎn)腸桿菌素的大腸埃希菌可增加上皮細(xì)胞突變率[12]，為腸癌的驅(qū)動(dòng)菌，而在腸癌發(fā)生過(guò)程中，轉(zhuǎn)化或腸癌細(xì)胞表面的Gal-GalNAc水平不斷增加，具核梭桿菌可通過(guò)其菌體蛋白Fap2形成Fap2/Gal-GalNAc復(fù)合物，提示具核梭桿菌可能是腸癌病變過(guò)程中不斷吸附的被動(dòng)菌[13]。本研究發(fā)現(xiàn)clbA+大腸埃希菌及具核梭桿菌在腺瘤階段即開(kāi)始富集，在腸癌患者中的豐度最高，表明上述細(xì)菌與腸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，為其作為診斷標(biāo)志物提供了理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，clbA+大腸埃希菌不能很好地鑒別腺瘤與腸癌，而具核梭桿菌具有一定的鑒別能力。有研究發(fā)現(xiàn)，80%的腺瘤患者存在APC等關(guān)鍵基因突變[14]，而clbA+大腸埃希菌含量很有可能在癌前病變階段已增加，對(duì)基因突變起重要作用，因此clbA+大腸埃希菌DNA相對(duì)表達(dá)量不能地很好地區(qū)分腺瘤和腸癌患者。具核梭桿菌作為被動(dòng)菌在腸癌進(jìn)展時(shí)才富集，因此其相對(duì)表達(dá)量可能在腸癌中更高，能起到鑒別作用。盡管clbA+大腸埃希菌和具核酸桿菌鑒別腺瘤與腸癌的作用有限，但區(qū)別健康對(duì)照者與腸癌患者的敏感性較高，因此可作為篩查標(biāo)志物。

綜上所述，糞便具核梭桿菌和clbA+大腸埃希菌可作為潛在的結(jié)直腸癌無(wú)創(chuàng)性早期篩查生物標(biāo)志物。通過(guò)檢測(cè)“高危”微生物，可篩查出腸癌高風(fēng)險(xiǎn)人群。鑒于本研究樣本數(shù)量有限，尚需多中心參與，以證實(shí)本研究結(jié)果。同時(shí)，隨著下一代測(cè)序技術(shù)的普及應(yīng)用，新型腸癌相關(guān)微生物標(biāo)志物不斷將被發(fā)現(xiàn)。