姜黃素對非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型保護作用以及機制研究*

吳鵬波，宋 琪，俞媛潔，郭一天，饒 倩，柴 紅，譚詩云

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)可進展為肝纖維化和肝硬化，甚至肝癌，還可增加糖尿病和心血管疾病的罹患風(fēng)險[1]。NAFLD的發(fā)病機制尚不明確，國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為NAFLD發(fā)病主要與氧化應(yīng)激、細(xì)胞過度凋亡和過度炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[1]。姜黃素(curcumin)是運用現(xiàn)代科技手段從植物姜黃塊莖中提煉出的單體?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以緩解炎癥反應(yīng)、抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[2]。本實驗通過建立油酸誘導(dǎo)的NAFLD細(xì)胞模型，探討了姜黃素對NAFLD細(xì)胞炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物和試劑 HepG2細(xì)胞由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供；姜黃素和油酸均購于Sigma公司(純度大于99.99%)，配制小于0.1% DMSO母液，儲存于-20℃冰箱備用；胎牛血清，高糖型DMEM購于Gibco公司；培養(yǎng)板購于上海晶安生物有限公司；檢測活性氧(reactive oxygen species , ROS)試劑盒和線粒體提取試劑盒購于碧云天生物有限公司；Hoechst 33258染料、Bcl-2、Bax、NF-κB、Caspase-3/9、抗細(xì)胞色素C(Cyt C)和抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購自Sigma公司，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔或山羊抗鼠IgG購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與干預(yù) 用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于溫度為37℃、含有5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)細(xì)胞過夜，實驗分為4組：即對照組(Con)、模型組(OA)、姜黃素干預(yù)組和姜黃素對照組。首先，在姜黃素干預(yù)組和OA組細(xì)胞，先加入相應(yīng)濃度的油酸處理8 h，而在Con組和姜黃素對照組，則加入等量的PBS液預(yù)處理。在8 h后，在姜黃素對照組和姜黃素干預(yù)組，更換終濃度為10μmol/l姜黃素，在對照組和OA組，加入等量的PBS，培養(yǎng)24 h,其中造模方法參考文獻進行[3]。

1.3 Bodipy493/503 熒光染色 經(jīng)過以上干預(yù)后，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌后再用多聚甲醛固定，經(jīng)過PBS洗滌，加入Bodipy493/503(濃度為 1 μg/ml)，室溫下染色30 min。用PBS 漂洗，加DAPI染細(xì)胞核，漂洗、封片，在熒光顯微鏡下觀察。

1.4 HepG2細(xì)胞上清液腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素6(IL-6)測定 取培養(yǎng)細(xì)胞上清液，按南京建成試劑盒要求測定上清液TNF-α和IL-6水平。

1.5 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測 采用2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)探針法，因DCFH-DA進入細(xì)胞后被酯酶水解生成2′，7′-二氯二氫熒光素，細(xì)胞內(nèi)ROS可以將無熒光的2′，7′-二氯二氫熒光素氧化成可發(fā)綠色熒光的2′，7′-二氯熒光素，通過檢測2′，7′-二氯熒光素的熒光強度，可以間接判斷細(xì)胞內(nèi)ROS水平。取培養(yǎng)細(xì)胞，加入等量的DCFH-DA后，37℃孵箱內(nèi)孵育30 min，在熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞內(nèi)綠色熒光，拍照后半定量分析檢測各組細(xì)胞內(nèi)ROS平均熒光強度。

1.6 線粒體形態(tài)變化 取培養(yǎng)細(xì)胞，加入胰蛋白酶消化，收集各組細(xì)胞，經(jīng)過濾離心后，加入2. 5%戊二醛，4℃靜置2 h。倒掉戊二醛，用PBS 洗滌3 次，再用1%鋨酸固定，不同梯度乙醇脫水，丙酮置換。環(huán)氧樹脂包埋后超薄切片，采用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，透射電鏡下觀察。

1.7 Hoechst 33258染色 取培養(yǎng)細(xì)胞，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌后，用多聚甲醛固定細(xì)胞，加入染料，孵育5 min，PBS液體多次洗滌后封片，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞核內(nèi)可見到染色質(zhì)邊集、濃縮、核碎裂等改變時，判定為細(xì)胞凋亡。

1.8 線粒體分離 取培養(yǎng)細(xì)胞，PBS洗滌、離心，按照細(xì)胞線粒體分離試劑盒相關(guān)步驟，將細(xì)胞沉淀并重新置于線粒體提取緩沖液中，在勻漿處理后，離心取上清，再次離心后，棄上清液，其沉淀物即為線粒體，加線粒體裂解液裂解線粒體，獲取線粒體相關(guān)蛋白。

1.9 細(xì)胞Bcl-2、Bax、mCytc和Caspase-3/9蛋白檢測 采用Western blot法檢測，取培養(yǎng)細(xì)胞，加入蛋白裂解液或線粒體裂解液裂解，獲取胞漿或線粒體相關(guān)蛋白，取各組蛋白在SDS-PAGE膠中電泳分離各蛋白。轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗孵育過夜，TBST清洗3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，孵育2 h，采用化學(xué)發(fā)光法檢測目標(biāo)蛋白。

2 結(jié)果

2.1 各組HepG2細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積情況 經(jīng)Bodipy493/503染色半定量分析發(fā)現(xiàn)，與 Con組比，OA組 HepG2細(xì)胞可見大量脂滴密集分布；與對照組細(xì)胞相比，姜黃素對照組細(xì)胞內(nèi)脂肪滴無明顯變化；與模型組相比，姜黃素干預(yù)組HepG2細(xì)胞內(nèi)脂滴堆積顯著減少 (圖1)。

a：對照組；b：模型組；c：姜黃素對照組；d. 姜黃素干預(yù)組圖1 各組HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積情況 (Bodipy493/503，100×)

2.2 各組細(xì)胞上清液TNF-α和IL-6水平比較 OA組 HepG2細(xì)胞上清液TNF-α和IL-6水平顯著高于Con組[(210.11±12.36) pg/ml對(80.43±6.87)pg/ml和(14.74±0.78) ng/l對(4.03±0.31) ng/L，P均<0.05]；與模型組細(xì)胞比，姜黃素干預(yù)組細(xì)胞上清液TNF-α和IL-6水平顯著降低[(210.11±12.36) pg/ml對 (125.22±11.54) pg/ml和 (14.74±0.78) ng/L對 (6.47±0.34) ng/l，P均<0.05]；與對照組細(xì)胞比，姜黃素對照組細(xì)胞上清液TNF-α和IL-6水平無明顯變化。

2.3 各組細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)變化比較 多數(shù)模型組HepG2細(xì)胞出現(xiàn)線粒體腫脹，嵴斷裂或完全消失；與模型組比,姜黃素干預(yù)組HepG2細(xì)胞線粒體輕度水腫，程度減輕，線粒體無明顯的嵴斷裂或消失(圖2)。

a：Con組；b：OA組；c：姜黃素對照組；d. 姜黃素干預(yù)組圖2 各組細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)(電鏡×10000)

2.4 各組細(xì)胞ROS熒光強度比較 OA組HepG2細(xì)胞綠色熒光為(52.24±5.11)%，顯著高于Con組【(6.71±2.31)%,P<0.05】；與OA組比，姜黃素干預(yù)組HepG2細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強度顯著降低[(37.44±7.21)%,P<0.05 ]；與對照組細(xì)胞比，姜黃素對照組細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強度無明顯變化(圖3)。

a：Con組；b：OA組；c：姜黃素對照組；d：姜黃素干預(yù)組圖3 各組細(xì)胞內(nèi)ROS 熒光強度表現(xiàn)(DCFH-DA，100×)

2.5 各組細(xì)胞凋亡的影響比較 Con組細(xì)胞凋亡率為(7.04±0.57)%，OA組 HepG2細(xì)胞凋亡率為【(12.12±0.72)%，P<0.05】；姜黃素干預(yù)組細(xì)胞凋亡率顯著降低[(5.71±0.61)%，P<0.05]；與對照組細(xì)胞比，姜黃素對照組細(xì)胞凋亡率無顯著變化(圖4)。

a：Con組；b：OA組；c：姜黃素對照組；d：姜黃素干預(yù)組圖4 各組細(xì)胞凋亡情況(Hoechst 33258，100×)

2.6 各組細(xì)胞線粒體凋亡相關(guān)蛋白和炎癥蛋白表達情況 Bcl-2、Bax、mCytc和Caspase-3/9蛋白是與線粒體途徑凋亡相關(guān)的蛋白。與Con組比, OA組細(xì)胞Bax、NF-κB和Caspase-3/9蛋白表達增強，而Bcl-2和mCytc表達減弱(P均<0.05)；姜黃素干預(yù)組細(xì)胞Bax、NF-κB和Caspase-3/9蛋白表達降低，而mCytc和Bcl-2表達增強(P均<0.05) ；與對照組細(xì)胞比，姜黃素對照組細(xì)胞各種蛋白表達無顯著變化(圖5)。

a：Con組；b：OA組；c：姜黃素對照組；d：姜黃素干預(yù)組圖5 各組細(xì)胞線粒體凋亡和炎癥相關(guān)蛋白表達情況

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)OA組線粒體損傷明顯，而在姜黃素干預(yù)處理后細(xì)胞線粒體損傷明顯緩解。我國學(xué)者發(fā)現(xiàn)姜黃素預(yù)處理能維持線粒體正常結(jié)構(gòu)減輕黃曲霉素對肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[2-6]。

線粒體通路在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用[7-9]。Bcl-2家族是調(diào)節(jié)線粒體途徑凋亡的重要調(diào)控因子。Bcl-2和Bax通過調(diào)節(jié)抗凋亡和促凋亡成員的平衡，保持線粒體膜的完整性[10-15]。Bcl-2可抑制線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)，而這個過程是線粒體途徑細(xì)胞凋亡啟動的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[14-15]。促凋亡蛋白Bax通過與線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔發(fā)生相互作用，導(dǎo)致線粒體膜上形成孔道，細(xì)胞色素C從該通道釋放至胞質(zhì)中，進而促使凋亡的發(fā)生。半胱氨酸蛋白酶是細(xì)胞凋亡過程中關(guān)鍵作用的酶家族,是細(xì)胞凋亡過程的主要介導(dǎo)者和執(zhí)行者,各種因子激活或過表達均會引起細(xì)胞凋亡。Caspase逐步發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,而 Caspase-9 激活是線粒體途徑凋亡激活的重要標(biāo)記[16-20]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)OA組 HepG2細(xì)胞Bax、mCytc、Caspase-3/9 等蛋白表達明顯增強，而Bcl-2明顯減少。經(jīng)過姜黃素干預(yù)后，Bax、mCytc和Caspase-3/9 等蛋白的表達明顯減少，而Bcl-2明顯增加。研究結(jié)果提示線粒體途徑凋亡在NAFLD發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，姜黃素可以通過保護線粒體功能，調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑，發(fā)揮抑制凋亡作用。