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    鼠腦中維生素C活體電化學(xué)分析研究進展

    2019-11-12 06:29:25紀文亮張美寧毛蘭群
    分析化學(xué) 2019年10期
    關(guān)鍵詞:維生素C評述活體

    紀文亮 張美寧 毛蘭群

    摘?要?維生素C,又名抗壞血酸(Ascorbic acid, AA),是腦內(nèi)重要的小分子化學(xué)物質(zhì),作為抗氧化劑和神經(jīng)調(diào)質(zhì),在腦神經(jīng)生理與病理過程中發(fā)揮著重要作用,因此,中樞神經(jīng)系統(tǒng)中AA的測定越來越受到關(guān)注。傳統(tǒng)的檢測AA的方法需要復(fù)雜的樣品處理,時間分辨率不高,而AA在空氣中易于氧化,在電極上的氧化具有大的過電位。因此,選擇性高時空分辨率檢測AA具有很大挑戰(zhàn)。本文首先介紹了AA的電化學(xué)性質(zhì),對通過設(shè)計電極表面的性質(zhì),實現(xiàn)鼠腦和單細胞中AA的選擇性、高時空分辨率、實時分析的研究進展進行了評述。

    關(guān)鍵詞?維生素C; 活體; 電化學(xué)分析; 選擇性; 評述

    1?引 言

    維生素C,又名抗壞血酸(Ascorbic acid, AA),是重要的水溶性維生素,具有防治壞血病的作用[1]。豚鼠、蝙蝠、靈長類動物和人肝臟中由于缺少L?古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶,所以無法自身合成,必須依賴食物攝取補充體內(nèi)所需的AA[2]。AA在體內(nèi)參與多種生理生化反應(yīng),研究發(fā)現(xiàn),AA可靶向抑制甘油醛?3?磷酸脫氫酶,選擇性地殺死KRAS和BRAF突變的結(jié)腸癌細胞[3],可調(diào)控TET蛋白影響造血干細胞功能,抑制白血病的發(fā)生[4]。最近發(fā)現(xiàn),在萊茵衣藻鑒定到一種新型的TET同源蛋白,該蛋白可將AA的碳基骨架轉(zhuǎn)移到DNA上產(chǎn)生一種全新的DNA修飾[5]。

    此外,雖然AA在全身組織中的分布具有很大的差異性,但是在大多數(shù)動物中,腦是AA含量最高的組織器官之一,且在腦內(nèi)具有重要的神經(jīng)生理功能。大量研究表明,AA在腦內(nèi)主要充當(dāng)抗氧化劑和神經(jīng)調(diào)質(zhì)的角色[6,7]。首先,在生物體內(nèi),AA作為一種強的還原劑,參與諸多的生理過程,通過其氧化反應(yīng)消除自由基,減少氧化應(yīng)激的損傷,如研究發(fā)現(xiàn)AA可緩解癲癇、腦缺血、腦水腫等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的癥狀[8~10]。其次,AA被認為是腦內(nèi)重要的神經(jīng)調(diào)質(zhì)之一,研究表明,AA在腦內(nèi)的分布與兒茶酚類和谷氨酸等神經(jīng)遞質(zhì)分布密切相關(guān),并作為重要輔酶因子,對去甲腎上腺素和多種神經(jīng)肽合成具有影響[1,11,12]。 Wang等[13]發(fā)現(xiàn),嗜鉻細胞內(nèi)AA通過囊泡釋放,也說明其可能作為調(diào)質(zhì)參與到神經(jīng)傳遞過程。

    腦內(nèi)AA的分布具有一定區(qū)域性差異,胞內(nèi)轉(zhuǎn)運及細胞釋放機制復(fù)雜。AA是極性小分子化學(xué)物質(zhì),且不能自由進出細胞膜,所以不能通過單純擴散的方式穿越細胞膜。大鼠腦內(nèi)AA的來源及濃度分布同人類基本一樣,AA通過大腦的脈絡(luò)叢從血液中進入中樞神經(jīng)系統(tǒng),然后擴散到細胞間液,細胞間液中AA的濃度約為200~400 μmol/L,并且濃度可保持相對穩(wěn)定[14]。細胞間液的AA進一步被轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi),神經(jīng)元內(nèi)AA濃度約為10 mmol/L,神經(jīng)膠質(zhì)細胞內(nèi)AA濃度約為1 mmol/L[15]。目前的研究表明,AA從細胞間液到細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運機制有兩種:葡萄糖轉(zhuǎn)運體控制的協(xié)同擴散脫氫抗壞血酸(AA的氧化產(chǎn)物)的形式進行轉(zhuǎn)運; Na+依賴的AA轉(zhuǎn)運體控制的主動轉(zhuǎn)運[16,17]。與神經(jīng)遞質(zhì)不同,AA從細胞內(nèi)釋放的機制更加復(fù)雜,并不是單一的釋放過程。目前已報道的主要有3種:一種認為AA是通過體積敏感陰離子通道實現(xiàn)釋放[18]; 另一種認為AA可通過與谷氨酸異相交換機制來實現(xiàn)從細胞內(nèi)釋放至細胞外[1,19,20]; 也有文獻報道AA可與兒茶酚胺同時分泌到細胞外,而且AA的分泌與兒茶酚胺的分泌具有依賴細胞外Ca2+的一致性[21]。總體而言,AA釋放機制涉及諸多生理病理過程,例如胞吐、缺氧去極化、谷氨酸興奮毒性、水腫等。因此,可準確、實時、選擇性檢測不同腦區(qū),不同層次AA的方法對于研究腦AA相關(guān)的神經(jīng)生理及病理過程具有重要意義[22]。

    目前,有多種方法可實現(xiàn)不同時間空間分辨率條件下腦內(nèi)化學(xué)物質(zhì)的分析,如磁共振成像、功能磁共振腦成像、磁共振波譜、正電子發(fā)射斷層掃描和單光子發(fā)射斷層掃描、熒光成像等[23,24]。電分析化學(xué)方法具有儀器設(shè)備簡單、靈敏度高、可實現(xiàn)原位實時分析和多組分同時測定等優(yōu)點,在腦神經(jīng)科學(xué)研究中具有獨特的優(yōu)勢,在活體研究中受到了越來越多的關(guān)注和應(yīng)用[25~28]。目前,腦神經(jīng)電化學(xué)分析方法主要可分為微電極活體伏安法、微透析活體取樣?樣品分離?電化學(xué)檢測及微透析活體取樣?在線電化學(xué)檢測3種方法。其中活體伏安法和微透析活體取樣?在線電化學(xué)檢測,由于時間分辨率高,無需分離,在活體分析中的需求最大。但是,腦內(nèi)物質(zhì)繁多,不僅有小分子的物質(zhì),更有大分子的蛋白,如何實現(xiàn)AA的高選擇性、穩(wěn)定的電化學(xué)分析具有很大的挑戰(zhàn)。本文簡單介紹了AA的基礎(chǔ)電化學(xué)性質(zhì),詳細地對如何在活的整體動物層次和細胞層次上,實現(xiàn)不同時空分辨率的AA的選擇性分析的研究進展進行了評述。

    2?抗壞血酸的電化學(xué)

    如圖1所示,AA是有兩個可電離質(zhì)子的水溶性六元糖酸,pKa分別為4.2和11.8。在生理條件下,AA是帶負電荷的離子; 在中性條件下,AA的電化學(xué)氧化為一質(zhì)子、兩電子過程,其電化學(xué)氧化產(chǎn)物進一步水解,生成二酮古洛糖酸[29,30]。雖然,AA在電極表面氧化電位是0.05 V (vs NHE),但由于AA氧化后的最終水解產(chǎn)物易吸附在電極表面,AA在一般電極上的氧化都具有大的過電位,導(dǎo)致其氧化電位和腦內(nèi)共存的其它電化學(xué)活性神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)(如多巴胺(Dopamine, DA)、二羥基苯乙酸(3,4?Dihydroxyphenylacetic acid, DOPAC)、腎上腺素(Epinephrine, E)、去甲腎上腺素(Norepinephrine, NE)、5?羥色胺(5?Hydroxytryptamine,5?HT)等)的氧化電位無法分開,使得AA的選擇性分析具有很大的挑戰(zhàn)。

    在大多數(shù)碳電極表面,AA是一種內(nèi)殼層活性物質(zhì),在電極上的電化學(xué)行為與電極的表面化學(xué)性質(zhì)密切相關(guān)。碳電極,如玻碳電極、高定向熱解石墨電極(Highly oriented pyrolytic graphite, HOPG)和金剛石電極,其結(jié)構(gòu)與電化學(xué)活性之間的關(guān)系一般由以下一個或幾個因素決定:電極表面微結(jié)構(gòu)、表面潔凈程度、電子結(jié)構(gòu)以及表面官能團等。研究發(fā)現(xiàn),預(yù)處理的碳電極可加快AA的電子轉(zhuǎn)移速度[31,32]。Guo等[33]通過調(diào)控石墨炔的電子態(tài)和化學(xué)界面,發(fā)現(xiàn)AA在化學(xué)還原和電化學(xué)還原的石墨炔上的電子轉(zhuǎn)移速率比石墨炔和氧化的石墨炔電極上的快。最近,Xiao等[34]系統(tǒng)研究了不同碳纖維對AA電化學(xué)氧化的影響(圖2)。 他們選取3種來源的碳纖維電極(Carbon fiber microelectrode, CFE,Type?1,Type?2和Type?3 CFEs),將CFE分別在酸溶液(0.5 mol/L H2SO4)和堿溶液(1.0 mol/L NaOH)中進行電化學(xué)處理。在硫酸和堿溶液中電化學(xué)處理的Type?1和Type?3 CFE可顯著增加AA的電子轉(zhuǎn)移速率(圖2A和2C),但經(jīng)處理的Type?2 CFE 對AA的氧化卻無顯著改變(圖2B)。研究表明,由于電極表面的含氧官能團、表面結(jié)構(gòu)(如缺陷)及電子態(tài)密度與CFE來源和電化學(xué)預(yù)處理密切相關(guān),因此,電極對于AA的電化學(xué)氧化的催化活性與所采用的處理條件和碳纖維的來源有著密切的聯(lián)系,且表現(xiàn)出較大差異。

    用化學(xué)物質(zhì)修飾電極表面,調(diào)控AA在電極表面的電化學(xué)過程是實現(xiàn)高選擇性檢測AA的有效策略。通常,在裸金電極表面,由于AA氧化產(chǎn)物在電極表面的吸附 AA的氧化峰電位約為0.5 V。 Raj等[35]將有機硫化合物,如2,2?二硫代雙乙胺和6,6?二硫代雙己胺,通過AuS鍵在金電極表面形成單分子自組裝膜(Self?assembled monolayer, SAM),由于SAM末端的正電荷和帶負電AA之間的靜電相互作用,AA的氧化峰電位負移了約0.45 V,而在SAM組裝電極上,DA的氧化電位約為0.2 V,實現(xiàn)了用微分脈沖伏安法Differential pulse voltammetry, DPV)選擇性分析AA。

    利用材料提高AA電子轉(zhuǎn)移速率從而實現(xiàn)AA的選擇性分析是另外一種有效的策略。碳納米管(Carbon nanotube, CNT)具有獨特的電子、化學(xué)、光學(xué)和機械性能。早期的研究表明,CNT側(cè)壁碳的性質(zhì)與HOPG電極的層狀碳類似,其電化學(xué)性質(zhì)不活潑。相反地,CNT的端口碳的性質(zhì)類似于HOPG電極的邊緣碳,而具有很好的電化學(xué)活性。Zhang等[36]利用硝酸和硫酸混酸切割的單壁碳納米管(Single?walled carbon nanotube,SWNT)表面帶負電荷的性質(zhì),將其和具有正電荷性質(zhì)的聚二烯丙基二甲基氯化銨通過靜電作用逐層組裝在基底電極上,組裝的SWNT電極對AA具有很好的催化性能。他們進一步系統(tǒng)研究了AA在裸玻碳電極、石墨、SWNT、真空高溫處理的SWNT不同碳材料電極上的電化學(xué)行為。從圖3K可見,AA在SWNT電極上的氧化電位比在玻碳電極和石墨修飾電極上的氧化電位負,說明 SWNT電極降低了AA的過電位,加速了AA的電子轉(zhuǎn)移動力學(xué)。從AA在純化的 SWNT電極上的響應(yīng)(圖3)可見,含氧官能團的氧化還原峰并未發(fā)生變化,所以SWNT的含氧官能團沒有影響AA的催化。同時他們發(fā)現(xiàn),AA在未純化的 SWNT和酸純化的 SWNT電極上的電化學(xué)行為沒有明顯的區(qū)別,所以SWNT中所含的雜質(zhì)不是引起AA電子轉(zhuǎn)移加快的原因。盡管AA在SWNT上電催化性能還需進一步研究,但推測AA在SWNT電極上快的電子轉(zhuǎn)移可能與SWNT碳結(jié)構(gòu)有關(guān)。

    3?活體原位電化學(xué)分析

    活體伏安法是將微電極直接插入大腦特定部位,實現(xiàn)腦內(nèi)生理活性物質(zhì)的活體實時分析的電化學(xué)分析方法[37]。因其所用微電極尺寸小,可置入腦組織,分析時空分辨率高,活體伏安法在腦神經(jīng)化學(xué)過程的研究中備受關(guān)注[38~40]。Adams等[41]于1972年第一次將碳糊電極(直徑約300 μm)植入大鼠腦內(nèi),并獲得了腦內(nèi)第一張循環(huán)伏安圖,并猜測所獲得的伏安信號為AA的氧化峰。用同樣的方法,O'Neill等[42]通過腦區(qū)微注射和腹腔注射AA,增加了伏安信號,Brazell等[43]通過向腦區(qū)注射AA選擇性氧化酶(Ascorbate oxidase, AAOx),證實了獲得的伏安信號為AA,并用該方法測定了不同腦區(qū)和微注射谷氨酸時AA的變化。然而,碳糊電極直徑太大,碳纖維電極(CFE,5~7 μm)具有較高空間分辨率和生物兼容性等性能,因此,越來越多研究開始關(guān)注CFE,并發(fā)展了許多檢測AA的方法[44~47]。Gonon等[48]第一次對CFE進行處理(圖4A),用DPV法實現(xiàn)了腦內(nèi)AA的選擇性分析。Heien等[49]通過快速掃描循環(huán)伏安法(Fast scan cyclic voltammetry, FSCV)和主成分回歸分析對 FSCV 數(shù)據(jù)進行了多組分分析,可同時測定AA、5?HT、DA、DOPAC、pH值的實時變化(圖4B)。

    如前所述,對電極表面進行合理的功能化[50~53],是實現(xiàn)AA選擇性分析的有效策略。Zhang等[36]

    第一次在電極表面修飾CNT,實現(xiàn)了AA的活體檢測。AA在CNT修飾的CFE上在 0.0 V左右達到穩(wěn)態(tài)電流,說明修飾在CFE上的CNT對AA具有很好的電化學(xué)催化作用。此外,DA、尿酸和5?HT這些腦內(nèi)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的氧化電位都比AA在CNT修飾的CFE氧化電位正,因此不干擾AA的電化學(xué)分析。他們通過多壁碳納米管(Multiwalled carbon nanotube, MWNT)修飾的CFE,用DPV的方法檢測鼠腦細胞間液中AA的濃度約為 (0.20±0.05) mmol/L。他們通過向電極附近注入AAOx,證明MWNT修飾的CFE電極對AA具有很好的選擇性[54](見圖5)。

    由于CNT修飾CFE的技術(shù)在神經(jīng)科研領(lǐng)域的研究較難,且電極制備的可重復(fù)性有待進一步提高,Xiang等[55]制備了陣列碳納米管覆蓋的碳纖維微電極(Vertically aligned carbon nanotube sheathed carbon fiber, ?VACNT?CFE),大大簡化了碳納米管微電極的制備方法,避免了手工滴涂修飾CNT引起的電極性能差異,以及繁雜修飾步驟。圖6為CFE (A)和VACNT?CFE (B)的

    掃描電鏡圖,CNT均勻生長在CFE表面,在稀H2SO4溶液中電化學(xué)預(yù)處理,得到的VACNT?CFE對AA的響應(yīng)與裸CFE相似,然而,VACNT?CFE在NaOH溶液中電化學(xué)活化后,表現(xiàn)出對AA良好的電催化性能,降低了AA氧化的過電位,并增大了其電流響應(yīng),這些實驗結(jié)果證明了CNT的端口碳對AA具有良好的催化性能。VACNT?CFE對AA的分析呈現(xiàn)出良好的選擇性和線性關(guān)系,并可觀察到灌注谷氨酸所引起的AA釋放,實時監(jiān)測了AA和谷氨酸的異相交換行為(圖6E)。

    在CFE表面垂直生長CNT方法可用于腦內(nèi)AA測定,雖然該電極制備方法可避免人工修飾引起的一系列問題,但是該方法復(fù)雜,不利于大量制備電極。為進一步簡化CNT電極的制備,Xiao等[34]發(fā)展了一種可控且重現(xiàn)性極高的電泳沉積SWNT修飾電極的方法,電泳的方法可非常簡單地將酸化處理的SWNT沉積到CFE表面,該電極對AA的電化學(xué)氧化表現(xiàn)出良好的催化作用,重現(xiàn)性高(如圖7)。

    重要的是,檢測AA時,CNT修飾的CFE比電化學(xué)處理的CFE具有更好的穩(wěn)定性,因此有利于研究腦科學(xué)與AA相關(guān)的生理或者病理過程中AA變化。如擴散性抑制(Spreading depression, SD)是一種在腦內(nèi)神經(jīng)細胞去極化,隨后受到抑制并類似去極化波在神經(jīng)及膠質(zhì)細胞間進行傳播的現(xiàn)象。SD發(fā)病過程與偏頭痛、癲癇發(fā)病過程非常相似[56]。因此SD發(fā)病過程中機理的研究,對于相關(guān)疾病的發(fā)病機制的研究和治療都有重要的參考意義。Xiao等[57]用SWNT修飾的CFE測定了鼠腦皮層由電刺激引發(fā)的SD過程中AA的濃度動態(tài)變化。如圖8A和8B 所示,利用給予局部注射AAOx和改變施加電位的方式,進一步驗證記錄到的電流的變化是由SD導(dǎo)致胞外AA濃度變化引起的。為進一步理解SD過程中AA釋放的機理,局部注射NMDA受體拮抗劑地佐環(huán)平(MK?801)阻斷谷氨酸依賴的SD的傳播,并可抑制SD過程中AA的釋放(圖8C),進一步證明了AA的釋放受SD過程中谷氨酸的調(diào)節(jié)。為了探索AA的釋放是否是由于谷氨酸異相交換引起的,采用D,L?蘇式?β?芐氧基天冬氨酸(D,L?TBOA)進行干預(yù),大鼠給予D,L?TBOA 后,發(fā)現(xiàn)電刺激AA的釋放并未被抑制(圖8D)。因此,報道認為SD過程中AA釋放并不是谷氨酸的異相交換引起的,可能與SD過程中細胞水腫密切相關(guān)。

    比率型電分析引入內(nèi)參比氧化還原電對,使用待分析物和內(nèi)參比的電流響應(yīng)對分析物進行分析,可克服復(fù)雜體系的基底效應(yīng)。Tian研究組[58,59]首次提出比率型電分析策略,并將CNT紡成碳纖維絲,制備得到CNT纖維(Carbon nanotube fiber, CNF),實現(xiàn)了活體內(nèi)比率型AA的分析檢測。如圖9所示, AA在CNF上的氧化電位為50 mV,利用DPV技術(shù),結(jié)合比率型電化學(xué)方法,對腦內(nèi)的AA 實現(xiàn)了選擇性分析,采用該方法觀察到到老年癡呆癥大鼠皮層、紋狀體和海馬3個腦區(qū)AA含量明顯低于正常大鼠。Cheng等[60]將硫瑾固定在炭黑修飾的CFE上,結(jié)合比率型電化學(xué),用循環(huán)伏安法選擇性檢測聽皮層的AA,并觀察到水楊酸鈉引起的耳鳴過程中AA的變化。

    同時記錄神經(jīng)元的電活動信息以及腦內(nèi)AA的動態(tài)變化可將神經(jīng)細胞之間的信號傳遞與AA密切相關(guān)的神經(jīng)調(diào)節(jié)過程聯(lián)系起來,從而深入理解腦生理和病理過程的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制[61]。Cheng等[62]將SWNT修飾的CFE和毛細管玻璃微電極有效集成為雙通道微電極(Integrated dual?mode microelectrode, IDMME),用CFE選擇性記錄AA,用玻璃管微電極記錄電生理信號,該雙通道微電極可獨立記錄化學(xué)和電信號,兩種信號之間沒有交叉干擾,并成功地用于原位連續(xù)監(jiān)測大鼠腦缺血/再灌注過程中AA以及神經(jīng)元細胞電活動的動態(tài)變化。

    生物大分子在電極表面的吸附是活體原位分析AA面臨的另一個挑戰(zhàn),因為腦內(nèi)環(huán)境較復(fù)雜,不僅存在許多小分子干擾物質(zhì),還包含許多生物大分子(如脂質(zhì),蛋白質(zhì))[63]。電極植入后腦內(nèi)生物大分子會在電極表面吸附,導(dǎo)致電極檢測靈敏度下降,使得電極必須在活體檢測后進行校正,才能對活體數(shù)據(jù)進行分析。Liu等[64]發(fā)現(xiàn),用牛血清蛋白(Bovine serum albumin, BSA)處理后的CNT修飾CFE電極的活體檢測前校準曲線和活體檢測后校準曲線基本一致,從而巧妙地實現(xiàn)了活體前校準,克服了活體檢測過程中或者活體分析后微電極取出時電極斷裂無法校準的問題。

    4?活體微透析取樣?在線電化學(xué)分析

    微透析技術(shù)是一種從生物活體內(nèi)進行動態(tài)微量生化采樣的技術(shù),最早由Delgado提出并申請了美國專利, Ungerstedt等[65]于1982年報道了采用微透析技術(shù)檢測DA的實驗結(jié)果,并于1987年申請了現(xiàn)在應(yīng)用最為廣泛的同心型探針的專利。微透析活體取樣?色譜分離?電化學(xué)檢測方法是將微透析液首先經(jīng)過高效液相色譜或毛細管電泳分離,然后進行電化學(xué)檢測。這種方法中對電極的選擇性要求不苛刻,方法簡單,廣泛地應(yīng)用于腦神經(jīng)化學(xué)過程中生理活性物質(zhì)的檢測以及生理和病理過程的研究[66]。如Lee等[67]用微透析取樣?色譜分離?電化學(xué)檢測方法檢測了腦內(nèi)的AA。雖然微透析取樣?色譜分離?電化學(xué)檢測方法的建立比較容易,但是這種分析方法必須首先收集微透析樣品,然后用色譜 (或者電泳) 分離,再進行電化學(xué)檢測。樣品收集和色譜分離需要的時間都很長,因此方法的時空分辨率低,而且樣品在收集過程中AA容易被氧化而失真。盡管Qian等[68]設(shè)計了毛細管電泳分離?電化學(xué)檢測DA的芯片,將樣品收集的時間縮短為1 min,同時也縮短了分離的時間,但是,微透析活體取樣?樣品分離?電化學(xué)檢測方法仍然存在一些問題,需進一步完善。

    微透析取樣?電化學(xué)在線檢測系統(tǒng)(Online electrochemical system, OECS)無需分離,樣品保真程度高,樣品取出后直接電化學(xué)檢測,可實現(xiàn)近似實時的分析。Zhang等[53]第一次利用CNT修飾的玻碳電極,結(jié)合微透析技術(shù),提出并建立了AA的活體、在線電化學(xué)分析新技術(shù)和新方法。該方法具有很好的選擇性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。大鼠活體實驗結(jié)果表明,正常狀態(tài)下大鼠紋狀體透析液中的AA濃度為(5.0±0.5) μmol/L (n=5),將專一催化AA氧化的AAOx與aCSF混合作為灌流液,如圖10所示,電流值基本無變化,說明透析液中其它神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)不干擾AA的測定。

    基于CNT修飾電極所構(gòu)建的在線電化學(xué)檢測方法對于AA的響應(yīng)在一定范圍內(nèi)不隨腦內(nèi)氧氣和pH值的改變而變化,穩(wěn)定性好,有利于連續(xù)監(jiān)測AA在各種生理/病理過程中的動態(tài)變化,探索AA的神經(jīng)化學(xué)機制[69]。Liu等[70]利用該系統(tǒng)研究了腦缺血過程中腦內(nèi)AA的變化規(guī)律,發(fā)現(xiàn)了大鼠紋狀體腦區(qū)AA濃度在不同腦缺血/再灌注過程中的變化差異,以及同樣程度的2?VO全腦缺血所導(dǎo)致的AA在紋狀體、皮層感覺運動區(qū)、背側(cè)海馬和腹側(cè)海馬4個腦區(qū)的空間變化差異[71]; 同時也發(fā)現(xiàn)了2?VO全腦缺血后早期靜脈注射抗氧化劑(如AA,谷胱甘肽)能有效抑制海馬區(qū)的AA在缺血后的上升[9]。這些實驗結(jié)果對于深刻理解腦缺血病理過程中與AA相關(guān)的神經(jīng)化學(xué)機制具有重要意義。

    活體多組分的檢測對理解AA相關(guān)的生理病理分子機制具有重要作用,因為在這些生理病理的發(fā)生與發(fā)展過程中,常伴隨著多種物質(zhì)的同時變化,如能量代謝物質(zhì)(如葡萄糖,乳酸)和各種離子(如Ca2+、Mg2+)等。商品化的可用于在線電化學(xué)檢測的電極形狀固定限制了多組分檢測[72]。微流控芯片技術(shù)因其獨特的優(yōu)點(如流路的可設(shè)計性,樣品量需求少等[73,74])而廣泛應(yīng)用于生物分析。Lin等[75]設(shè)計了一個聚二甲基硅氧烷(Poly(dimethylsiloxane), PDMS)微流控芯片,工作電極為CNT修飾的銦錫氧化物(Indium?tin oxide, ITO)電極,Ag/AgCl電極為參比電極,Pt絲電極為對電極,對微透析液中的AA實現(xiàn)了選擇性連續(xù)分析。

    連續(xù)檢測腦內(nèi)的AA和Mg2+具有重要的生理病理意義,因為腦內(nèi)的很多生理病理活動中都伴隨兩種物質(zhì)的變化[76]。Gao等[77]設(shè)計了可連續(xù)檢測AA和Mg2+的微透析取樣?微流控在線電化學(xué)分析系統(tǒng), 在同一個通道內(nèi)內(nèi)嵌兩個電極,分別修飾CNT和聚甲苯胺藍,選擇性檢測AA和Mg2+, 方法具有高的選擇性和穩(wěn)定性。測得腦透析液中AA和Mg2+濃度分別為21.9和139.4 μmol/L,全腦缺血后AA和Mg2+濃度分別下降了20.9%和31.3%

    微流控芯片還可通過設(shè)計流路,實現(xiàn)兩種以上物質(zhì)的檢測。Lin等[78]建立了可同時檢測葡萄糖、乳酸和AA的微透析取樣?微流控在線分析系統(tǒng)。通過巧妙設(shè)計微透析的進樣、輔酶和微透析液的混合、電極的排列形式,避免3個電極之間的交叉干擾,設(shè)計了如圖11所示的微流控芯片。

    在流路的上游用CNT修飾的ITO電極檢測AA,在流路的下游用兩個平行的電極分別修飾用亞甲基綠(Methylene green, MG)吸附的CNT和脫氫酶,分別檢測葡萄糖和乳酸,有效避免了3個電極之間的交叉干擾,并用該體系觀察了大鼠腦缺血/再灌注過程中腦內(nèi)AA、葡糖糖和乳酸的變化規(guī)律,深刻理解了腦缺血病理過程中相關(guān)的神經(jīng)化學(xué)機制[79,80]。

    5?單細胞安培法

    單細胞安培法是一種具有高時空分辨率的電化學(xué)方法,可記錄到單細胞水平神經(jīng)遞質(zhì),如兒茶酚胺類[81~83]。 Wang等[13]發(fā)現(xiàn)用堿性條件處理的CFE對AA具有很好的選擇性,并首次觀察到AA類似囊泡釋放的釋放行為。如圖12所示,給予細胞10 s的高鉀溶液刺激后,單細胞安培法明顯記錄到了大量分泌信號,且該信號與普通碳纖維記錄到的兒茶酚胺通過囊泡釋放的現(xiàn)象具有一致性。為進一步驗證獲取的信號為分泌的AA,用高濃度AAOx孵育細胞,發(fā)現(xiàn)未孵育的細胞裂解液中的氧化電流消失,說明該電極檢測到的是AA的釋放。為了進一步驗證AA是囊泡釋放,他們利用囊泡的釋放依賴于細胞外液中Ca2+濃度的經(jīng)典理論,將標準細胞外液替換為不含有Ca2+的細胞外液后,再次給予細胞相同的高鉀刺激后,觀察不到分泌信號。以上結(jié)果證明了AA可通過囊泡的形式進行胞吐釋放。同時,為進一步確認信號是由AA引起的,而非噪聲,他們將鉗制電壓由0 V變?yōu)?.2 V,發(fā)現(xiàn)類似囊泡釋放樣的信號消失。這進一步證明AA胞吐現(xiàn)象不是噪聲引起。該研究為AA的囊泡釋放提供了最直接的證據(jù),有利于深入探討AA的釋放機制,為神經(jīng)科學(xué)的發(fā)展提供了方法。

    6?結(jié)論與展望

    本文對近期AA的高時空分辨率的電化學(xué)方法和技術(shù)進行了評述,這些方法將為AA相關(guān)的生理和病理的研究提供有力的方法學(xué)保證,如CFE選擇性分析AA促使首次利用CFE發(fā)現(xiàn)AA的胞吐行為,推動了與AA相關(guān)的生理和病理的研究。本文所述方法可實現(xiàn)AA的選擇性分析, 隨著其它學(xué)科的發(fā)展,如材料科學(xué)、微加工技術(shù)、電子信息技術(shù)等, 這些方法將會得到進一步發(fā)展。另外,電化學(xué)方法與生理學(xué)技術(shù)(如光遺傳、電生理和成像等)聯(lián)用,進而實現(xiàn)多種方法和技術(shù)的高度集成,也將是AA方法學(xué)未來發(fā)展的主要方向之一。

    References

    1?Rice M E. Trends Neurosci., 2000, ?23(5): 209-216

    2?Nandi A, Mukhopadhyay C K, Ghosh M K, Chattopadhyay D J, Chatterjee I B. Free Radic. Biol. Med., 1997, 22(6): 1047-1054

    3?Yun J, Mullarky E, Lu C, Bosch K N, Kavalier A, Rivera K, Roper J, Chio II, Giannopoulou E G, Rago C, Muley A, Asara J M, Paik J, Elemento O, Chen Z, Pappin D J, Dow L E, Papadopoulos N, Gross S S, Cantley L C. Science, 2015, ?350(6266): 1391-1396

    4?Agathocleous M, Meacham C E, Burgess R J, Piskounova E, Zhao Z, Crane G M, Cowin B L, Bruner E, Murphy M M, Chen W, Spangrude G J, Hu Z, DeBerardinis R J, Morrison S J. Nature, 2017, ?549(7673): 476-481

    5?Xue J, Chen G, Hao F, Chen H, Fang Z, Chen F, Pang B, Yang Q, Wei X, Fan Q, Xin C, Zhao J, Deng X, Wang B, Zhang X, Chu Y, Tang H, Yin H, Ma W, Chen L, Ding J, Weinhold E, Kohli R M, Liu, Zhu Z, Huang K, Tang H, Xu G. Nature, 2019, ?569(7757): 581-585

    6?Rebec G V, Wang Z. J. Neurosci., 2001, ?21(2): 668-675

    7?Dutta A, Gautam R, Chatterjee S, Ariese F, Sikdar S K, Umapathy S. ACS Chem. Neurosci., 2015, ?6(11): 1794-1801

    8?Dong Y, Wang S, Zhang T, Zhao X, Liu X, Cao L, Chi Z. Brain Res., 2013, ?1535: 115-123

    9?Liu K, Yu P, Lin Y, Wang Y, Ohsaka T, Mao L. Anal. Chem., 2013, ?85(20): 9947-9954

    10?Brahma B, Forman R E, Stewart E E, Nicholson C, Rice M E. J. Neurochem., 2000, ?74(3): 1263-1270

    11?Levine M, Morita K, Heldman E, Pollard H B. J. Biol. Chem., 1985, ?260(29): 15598-15603

    12?Meredith M E, May J M. Brain Res., 2013, ?1539: 7-14

    13?Wang K, Xiao T, Yue Q, Wu F, Yu P, Mao L. Anal. Chem., 2017, ?89(17): 9502-9507

    14?Harrison F E, Dawes S M, Meredith M E, Babaev V R, Li L, May J M. Free Radic. Biol. Med., 2010, ?49(5): 821-829

    15?Rice M E, Forman R E, Chen B, Avshalumov M V, Cragg S J, Drew K L. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol., 2002, ?133(4): 515-525

    16?Corti A, Casini A F, Pompella A. Arch. Biochem. Biophys., 2010, ?500(2): 107-115

    17?Huang J, Agus D B, Winfree C J, Kiss S, Mack W J, McTaggart R A, Choudhri T F, Kim L J, Mocco J, Pinsky D J, Fox W D, Israel R J, Boyd T A, Golde D W, Connolly E S. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, ?98(20): 11720-11724

    18?Knoth J, Viveros O H, Diliberto E J. J. Biol. Chem., 1987, ?262(29): 14036-14041

    19?Grunewald R A, Fillenz M. Neurochem. Int., 1984, ?6(4): 491-500

    20?Wilson J X, Peters C E, Sitar S M, Daoust P, Gelb A W. Brain. Res., 2000, ?858(1): 61-66

    21?Daniels A J, Dean G, Viveros O H, Diliberto E J. Science., 1982, ?216(4547): 737-739

    22?QIN Tai?Chun, LI Xiao?Gang, HAO Jie, MAO Lan?Qun. Chinese J. Anal. Chem., 2015, ?43(3): 457-462

    秦泰春, 李曉鋼, 郝 潔, 于 萍, 毛蘭群. 分析化學(xué), 2015, ?43(3): 457-462

    23?Michael A C, Borland, L M. CRC Press: Boca Raton, FL, 2006

    24?Robinson D L, Hermans A, Seipel A T, Wightman R M. Chem. Rev., 2008, ?108(7): 2554-2584

    25?Wu F, Yu P, Mao L. Chem. Soc. Rev., 2017, ?46(10): 2692-2704

    26?Yu P, He X, Mao L. Chem. Soc. Rev., 2015, ?44(17): 5959-5968

    27?Wang Y, Mao L. Electroanalysis, 2016, ?28(2): 265-276

    28?Wu F, Yu P, Mao L. ACS Omega, 2018, ?3(10): 13267-13274

    29?Prieto F, Coles B A, Compton R G. J. Phys. Chem. B, 1998, ?102(38): 7442-7447

    30?Cheng H, Li L, Zhang M, Jiang Y, Yu P, Ma F, Mao L. TrAC?Trends Anal. Chem., 2018, ?109: 247-259

    31?Hu I, Kuwana T. Anal. Chem., 1986, ?58(14): 3235-3239

    32?Deakin M R, Kovach P M, Stutts K J, Wightman R M. Anal. Chem., 1986, ?58(7): 1474-1480

    33?Guo S, Yan H, Wu F, Zhao L, Yu P, Liu H, Li Y, Mao L. Anal. Chem., 2017, ?89(23): 13008-13015

    34?Xiao T, Jiang Y, Ji W, Mao L. Anal. Chem., 2018, ?90(7): 4840-4846

    35?Raj C R, Ohsaka T. J. Electroanal. Chem., 2001, ?496(1?2): 44-49

    36?Zhang M, Liu K, Gong K, Su L, Chen Y, Mao L. Anal. Chem., 2005, ?77(19): 6234-6242

    37?Xiang L, Yu P, Zhang M, Hao J, Wang Y, Zhu L, Dai L, Mao L. Anal. Chem., 2014, ?86(10): 5017-5023

    38?Xiao T, Wu F, Hao J, Zhang M, Yu P, Mao L. Anal. Chem., 2017, ?89(1): 300-313

    39?Li R, Liu X, Qui W, Zhang M. Anal. Chem., 2016, ?88(15): 7769-7776

    40?Li R, Guo D, Ye J, Zhang M. Analyst, 2015, ?140(11): 3746-3752

    41?Adams R N, Murrill E, McCreery R, Blank L, Karolczak M. Eur. J. Pharmacol., 1972, ?17(2): 287-292

    42?O'Neill R D, Grunewald R A, Fillenz M, Albery W J. Neuroscience, 1982, ?7(8): 1945-1954

    43?Brazell M P, Marsden C A. Brain Res., 1982, ?249(1): 167-172

    44?Dayton M A, Ewing A G, Wightman R M. Anal. Chem., 1980, ?52(14): 2392-2396

    45?Gonon F, Buda M, Cespuglio R, Jouvet M, Pujol J F. Brain Res., 1981: ?223(1): 69-80

    46?Ewing A G, Wightman R M, Dayton M A. Brain Res., 1982, ?249(2): 361-370

    47?Stamford J A, Kruk Z L, Millar J. Brain Res., 1984, ?299(2): 289-295

    48?Gonon F, Buda M, Cespuglio R, Jouvet M, Pujol J F. Nature, 1980, ?286(5776): 902-904

    49?Heien M L, Johnson M A, Wightman R M. Anal. Chem., 2004, ?76(19): 5697-5704

    50?Wang J, Tuzhi P, Villa V. J. Electroanal. Chem., 1987, ?234(1?2): 119-131

    51?Capella P, Ghasemzadeh B, Mitchell K, Adams R N. Electroanalysis, 1990, ?2(3): 175-182

    52?Feng J X, Brazell M, Renner K, Kasser R, Adams R N. Anal. Chem., 1987, ?59(14): 1863-1867

    53?Zhang M, Yu P, Mao L. Acc. Chem. Res., 2012, ?45(4): 533-543

    54?Zhang M, Liu K, Xiang L, Lin Y, Su L, Mao L. Anal. Chem., 2007, ?79(17): 6559-6565

    55?Xiang L, Yu P, Hao J, Zhang M, Zhu L, Dai L, Mao L. Anal. Chem., 2014, ?86(8): 3909-3914

    56?Pietrobon D, Moskowitz M A. Nat. Rev. Neurosci., 2014, ?15(6): 379-393

    57?Xiao T, Wang Y, Wei H, Yu P, Jiang Y, Mao L. Angew. Chem. Int. Edit., 2019, ?58(20): 6616-6619

    58?Zhang L, Liu F, Sun X, Wei G, Tian Y, Liu Z, Huang R, Yu Y, Peng H. Anal. Chem., 2017, ?89(3): 1831-1837

    59?Chai X, Zhou X, Zhu A, Zhang L, Qin Y, Shi G, Tian Y. Angew. Chem. Int. Edit., 2013, ?52(31): 8129-8133

    60?Cheng H, Wang X, Wei H. Anal. Chem., 2015, ?87(17): 8889-8895

    61?XU Sheng?Wei, WANG Li, SONG Xian?Teng, ZHANG Song, WANG Mi?Xia, YU Ping, MAO Lan?Qun. CAI Xin?Xia. Chinese J. Anal. Chem., 2016, ?44(9): 1458-1464

    徐聲偉, 王 力, 宋先騰, 張 松, 王蜜霞, 于 萍, 毛蘭群, 蔡新霞. 分析化學(xué), 2016, ?44(9): 1458-1464

    62?Cheng H, Xiao T, Wang D, Hao J, Yu P, Mao L. J. Electroanal. Chem., 2016, ?781: 90-96

    63?Liu X, Xiao T, Wu F, Shen M?Y, Zhang M, Yu H, Mao L. Angew. Chem. Int. Edit., 2017, ?56(39): 11802-11806

    64?Liu X, Zhang M, Xiao T, Hao J, Li R, Mao L. Anal. Chem., 2016, ?88(14): 7238-7244

    65?Ungerstedt U, Herrera?Marschitz M, Jungnelius U, Stahle L, Tossman U, Zetterstrm T. Advances in Dopamine Research, 1982: 219-231

    66?Yue X, Zhu Z, Zhang M, Ye Z. Anal. Chem., 2015, ?87(3): 1839-1845

    67?Lee M S, Yang D, Cheng C, Liang Y, Yang L, Cheng F. J. Chromatogr. A., 2003, ?985(1?2): 387-394

    68?Qian J, Wu Y, Yang H, Michael A C. Anal. Chem., 1999, ?71(20): 4486-4492

    69?LYU Yang, ZHANG Ya?Wen, TAN Lei, JI Wen?Liang, YU Ping, MAO Lan?Qun, ZHOU Fang. Chinese J. Anal. Chem., 2017, ?45(11): 1595-1599

    呂 揚, 張雅文, 譚 磊, 紀文亮, 于 萍, 毛蘭群, 周 方. 分析化學(xué), 2017, ?45(11): 1595-1599

    70?Liu K, Lin Y, Xiang L, Yu P, Su L, Mao L. Neurochem. Int., 2008, ?52(6): 1247-1255

    71?Liu K, Lin Y, Yu P, Mao L. Brain Res., 2009, ?1253: 161-168

    72?Dalbasti T, Cagli S, Kilinc E, Oktar N, Ozsoz M. Nitric Oxide?Biol. Chem., 2002, ?7(4): 301-305

    73?ZHANG Feng, GAO Dan, LIANG Qiong?Lin. Chinese J. Anal. Chem. 2016, ?44(12): 1942-1949

    張 逢, 高 丹, 梁瓊麟. 分析化學(xué), 2016, ?44(12): 1942-1949

    74?Wang S, Liu X, Zhang M. Anal. Chem., 2017, ?89(10): 5382-5388

    75?Lin Y, Lu X, Gao X, Cheng H, Ohsaka T, Mao L. Electroanalysis, 2013, ?25(4): 1010-1016

    76?Marinov M B, Harbaugh K S, Hoopes P J, Pikus H J, Harbaugh R E. J. Neurosurg, 1996, ?85(1): 117-124

    77?Gao X, Yu P, Wang Y, Ohsaka T, Ye J, Mao L. Anal. Chem., 2013, ?85(15): 7599-7605

    78?Lin Y, Yu P, Hao J, Wang Y, Ohsaka T, Mao L. Anal. Chem., 2014, ?86(8): 3895-3901

    79?ZHAO Fan, SHI Guo?Yue, TIAN Yang. Chinese J. Anal. Chem. 2019, ?47(3): 347-354

    趙 凡, 施國躍, 田 陽. 分析化學(xué), 2019, ?47(3): 347-354

    80?WANG Qian?Qian, ZHANG Yan, MENG Lu?Lu, PI Zi?Feng, LIU Shu, SONG Feng?Rui, LIU Zhi?Qiang. Chinese J. Anal. Chem., 2015, ?43(11): 1754-1760

    王倩倩, 張 艷, 孟璐璐, 皮子鳳, 劉 舒, 宋鳳瑞, 劉志強. 分析化學(xué), 2015, ?43(11): 1754-1760

    81?Li X, Dunevall J, Ewing A G. Angew. Chem. Int. Edit., 2016, ?55(31): 9041-9044

    82?Li X, Majdi S, Dunevall J, Fathali H, Ewing A G. Angew. Chem. Int. Edit., 2015, ?54(41): 11978-11982

    83?Ren L, Pour M D, Majdi S, Li X, Malmberg P, Ewing A G. Angew. Chem. Int. Edit., 2017, ?56(18): 4970-4975

    Recent Advances on in Vivo Electrochemical

    Analysis of Vitamin C In Rat Brain

    JI Wen?Liang1, ZHANG Mei?Ning*1, MAO Lan?Qun*2,3

    1(Department of Chemistry, Renmin University of China, Beijing 100872, China)

    2(Beijing National Laboratory for Molecular Science, Key Laboratory of Analytical Chemistry for Living Biosystems,

    Institute of Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China)

    3(University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

    Abstract?Vitamin C, also known as ascorbic acid, is an important neurochemicals in the brain. It serves as one of most important small?molecular?weight antioxidants for neuro?protection and neuromodulator to modulate neurological functions through glutamatergic, dopaminergic and neurotransmission. It is also a cofactor of enzymes involved in biosynthetic reactions such as the synthesis of catecholamines. Therefore, increasing interest has attracted in the measurement of AA in the brain. The high?potential oxidation of AA essentially renders difficulties in exploring the electrochemical property of AA to constitute an electrochemical protocol for its selective detection of AA with high spatial and temporal resolution in the brain. This review mainly focuses on recent updates on detection of AA by modulating the electron transfer of AA to achieve the high temporal, spatial resolution and selectivity for its detection in the rat brain and single?cell.

    Keywords?Vitamin C; In vivo; Electrochemical analysis; Selectivity; Review

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