地黃核苷二磷酸激酶基因的克隆及生物信息學分析

李冰怡 李謙謙 宮世萌 李嬌嬌 鄭雪 段紅英

摘 要： 核苷二磷酸激酶（NDPK）是一種高度保守的多功能蛋白，具有催化底物磷酸化的作用，能夠參與植物的生長發(fā)育、非生物脅迫、感病應激、光合作用和能量代謝等過程。為了解地黃核苷二磷酸激酶基因（RgNDPK Ⅰ）的結構、功能和性質，該研究利用地黃轉錄組學數據，通過電子克隆的方法獲得了RgNDPK Ⅰ基因的全長cDNA序列，長度為765 bp。生物信息學分析結果表明，RgNDPK Ⅰ基因的開放閱讀框長度為447 bp，編碼148個氨基酸，具有典型的核苷二磷酸激酶活性結構域和其他磷酸化活性位點。RgNDPK Ⅰ基因編碼的蛋白質定位于細胞質，是無跨膜區(qū)域的親水性蛋白，該蛋白質與芝麻、紫花風鈴的核苷二磷酸激酶相似性較高，分別為97%和96%。在多種生物中已經克隆得到了核苷二磷酸激酶基因，且不同植物核苷二磷酸激酶氨基酸序列中存在多個相似的保守結構域，推測RgNDPK Ⅰ基因所編碼的蛋白質為核苷二磷酸激酶超家族成員。該研究結果為進一步探明RgNDPK Ⅰ的性質、結構、功能及表達機制提供了重要的理論依據。

關鍵詞： 地黃， 核苷二磷酸激酶（NDPK）， 電子克隆， 生物信息學

中圖分類號： Q943 ?文獻標識碼： A

文章編號： 1000-3142（2020）04-0492-09

Abstract： Nucleoside diphosphate kinase （NDPK） is a highly conserved multifunctional protein， can catalyze substrate phosphorylation and participate in many metabolic processes， such as plant growth and development， abiotic stress， susceptible stress， photosynthesis and energy metabolism. In order to understand the structure， function and character of NDPK gene in Rehmannia glutinosa （RgNDPK Ⅰ）， full length cDNA of RgNDPK Ⅰ was obtained by silico cloning from the transcriptome data of Rehmannia glutinosa. The length of RgNDPK Ⅰ was 765 bp. According to bioinformatics analysis， with an open reading frame of 447 bp， RgNDPK Ⅰ encodes 148 amino acids， and has typical nucleoside diphosphate kinase domain and other phosphorylation active sites. The protein encoded by RgNDPK Ⅰ was located in the cytoplasm， and it was hydrophilic protein without transmembrane region. The protein was similar to nucleoside diphosphate kinase of Sesamum indicum and Handroanthus impetiginosus， 97% and 96% respectively. NDPK gene has been cloned in many organisms， and there are many similar conservative domains in the amino acid sequences of different plants， so it is presumed that RgNDPK Ⅰ is a member of the nucleoside diphosphate kinase superfamily. This study provides an important theoretical basis for further exploring the character， structure， function and expression mechanism of RgNDPK Ⅰ.

Key words： Rehmannia glutinosa， nucleoside diphosphate kinase（NDPK）， silico cloning， bioinformatics

核苷二磷酸激酶（nucleoside diphosphate kinase，NDPK）廣泛存在于生物界，1953年Burg等人第一次發(fā)現(xiàn)了NDPK蛋白（Dumas et al.， 1992），近年來人們對NDPK的研究興趣愈發(fā)濃厚（Bominaar et al.， 1993）。研究發(fā)現(xiàn)NDPK是一種進化上非常保守的酶（Hu et al.， 2015），能夠催化底物磷酸化、維持生物體內核苷酸的代謝平衡 （劉孟等，2016），還可能參與細胞增殖與發(fā)育的過程（Hu et al.， 2015），也有研究表明核苷二磷酸激酶A表達量和多種腫瘤轉移呈負相關（熊盛等，2004）。植物核苷二磷酸激酶的研究開始較晚，自從1971年于豌豆中分離得到第一個NDPK后（Edlund，1971），已從擬南芥、芒果、水稻、芝麻等植物中分離出NDPK。目前研究的植物核苷二磷酸激酶主要有NDPKⅠ、NDPKⅡ和NDPKⅢ三種，其中植物NDPKⅠ的含量最高（Manigbas et al.， 2011），占NDPKs總活性的70%以上（王文斌等，2011），且活性最強（Hetmann & Kowalczyk，2009），可對多種底物起催化作用，但對底物有一定的偏好性，優(yōu)先選擇利用ATP（Zrenner et al.， 2006）。一些研究發(fā)現(xiàn)核苷二磷酸激酶是一種高度保守的多功能蛋白，能夠參與植物的多種代謝調節(jié)過程（孫小潔和王增蘭，2012），包括植物生長發(fā)育、非生物脅迫、感病應激、光合作用和能量代謝等（朱馨妮等，2017）。

地黃（Rehmannia glutinosa）為玄參科（Scrophulariaceae）地黃屬（Rehmannia）多年生草本植物，其新鮮或干燥根塊莖可入藥（藥典委員會，2010）。全國各地都有種植地黃，尤其以懷地黃藥效最佳，具有增強免疫、抗病毒、降血糖、抗氧化、滋陰清熱、補血止血等多種效用（Duan et al.， 2018）。本研究從地黃中克隆了核苷二磷酸激酶基因的全長cDNA序列，并對其進行了相關生物信息學分析（鄭雪等，2018），以期進一步探明地黃核苷二磷酸激酶的性質、結構及功能，為研究植物核苷二磷酸激酶的功能及其機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以地黃85-5長勢良好的塊根為實驗材料，其栽培于河南師范大學試驗田。根據電子克隆法得到的地黃核苷二磷酸激酶基因全長cDNA序列，設計擴增目的基因的PCR引物，F(xiàn)：5′-ATGGAGCAGACTTTCATTATG-3′， R：5′-TCACTGATAGAT

CCAGGAGTGAA-3′，PCR擴增引物由上海生物工程公司合成。大腸桿菌Escherichia coli DH5α菌種、T4克隆載體購于寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試劑

在本研究中，主要用到以下試劑：反轉錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司），瓊脂糖、溴化乙錠（四川維克奇生物科技有限公司），引物（Invitrogen公司），膠回收試劑盒、DNA Marker（DL2 000）（寶生物生物技術公司），上樣緩沖液為6×Loading Buffer、2×Tap Master Mix（北京康為世紀生物科技有限公司）等，其他常規(guī)試劑均為國產分析純。

1.3 方法

1.3.1 RNA的提取及反轉錄 以地黃85-5的成熟塊根為實驗材料。首先，通過Trizol法提取總RNA，用DNase/RNase-free處理，酚-氯仿抽提去除DNase，乙醇沉淀回收RNA（孫鵬等，2008）。然后，通過微量分光光度計檢測RNA的260 nm/280 nm及其RNA的濃度，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。

本實驗利用HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒進行地黃cDNA的制備，按照說明書的操作進行實驗以合成cDNA第一鏈。

1.3.2 目的基因的克隆 電子克隆是在已建立的核酸序列與蛋白質序列數據庫的基礎上，利用計算機技術與生物信息學工具進行快速比對、拼接及分析從而獲得基因的部分乃至全長cDNA序列（葛春艷等，2018）。本研究以地黃85-5六個發(fā)育時期的組合塊根所轉錄出的RNA總和為材料進行轉錄組測序，采用HiSeq 2500 Illumina測序平臺進行測序，通過blast與其他公共數據庫進行同源性比對，獲得基因功能的注釋（王向楠，2017）。利用電子克隆的方法得到目的基因cDNA全長，然后在CDS區(qū)設計引物，以地黃的cDNA為模板，采用PCR技術克隆得到核苷二磷酸激酶的全長cDNA序列。

PCR擴增反應條件如下：首先，95 ℃預變性3 min;然后，95 ℃變性30 s，47 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán);最后，72 ℃總延伸10 min。PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，所得產物進行膠回收并連接到pMDl9-T載體上，然后轉化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，涂布于添加氨芐青霉素（100 mg·L-1）、IPTG、X-gal的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)12～16 h后進行藍白斑篩選及菌落PCR檢測，陽性克隆送至金唯智生物技術有限公司測序。

1.3.3 生物信息學分析 本研究通過blastp對RgNDPK Ⅰ基因編碼的氨基酸序列進行相似性搜索，并利用MEGA7.0和blastn構建其系統(tǒng)進化樹。使用DNAMAN分析RgNDPK Ⅰ編碼蛋白的相對分子質量、等電點及其同源蛋白的多序列比對。通過EXPASYPROTSCALE （http：//web.expasy.org/protparam/）、TMHMM （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分別分析RgNDPK Ⅰ編碼蛋白的疏水性及其跨膜區(qū)，采用EXPASYSignalP4.0Serve （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析RgNDPK Ⅰ編碼蛋白的信號肽，并利用CBS數據庫中的TargetP預測RgNDPK Ⅰ編碼蛋白的亞細胞定位。另外，通過NCBI的CDD分析RgNDPK Ⅰ編碼蛋白的結構域，利用SOPMA （http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預測了RgNDPK Ⅰ編碼蛋白的二級結構，同時采用SWISS-MODEL （http：//swissmodel.expasy.org/workspace/index.php？func=modelling_simple1&userid=USERID & token=TOKEN）同源建模方法對RgNDPK Ⅰ編碼蛋白進行在線3D結構預測。

2 結果與分析

2.1 地黃RgNDPK Ⅰ基因的克隆

本研究利用地黃的轉錄組學數據，通過電子克隆法得到地黃核苷二磷酸激酶基因的全長cDNA序列，然后在CDS區(qū)設計引物，以地黃的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明擴增片段長750 bp左右（圖 1），與預期結果相符。

測序結果表明目的基因的全長cDNA序列為765 bp，ORF Finder分析得知其開放閱讀框（ORF）位于第125～571個核苷酸，長度為447 bp，編碼148個氨基酸 （圖 2）。INTERPROSCAN和CDD的預測結果顯示RgNDPK Ⅰ基因編碼蛋白的保守結構域為核苷二磷酸激酶結構域，且與NDPKⅠ的保守結構域高度相似，表明該目的基因編碼蛋白是核苷二磷酸激酶超家族成員，且屬于NDPKⅠ類，推測其功能與核苷三磷酸鹽（NTPs）的合成有關。因此，本研究將克隆到的地黃核苷二磷酸激酶基因命名為RgNDPK Ⅰ ，并把RgNDPK Ⅰ基因數據提交至GenBank數據庫，其GenBank數據庫登陸號為MK248733。

2.2 地黃RgNDPK Ⅰ編碼蛋白的理化性質

地黃RgNDPK Ⅰ基因編碼蛋白的相對分子質量為16 395.82，等電點為6.30。在RgNDPK Ⅰ的氨基酸種類組成中，甘氨酸（Gly）和異亮氨酸（Ile）的含量最多。

蛋白疏水性預測結果表明地黃RgNDPK Ⅰ屬于親水蛋白（圖 3），且不存在跨膜區(qū)。另外，蛋白亞細胞結構定位結果表明，地黃RgNDPK Ⅰ定位于細胞質，且可信度為2（圖4）。

2.3 地黃RgNDPK Ⅰ編碼蛋白的結構預測

二級結構預測結果表明， 地黃RgNDPK Ⅰ主要由α螺旋、無規(guī)卷曲、延伸鏈和β折疊構成，其中α螺旋占49.32%、無規(guī)卷曲占23.66%、延伸鏈占18.24%、β折疊占8.78%（圖5：A）。由此可知，該蛋白中α螺旋比例最高。RgNDPK Ⅰ的三級結構（圖 5：B）與二級結構預測結果一致，推測地黃RgNDPK Ⅰ可能為α螺旋型蛋白。

2.4 地黃RgNDPK Ⅰ編碼蛋白的同源序列分析

利用blastp程序對地黃 RgNDPK Ⅰ基因編碼的氨基酸序列進行同源性分析，結果表明RgNDPK Ⅰ與芝麻、紫花風鈴的核苷二磷酸激酶的相似性最高，分別為97%和96%（表 1）。RgNDPK Ⅰ與紫花風鈴（PIN18357.1）、芝麻（XP_011093235.1）等物種核苷二磷酸激酶的多序列比對分析結果如圖 6所示，序列相似性達96.25%，表明核苷二磷酸激酶蛋白的氨基酸序列在不同物種之間較為保守。

利用blastn和MEGA7.0將RgNDPK Ⅰ氨基酸序列與同源性較高的其他物種的核苷二磷酸激酶序列進行系統(tǒng)進化分析，選擇參數Test of Phylogeny為Bootstrap method，設置No. of Bootstrap Replications為100，其他參數均為默認值，分析發(fā)現(xiàn)地黃與芝麻和紫花風鈴的核苷二磷酸激酶進化距離近，表明其親緣關系較近;而與向日葵、黃胡蘿卜核苷二磷酸激酶的親緣關系較遠（圖7）。

3 討論

核苷二磷酸激酶屬于核苷二磷酸激酶超家族，具有催化底物磷酸化的作用（劉孟等，2016），在植物的種子萌發(fā)、非生物脅迫、感病應激、光合作用、防御保護相關基因的誘導表達、能量代謝和信號傳遞等過程具有調控作用（Yang et al.， 2003;王文斌等，2011;孫小潔和王增蘭，2012;朱馨妮等， 2017）。目前， 植物中研究的核苷二磷酸激酶主要有NDPKⅠ、NDPKⅡ、NDPKⅢ三種。一些研究發(fā)現(xiàn)植物NDPKⅠ、NDPKⅡ、NDPKⅢ具有不同的亞細胞定位，其中NDPKⅠ通常定位于細胞質、細胞核，NDPKⅢ定位于葉綠體、線粒體，而NDPKⅡ可能定位于葉綠體（王文斌等，2011）。本研究利用地黃的轉錄組學數據，通過電子克隆法（高興春等，2005）首次從地黃中克隆得到的核苷二磷酸激酶基因RgNDPK Ⅰ的cDNA序列，開放閱讀框長度為447 bp，共編碼148個氨基酸，RgNDPK Ⅰ基因編碼蛋白含有保守的核苷二磷酸激酶結構域和其他磷酸化活性位點，其結構域與NDPKⅠ的保守結構域高度相似，而且亞細胞定位于細胞質，表明RgNDPK Ⅰ是核苷二磷酸激酶超家族成員，且屬于NDPKⅠ類。因此，推測RgNDPK Ⅰ基因可能在植物生長發(fā)育和感病應激等信息傳遞、非生物脅迫、淀粉和纖維素的合成等方面發(fā)揮作用（朱馨妮等，2017）。

進一步分析發(fā)現(xiàn)地黃RgNDPK Ⅰ與芝麻、紫花風鈴的核苷二磷酸激酶相似性較高，分別為97%和96%，而且不同植物的核苷二磷酸激酶存在多個相似的保守結構域，這與前人的研究結果相似（羅睿雄等，2016），進一步證明地黃RgNDPK Ⅰ為核苷二磷酸激酶超家族成員。目前，植物核苷二磷酸激酶已從多種植物中被分離出來，其研究也取得了較大的進展。劉孟（2016）研究發(fā)現(xiàn)核苷二磷酸激酶具有催化磷酸基團轉移的作用，羅睿雄等（2016）研究發(fā)現(xiàn)芒果NDPK具有重要的化學反應催化功能和調控植物響應逆境脅迫的作用，譚龍（2011）研究表明NDPKⅢ通過調節(jié)植物的氧化脅迫參與了響應多環(huán)芳烴菲的應答，梁潘霞等（2012）也對甘蔗核苷二磷酸激酶基因進行了克隆和功能驗證。另外，NDPKⅠ在不同植物中功能表現(xiàn)存在差異，在一些植物中發(fā)揮特殊功能作用，如馬鈴薯NDPKⅠ參與了淀粉和纖維素的合成，玉米中存在G4結構的NDPKI可以與DNA結合（朱馨妮等，2017）。雖然本研究對地黃RgNDPK Ⅰ基因進行了克隆及生物信息學分析，但是關于地黃RgNDPK Ⅰ基因的具體功能及其作用機制仍需要進一步深入研究。

參考文獻：

BOMINAAR AA， MOLIJN AC， PESTEL M， et al.， 1993. Activation of g-proteins by receptor-stimulated nucleoside diphosphate kinase in dictyostelium [J]. EMBO J， 12（6）： 2275-2279.

Chinese Pharmacopoeia Commission， 2010. Pharmacopoeia of peoples republic of China （1st ed） [M]. Beijing： China Medical Science Press： 115. [藥典委員會， 2010. 中華人民共和國藥典（一部） [M]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社：115.]

DUAN HY， LI JJ， WANG HN， et al.， 2018. Effects of DNA methylation on growth and development of Rehmannia glutinosa [J]. Int J Agric Biol， 20（10）： 2161-2168.

DUMAS C， LSACU I， MORERA S， et al.， 1992. X-ray structure of nucleoside diphosphate kinase [J]. EMBO J， 11（9）： 3203-3208.

EDLUND B， 1971. Purification of a nucleoside diphosphate kinase from peaseed and phosphorylation of the enzyme with adenosine （32P） triphosphate [J]. Acta Chem Scand， 25（4）： 1370-1376.

GAO XC， GU XF， HAN J，et al.， 2005. Clone full-length cDNA for chicken MIBP by silico cloning [J]. Bioinformatics， 3（2）： 58-61. [高興春， 顧雪峰， 韓俊， 等， 2005. 基于電子克隆方法獲得雞MIBP全長cDNA [J]. 生物信息學， 3（2）：58-61.]

GE CY， LI XT， LIU FP， et al.， 2018. In silico cloning and bioinformatics analysis of AG gene in Rhodiola rosea （RrAG） [J]. Jiangsu Agric Sci， 21（12）： 1002-1302. [葛春艷， 李雪彤， 劉福鵬， 等， 2018. 紅景天AG基因 （RrAG）的電子克隆及生物信息學分析 [J]. 江蘇農業(yè)科學， 21（12）：1002-1302.]

HETMANN A， KOWALCZYKS， 2009. Nucleoside diphosphate kinase isoforms regulated by phytochrome A isolated from oat coleoptiles [J]. Acta Biochim Polon， 56 （1）： 143-153.

HU YS， FENG F， LIU YF， 2015. Structural and functional characterization of Acinetobacter baumannii nucleoside diphosphate kinase [J]. Prog Biochem Biophys， 42（3）： 260-267.

LIANG PX， LI YR， YANG LT， 2012. Molecular cloning of sugarcane NDPK1 gene and its expression analysis [J]. Chin J Trop Crop， 33（12）： 2199-2205. [梁潘霞， 李楊瑞， 楊麗濤， 2012. 甘蔗核苷二磷酸激酶（NDPK1）基因克隆及表達分析 [J]. 熱帶作物學報， 33（12）： 2199-2205.]

LIU M， NIE LC， WANG SS， et al.， 2016. Expression analysis of differential proteins in three kinds of flower buds with sex differentiation of Asparagus [J]. Sci Agric Sin， 49（21）： 4192-4202. [劉孟， 乜蘭春， 王珊珊， 等， 2016. 蘆筍三種花蕾性別分化相關差異蛋白表達分析 [J]. 中國農業(yè)科學， 49（21）：4192-4202.]

LUO RX， ZHAO ZC， HUANG JF， et al.， 2016. Molecular cloning of mango NDPK1 gene and its expression analysis [J]. Chin J Trop Crop， 37（11）： 2183-2190. [羅睿雄， 趙志常， 黃建峰， 等， 2016. 芒果核苷二磷酸激酶（NDPK）基因克隆及表達分析 [J]. 熱帶作物學報， 37（11）：2183-2190.]

MANIGBAS NL， PARK DS， PARK SK， et al.， 2011. Enhanced tolerance of transgenic rice overexpressing Arabidopsis thaliana nucleoside diphosphate kinase （At NDPK2） against various environmental stresses [J]. Philipp Agric Sci， 94 （1）： 29-37.

SUN P， GUO YH， QI JJ， et al.， 2008. One kind of RNA extraction method suitable for different tissues of Rehmannia glutinosa [J]. Chin Agric Sci Bull， 24（4）： 29-32. [孫鵬， 郭玉海， 祈建軍， 等， 2008. 一種適用于地黃不同組織器官的RNA提取方法 [J]. 中國農學通報， 24（4）：29-32.]

SUN XJ， WANG ZL， 2012. Bioinformations analysis of a nucleoside diphosphate kinase gene family in Arabidopsis thaliana [J]. Henan Agric Sci， 41（4）： 38-44. [孫小潔， 王增蘭， 2012. 擬南芥核苷二磷酸激酶基因家族的生物信息學比較與分析 [J]. 河南農業(yè)科學， 41（4）： 38-44.]

TAN L， 2012. Function analysis of nucleoside diphosphate kinase in response to the stress of phenanthrene [D]. Fuzhou： Fujian Agricultural Forestry University： 7-10. [譚龍， 2011. 核苷二磷酸激酶在響應菲脅迫中的功能分析 [D]. 福州： 福建農林大學： 7-10.]

WANG WB， WANG JS， DENG XP， et al.， 2011. Research advances on nucleoside diphosphate kinases （NDPKs） of Plants [J]. J Agric， 1（6）： 1-5. [王文斌， 王金勝， 鄧西平， 等， 2011. 植物核苷二磷酸激酶（NDPKs）研究進展 [J]. 農學學報， 1（6）：1-5.]

WANG XN， 2017. Ming and identification of verbascoside biosynthesis associated genes based on transcriptome sequencing of Rehamannia glutinosa [D]. Xinxiang： Henan Normal University： 27-45. [王向楠， 2017. 基于轉錄組測序的地黃毛蕊花糖苷生物合成相關酶基因的發(fā)掘與鑒定 [D]. 新鄉(xiāng)：河南師范大學：27-45.]

XIONG S， LI XL， WANG YF， et al.， 2004. Determination of serum NDPK-A and its climical significance [J]. Chin J Health Laborat Technol， （5）： 522-523. [熊盛， 李雪玲， 王一飛， 等， 2004. 血清核苷二磷酸激酶A（NDPK-A）含量測定及其臨床意義初探 [J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志， （5）：522-523.]

YANG KA， MOON HJ， KIM GT， et al.， 2003. NDP kinase 2 regulates expression of antioxidant genes in Arabidopsis [J]. Proc Jpn Acad Ser B， 79（1）： 86-91.

ZHENG X， WANG HN， ZHU YQ， et al.， 2018. Bioinformatics analysis of GPPS gene of Picrorrhiza royle [J]. Henan Agric Sci， 47（6）： 104-110. [鄭雪， 王慧娜， 朱彥秋， 等， 2018. 胡黃連GPPS基因的生物信息學分析 [J]. 河南農業(yè)科學， 47（6）：104-110.]

ZHU XN， WANG SS， ZHOU JQ， et al.， 2017. Research advances of NDPKs in plants [J]. Biotechnol Bull， 33（11）： 19-28. [朱馨妮， 汪珊珊， 周佳琴， 等， 2017. 植物核苷二磷酸激酶研究進展 [J]. 生物技術通報， 33（11）：19-28.]

ZRENNER R， STITT M， SONNEWALD U， et al.， 2006. Pyrimidine and purinebiosynthesis and degradation in plants [J]. Ann Rev Plant Biol， 57 （1）： 805-836.

（責任編輯 周翠鳴）